五氨基乙酰丙酸對逆境下草地早熟禾萌發及生長的影響

林艷艷， 楊雪梅， 楊云貴

(西北農林科技大學動物科技學院， 陜西 楊凌712100)

草地早熟禾(Poapratensis)是常用的草坪草種，他具有根莖發達、分蘗能力極強、青綠期長等優良性狀，能迅速形成密而整齊的草坪，但其對鹽脅迫敏感[1]，所以目前對草地早熟禾的研究主要集中在鹽堿脅迫及水肥管理等方面[2]。

伴隨著工業化的發展，土壤重金屬污染程度日益加重，其中金屬鎘(Cd)污染不僅具有不可逆性、持久性，且毒性大，難降解，污染面積大[3-4]。根據2014年國家環保部門發布的《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，金屬Cd的污染位于無機污染物點位超標率之首。金屬Cd污染對農田及林地的影響受關注度較高，但對草坪的影響并未引起廣泛的重視，因此文章針對Cd污染對草地早熟禾的影響設計試驗。另外據聯合國教科文組織(UNESCO)和聯合國糧農組織(FAO)不完全統計[5]，全世界鹽漬土面積約為 9.543 8億 hm2，而鹽漬土地主要分布在世界各地的干旱、半干旱地區[6-7]，陜西省大部分地區均屬于干旱半干旱地區，降水量少，且水分蒸發量大。

五氨基乙酰丙酸(5-ALA)普遍存在于動、植物和微生物細胞內，是生物體內葉綠素、血紅素和維生素B12等物質合成前體[8]。但5-ALA的效果發揮程度很大程度取決于5-ALA的施用濃度、方式、時間及作物種類[9]。當低濃度的5-ALA作用于根后表現為減少作物根系對Na+、K+的吸收，促進對N、P、Mg及Fe等的吸收[10]。噴施適宜濃度的5-ALA能促進低溫脅迫下煙草(NicotianatabacumL.)可溶性糖和游離脯氨酸的積累,減緩葉綠素含量的下降,降低煙草葉片相對電導率和MDA含量，從而提高煙草植株的抗寒能力[11]。

綜上所述，本試驗探討了草地早熟禾生長在Cd，NaCl和PEG脅迫的環境中時，外源噴施5-ALA對草地早熟禾生長產生的影響，最終提供一種保護草地早熟禾草坪的科學方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗采用草地早熟禾‘午夜’品種為材料，種子2015年10月購于江蘇沭陽縣卓天花卉園藝場。

1.2 試驗方法

用0.5%的NaClO溶液泡種子10 min進行消毒[12]，浸泡后用自來水反復沖洗數次，再用蒸餾水清洗3次。

晾干后，將種子放在以雙層濾紙為發芽床的培養皿內，皿內事先分別加蒸餾水(無脅迫)、100 mmol·L-1的NaCl、2 mg·L-1的Cd及15%PEG逆境處理液5 mL，每種處理液內分別添加不同濃度的5-ALA(0，5，25，50，100 mg·L-1)。每皿內放置100粒種子，每個處理3次重復，放入恒溫光照培養箱中發芽，培養條件：溫度為晝夜25℃，光照8 h，每天稱重補水，每隔3天更換1次濾紙及逆境處理溶液。每天觀察發芽情況，記錄發芽種子的數量，連續觀察萌發情況到不再變化為止。

1.3 試驗測定指標

可溶性蛋白的測定：待14天發芽試驗結束后，第16天稱取幼苗0.02 g，放入預冷的研缽中，加入少量石英砂及1 mL蒸餾水研磨充分，并用2 mL蒸餾水將研缽洗凈合并提取液轉入離心管中，于5 000 g轉速下離心10 min，之后取上清液0.1 mL，加入0.9 mL蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍G-250試劑，混勻，放置2 min在595 nm波長下比色，記錄吸光值，根據方程計算可溶性蛋白含量[13]。用Synergy HT多功能酶標儀測定吸光值，具體操作為，從每個待測混合液中用移液槍抽取200 μL，加入到96孔酶標板中，然后放入酶標儀中測定。

樣品中可溶性蛋白質的含量(μg·g-1FW)=C*Vt·FW-1*Vs-1

式中，C：查標準曲線值(μg)；Vt：提取液總體積；Vs：測定時加樣量(mL)；FW：樣品鮮重(g)。

每天記錄各培養皿的發芽狀況，直到第14天結束發芽試驗，在發芽結束后從各培養皿中隨機選取10株幼苗測定根長和芽長，并計算發芽勢(%)、發芽率(%)、芽長、根長、芽促進率(%)、根促進率(%)。

發芽率=n14/M×100%

發芽勢=n7/M×100%

芽促進率=(處理芽長-對照芽長)/對照芽長×100%

根促進率=(處理根長-對照根長)/對照根長×100%

公式中，n7,n14分別為發芽第7天和第14天的發芽種子數，M為供試種子總數(100粒)。

1.4 數據分析

采用Excel 2010進行數據統計處理和制圖；采用SPSS 17.0進行單因素方差分析(ANOVA)，研究同一脅迫下不同濃度5-ALA對草地早熟禾種子萌發及幼苗生長之間的差異關系，用Duncan’s進行多重比較。

2 結果分析

2.1 不同濃度5-ALA對逆境脅迫下草地早熟禾種子萌發的影響

由圖1、圖2可知，5，25 mg·L-1的5-ALA對不同脅迫下早熟禾的發芽勢和發芽率大致呈促進趨勢，而50，100 mg·L-1的5-ALA對發芽率發芽勢呈抑制狀態或差異不顯著。當無脅迫(H2O)存在時0，5，25 mg·L-1的5-ALA對發芽勢(66%，70.7%，68%)發芽率(81.7%，79.3%，85.7%)的效應不存在顯著差異，而50，100 mg·L-1的5-ALA顯著(P<0.05)抑制發芽勢(42. 7%，70%)和發芽率(13. 7%，54%)。2 mg·L-1的Cd脅迫下，5，25 mg·L-15-ALA顯著(P<0.05)提高了種子的發芽勢和發芽率；當5-ALA濃度為 50 mg·L-1時對發芽勢有顯著(P<0.05)抑制作用，發芽勢降到23.3%，而對發芽率有顯著(P<0.05)促進作用；當5-ALA濃度為100 mg·L-1時對發芽勢亦有顯著(P<0.05)抑制作用，而對發芽率的影響和組內對照相比差異不顯著。

100 mmol·L-1的NaCl脅迫下，添加5，25，50 mg·L-1的5-ALA與對照相比均顯著(P<0.05)提高了種子發芽勢、發芽率，此3種濃度的5-ALA作用效果之間差異不顯著，但50 mg·L-1的5-ALA促進作用高于5，25 mg·L-1；當5-ALA濃度達到100 mg·L-1時，無論對發芽勢還是發芽率與組內對照相比均不存在顯著差異。15%PEG脅迫下，5，50，100 mg·L-1的5-ALA對發芽勢的影響不存在顯著差異；而當5-ALA 濃度為25 mg·L-1時發芽勢顯著(P<0.05)提高到33%，比對照提高16.3%，但對發芽率無明顯作用。

圖1 不同脅迫處理下5-ALA對草地早熟禾種子發芽勢的影響Fig.1 Effects of 5-ALA on germination energy of Poa pratensis under different stress treatments

圖2 不同脅迫處理下5-ALA對草地早熟禾種子發芽率的影響Fig.2 Effects of 5-ALA on germination rate of Poa pratensis under different stress treatments

2.2 不同濃度5-ALA對逆境脅迫下草地早熟禾幼苗芽長、根長的影響

通過比較不同濃度5-ALA對不同脅迫下種子萌發狀況的影響可以發現，在無脅迫時，5 mg·L-1的5-ALA對芽長的促進作用不顯著；25 mg·L-1的5-ALA能顯著促進幼苗芽的生長(P<0.05)，其芽長比對照長0.43 cm；而50，100 mg·L-1的5-ALA對芽長有顯著抑制效應(P<0.05)，其中100 mg·L-1的抑制作用強，其芽長比對照短1.31 cm。在2 mg·L-1Cd脅迫下，未添加5-ALA的一組芽長(1.92cm)顯著比無脅迫條件下芽長(0.71 cm)短；當添加了5，25，50 mg·L-15-ALA后Cd對芽長的抑制作用顯著(P<0.05)得到緩解，其中25 mg·L-1的緩解作用最強，芽長可達到2.01 cm。100 mmol·L-1的NaCl脅迫下芽長的變化與Cd相似(圖3)。

15%PEG脅迫下，添加5，25 mg·L-15-ALA均能顯著(P<0.05)增加芽長(2.08 cm，2.20 cm)，二者的作用效果無顯著差異；50 mg·L-15-ALA對芽長的作用效果不顯著；當濃度達到100 mg·L-1時芽的生長被顯著(P<0.05)抑制，其長度為0.90 cm(圖3)。

圖3 不同脅迫處理下5-ALA對草地早熟禾幼苗芽長的影響Fig.3 Effects of 5-ALA on bud length of Poa pratensis seedling under different stress treatments

由圖4可知，無脅迫存在時添加5 mg·L-15-ALA后的根長(1.71 cm)與對照(1.65 cm)相比促進作用不顯著；當濃度增加到25 mg·L-1時，5-ALA顯著促(P<0.05)進了根的生長，根長為1.91 cm；隨著濃度的繼續增加，50，100 mg·L-1時對根的生長起到顯著的抑制作用(0.34 cm，0.29 cm)。在2 mg·L-1Cd脅迫下，不施加五氨基乙酰丙酸時早熟禾的根生長被顯著抑制，施加5，25 mg·L-15-ALA時，這種抑制作用被顯著緩解，根的長度分別比對照增加(0.73 cm，0.67 cm)，而施加50，100 mg·L-1的5-ALA時，不但對根的生長沒有緩解作用，反而抑制了根的伸長。

在100 mmol·L-1的NaCl脅迫下，施加5，25，50 mg·L-1的5-ALA與組內對照相比均未能顯著促進根的生長，其中濃度為5，25 mg·L-1時，雖有提高根的伸長效應，但效果不顯著，濃度為50 mg·L-1抑制作用亦不顯著；當濃度增加到100 mg·L-1時對根長(0.17 cm)的抑制作用變得顯著。在15%PEG脅迫下，0，5，25，50，100 mg·L-1的5-ALA每一組之間對根長的影響均存在顯著(P<0.05)差異；其中未添加5-ALA組平均根長比無脅迫存在下未添加5-ALA組平均根長增加0.82 cm，添加5 mg·L-1的5-ALA后，根長達到2.84 cm，顯著高于組內對照；當5-ALA濃度為25，50，100 mg·L-1時根長的徒增效應被顯著抑制。

圖4 不同脅迫處理下5-ALA對草地早熟禾幼苗根長的影響Fig.4 Effects of 5-ALA on root length of Poa pratensis seedling under different stress treatments

2.3 不同濃度5-ALA對逆境脅迫下草地早熟禾幼苗根、芽促進率的影響

通過分析根促進率及芽促進率，可以更進一步了解5-ALA對不同脅迫下幼苗生長的緩解作用。從圖5可以看出，在無脅迫及Cd和NaCl的脅迫下，5，25 mg·L-1的5-ALA對根的生長均有促進作用，而50，100 mg·L-1的5-ALA對根的生長具有抑制作用；其中在無脅迫存在時5，25 mg·L-1的5-ALA對根的促進率分別為6%，15%，50，100 mg·L-1的5-ALA對根的抑制率分別為80%和83%，二者之間差異不顯著。當存在Cd脅迫時，添加較低濃度的5-ALA能顯著降低脅迫對根的抑制作用，當濃度升到50，100 mg·L-1時，這種抑制作用不能得到改善。在NaCl脅迫下5，25 mg·L-1的5-ALA對根的促進作用不存在顯著差異，而100 mg·L-1時的抑制作用顯著(P<0.05)強于50 mg·L-1。PEG脅迫下，只有5 mg·L-1的5-ALA對根的生長有促進作用，且顯著高于其他濃度。

圖5 不同脅迫處理下5-ALA對草地早熟禾幼苗的根促進率的影響 Fig.5 Effects of 5-ALA on inhibition rate of root length of Poa pratensis seedling under different stress treatments

而對比芽促進率(圖6)可知，無論在哪種脅迫下,4個濃度的5-ALA對芽促進率的趨勢是一致的，其中25 mg·L-1時的促進作用最強。當無脅迫時濃度為50，100 mg·L-1的5-ALA對芽起抑制作用；當存在Cd及PEG脅迫時，只有100 mg·L-1的5-ALA對芽的生長起顯著(P<0.05)，而其他3種濃度的5-ALA均能在一定程度上緩解脅迫的抑制作用；而對于NaCl脅迫下的芽生長情況來說，4中濃度的5-ALA均能有效緩解干旱脅迫對芽生長的抑制作用。

圖6 不同脅迫處理下5-ALA對草地早熟禾幼苗芽促進率的影響 Fig.6 Effects of 5-ALA on inhibition rate of bud length of Poa pratensis Poa seedling under different stress treatments

2.4 不同濃度5-ALA對逆境脅迫下草地早熟禾幼苗可溶性蛋白的影響

可溶性蛋白含量在不同脅迫下呈現的趨勢不一致，無脅迫時添加25 mg·L-15-ALA后,可溶性蛋白的含量顯著降低(P<0.05)，與對照相比下降了5.6 μg·g-1，而添加其他濃度的5-ALA對可溶性蛋白含量沒有顯著影響。在Cd脅迫下，添加4種濃度的5-ALA后,可溶性蛋白含量均比對照升高，5-ALA濃度為100 mg·L-1時可溶性蛋白含量為487 μg·g-1，顯著高于對照(P<0.05)。NaCl脅迫下可溶蛋白含量的變化趨勢也呈現出均比對照高，添加5，25和100 mg·L-1的5-ALA后含量顯著高于對照(P<0.05)。而PEG脅迫下可溶性蛋白含量呈先降再升再降的趨勢，添加25 mg·L-1的5-ALA后可溶性蛋白含量顯著上升，添加100 mg·L-1的 5-ALA后可溶性蛋白含量顯著降低(P<0.05)。

表1 不同脅迫處理下5-ALA對草地早熟禾幼苗可溶性蛋白含量的影響/μg·g-1Table 1 Effects of 5-ALA on soluble protein of Poa pretensis seedling under different stress treatments

3 討論

五氨基乙酰丙酸(5-ALA)很早就受到研究者的重視[14]。他具有調節植物生長發育的功能，被視為一種新的植物生長調節物質，5-ALA在高濃度下作為無污染的天然除草劑，在低濃度下可明顯增強多種植物的抗逆性[15]。所以5-ALA在當今生態環境嚴重惡化背景下，對提高作物生產水平具有重要的現實意義。本試驗研究了金屬脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫及無脅迫條件下，添加外源5-ALA對草地早熟禾幼苗產生的影響。

3.1 不同濃度5-ALA對逆境脅迫下草地早熟禾萌發的影響

外源添加較低濃度(5，25 mg·L-1)的5-ALA當無脅迫條件存在時，能提高幼苗的發芽勢及發芽率，但效應不顯著；當施加5-ALA的濃度逐漸升高(50，100 mg·L-1)時，顯著抑制了種子的發芽勢及發芽率，且濃度越高抑制作用越強，同時表現出發芽勢弱于發芽率，導致發芽不整齊，幼苗苗弱的較多。而當重金屬、鹽及干旱脅迫存在時，隨著5-ALA濃度從低到高發芽勢及發芽率呈先增后降的趨勢，表現出低濃度促進高濃度抑制(或效應不顯著)，其中5-ALA的濃度為25 mg·L-1時表現出的緩解作用最好(鹽脅迫下50 mg·L-1時表現的促進作用最優)，試驗結果與李小玲等[16]研究外源ALA對鹽脅迫下商洛黃芩生理特性的影響時得出的一定濃度5-ALA能提高植物抗逆性結果一致，同時印證了劉暉等[17]提出的5-ALA濃度不宜過高的結論。

3.2 不同濃度5-ALA對逆境脅迫下草地早熟禾幼苗的影響

試驗結果顯示，隨著5-ALA濃度的增加，幼苗的根長、芽長呈現出先上升后下降的趨勢，且5-ALA濃度越高對根及芽的抑制作用越強，其中25 mg·L-1的5-ALA表現出的促進作用最好。羅家傳等[18]研究ALA在小麥上的生產應用效果試驗發現，小麥株高隨5-ALA劑量增加呈先增后減趨勢，與本試驗結果一致。

Cd不是植物生長必須的微量元素，其存在會對植物產生毒害[19-20]，試驗中未添加5-ALA的對照組草地早熟禾的幼苗變矮、根系變短，導致幼苗的活力下降。添加了較低濃度的5-ALA后，Cd對早熟禾的毒害作用明顯得到緩解，俞建良等[21]表明低濃度ALA具有促進作物應對各種惡劣生長條件(如鹽堿、低溫、弱光照和干旱等)的作用，但并未提到對重金屬脅迫下植物的保護作用，本試驗進一步證明了5-ALA提高植物應對各種逆境的能力，且與5-ALA的濃度緊密相關。

5-ALA對于鹽脅迫及干旱脅迫植物的保護作用的相關研究較多，劉暉等人[18]發現，125 mmol·L-1NaCl處理下添加15～30 mg·L-1ALA可以明顯緩解鹽脅迫對西瓜種子萌發和幼苗生長的抑制效應；外源ALA可減輕鹽脅迫對菠菜生長的抑制作用[22]。張春平等[23]研究外源5-ALA對干旱脅迫下甘草種子萌發及幼苗生理特性的影響時發現，經過5，10，15，30 mg·L-1的5-ALA處理后幼苗的胚根、胚芽均比對照長，但較高濃度(30 mg·L-1)處理效果不如低濃度，這與本試驗結果相同；另外張春平等[23]劉長利[24]等的研究發現，干旱脅迫下胚芽生長受到的抑制作用程度大于胚根，這與本試驗結果一致。

3.3 不同濃度5-ALA對逆境脅迫下草地早熟禾幼苗可溶性蛋白含量的影響

脅迫條件下植物積累蛋白是一種適應機制，這些蛋白不僅與調控膜的透水性有關[25]，在一定程度上還代表著植物體光合性能[26]。本試驗中，Cd及NaCl處理下添加5-ALA均能導致早熟禾幼苗中可溶性蛋白含量顯著升高，其中Cd脅迫下只有100 mg·L-1的5-ALA處理下可溶性蛋白含量顯著(P<0.05)高于對照。在PEG模擬的干旱脅迫下，25，50 mg·L-1的5-ALA可提高幼苗的可溶性蛋白，且25 mg·L-1時提高效果顯著(P<0.05)，但100 mg·L-1時可溶性蛋白含量顯著低于對照(P<0.05)。這表明合理濃度的外源5-ALA可促進脅迫下早熟禾植株蛋白合成，維持植株的水分運輸和葉片光合功能，從而促進植株生長并提高抗逆性。

4 結論

不同脅迫(2 mg·L-1Cd，100 mmol·L-1NaCl，15%PEG)下，外源施加相對低濃度(5，25 mg·L-1)5-ALA均能起到緩解脅迫傷害效應，而濃度逐漸升高后(50，100 mg·L-1)則起到抑制作用。具體表現為促進早熟禾種子萌發、幼苗生長和可溶性蛋白積累，其中對種子萌發及幼苗的生長作用顯著，對可溶性蛋白含量的影響在不同脅迫下表現不盡相同。

綜合比較4種不同濃度5-ALA對草地早熟禾萌發的作用后發現，3種脅迫處理下，以25 mg·L-1的5-ALA抗脅迫效果最優。