暖季型草坪草狗牙根對酸鋁脅迫的生理響應

黃春瓊， 陳 振， 劉國道， 白昌軍

(中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所/農業部華南作物基因資源與種質創制重點實驗室， 海南 儋州 571737)

土壤酸化影響著全球30%～40%可耕地的作物生產，全世界約有40%的可耕地屬酸性土壤。在中國，酸性土壤的分布遍及14個省區，總面積達203萬hm2，約占全國耕地面積的21%，主要集中在南方地區[1]。鋁毒害被認為是酸性土壤中限制植物生長發育的主要因素[2]。鋁在土壤溶液中的形態隨pH值的變化而有所不同：一般來說，當土壤pH值高于5.5時，鋁被磷酸等化合物結合或被土壤膠體吸附，水溶性鋁很少；而當土壤pH低于5.5時，原來在土壤中以難溶性的硅酸鹽或氧化鋁形式存在的鋁逐漸解離，將不同形態的鋁離子釋放到土壤溶液中，直接危害植物生長和發育，降低酸性土壤中的農作物產量。隨著工業化的發展，酸雨沉降頻繁，酸性肥料投入增多，加劇了土壤的酸化，使得鋁對植物的毒害日益嚴重[3]。在世界很多地區，尤其是中國華南熱帶地區，土壤酸化是草坪建植養護及牧草生產過程中的一個重要問題。

已有很多研究報道了植物的耐鋁機理，關于草類植物的耐鋁機制報道較少。Rengel[4]發現一年生黑麥草(Loliummultiforum)不同基因型對鋁的敏感性與根系陽離子交換量呈顯著負相關，低陽離子交換量的基因型能選擇排斥 Al3+，減少 Al 在根系交換位點上的結合，特別是細胞壁的果膠上，從而減輕鋁對根系的傷害。Wenzl等[5-6]對臂形草(Brachiariaeruciformis)的耐鋁機理進行了研究。他們認為臂形草的耐鋁性主要和其在酸性土壤里獲得營養元素(N、P、Ca)的能力有關，并發現臂形草的根尖受到鋁脅迫時內部積累有機酸而不是分泌有機酸。植物遭受某種環境的脅迫時體內自由基會增多，當自由基的濃度超過了一定的閥值，會導致蛋白質、核酸、多糖和膜脂分子的氧化破壞，從而破壞細胞內的代謝活動。在作物抗性機理研究中，過氧化物酶(Peroxidase，POD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)等酶活性的變化己廣泛作為指示植物抵御逆境傷害的指標。鋁脅迫能誘導多種植物體內產生大量的活性氧相關酶類活性的表達，使細胞膜脂、核酸和蛋白質等生物分子過氧化而受損害，從而破壞細胞內的代謝活動。如大麥(Hordeumvulgare)[7-8]、大豆(Glycinemax)[9]和水稻(Oryzasativa)[10]等都有相關報道。抗氧化酶類(Ascorbic acid peroxidase，APX)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)等的表達提高能緩解鋁對植物的毒害[11-12]，且不同植物在遭受鋁脅迫時相應的活性氧清除系統不盡相同[13-14]。因此，鋁誘導的氧化脅迫及相關抗氧化酶活性的變化是鋁毒的一個重要特征。

狗牙根(Cynodondactylon)是禾本科狗牙根屬的多年生植物，主要生長于溫暖濕潤的熱帶及亞熱帶地區。廣泛分布在我國長江流域以南的地區，該草種耐干旱、耐踐踏、繁殖能力及再生能力強，被廣泛應用于公路護坡、庭院綠化、足球場、高爾夫球場等各種草坪用草，并成為世界三大暖季型坪草中最重要的草種之一[15-16]。本研究以前期研究篩選出的5份耐鋁狗牙根種質和5份鋁敏感狗牙根種質為材料，研究其在酸性土壤上的生理響應情況，對培育狗牙根耐酸鋁品種具有重要的理論和應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

前期利用水培法對65份狗牙根進行鋁脅迫處理，通過測定地上部及根系干重對其耐鋁性進行綜合評價，從中篩選出5份耐鋁種質和5份鋁敏感種質。本研究以這5份耐鋁種質和5份鋁敏感種質為研究材料，其來源及耐鋁評價結果如表1所示。

表1 供試狗牙根材料來源及前期耐鋁評價結果Table 1 The collection site and the results of culture solution evaluation from the previous expriment of Cynodon dactylon

1.2 試驗方法

1.2.1處理方法 試驗土壤為花崗巖發育的磚紅壤土，試驗前土壤養分含量為：pH 4.6，有機質1.73%，全氮0.48 g·kg-1，全磷0.13 g·kg-1，全鉀1.22 g·kg-1，堿解氮83.83 mg·kg-1，速效磷19.12 mg·kg-1，速效鉀51.23 mg·kg-1，交換性鋁12.3 cmol·kg-1。將風干土壤裝入直徑14 cm、高16 cm的塑料花盆中，每盆3.5 Kg土壤。對照用石灰調土壤pH值為5.8，石灰用量為3.8 g·kg-1，取帶有一個芽的大小一致的匍匐莖段插入花盆中，每盆20個，每份種質對照(施石灰調pH值為5.8)和處理(不施石灰)各種3盆，一周后根據生長情況，每盆留苗10株，再過28 d 后結束試驗，試驗期間視天氣情況用蒸餾水等量澆灌。

1.2.2測定項目 生長28天后，從狗牙根頂端向下取第2、3片完全展開葉進行生理指標測定。測定項目包括葉綠素、電導率、丙二醛、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、游離脯氨酸和可溶性總糖含量。葉綠素測定采用丙酮乙醇混合液法；電導率采用電導法[17]；丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸比色法；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創木酚比色法[18]，酶活性以每分鐘內每克鮮重材料的吸光度值變化△A470表示；超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用NBT法[19]，SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活力單位；游離脯氨酸(Pro)含量的測定采用磺基水楊酸法[17]，于分光光度計520 nm波長處測定吸光度值，查標準曲線，得出脯氨酸濃度；可溶性總糖含量采用強酸可使糖類脫水生成糖醛，其與蒽酮脫水縮合形成糖醛衍生物，呈現藍綠色，在620 nm處有最大吸收，在10～100 μg范圍內其顏色深淺與可溶性總糖含量成正比這一原理來測定。

1.2.3綜合評價 綜合評價采用隸屬函數法進行評價。Fi=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)，式中，Fi為第i個材料該性狀的隸屬函數值。Xij為第i個材料第j個性狀的平均值，Xmax和Xmin分別為該性狀的最大值和最小值。如果某一指標與綜合質量成負相關，則利用反隸屬函數進行轉換，計算公式為：Fi=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)，最后按材料將各性狀的隸屬函數值進行平均，得各材料的平均隸屬函數值。

1.2.4數據分析 采用Microsoft office Excel 2007計算葉綠素、電導率、丙二醛、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、游離脯氨酸和可溶性總糖含量并生成柱狀圖，用SAS9.0軟件對各指標進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 酸鋁脅迫對狗牙根葉綠素含量的影響

如圖1所示，對同一處理不同種質進行方差分析，在酸鋁脅迫處理下，對照間(F=13.43，Pr>F<0.0001)和處理間(F=8.57，Pr>F<0.0001)不同種質差異均達到極顯著。與對照相比，狗牙根耐鋁種質和鋁敏感種質的葉綠素含量都有不同程度的降低，其中鋁敏感種質A538和A172降低稍為明顯，分別降低了29.69%和22.86%；耐鋁種質A22和A84分別降低了9.58%和11.83%。

圖1 酸鋁脅迫對狗牙根葉綠素含量的影響Fig.1 The effect of acidity and aluminum stress on the total chlorophyll content of Cynodon dactylon accessions

2.2 酸鋁脅迫對狗牙根相對電導率的影響

如圖2所示，對同一處理不同種質間進行方差分析，在酸鋁脅迫處理下，對照間(F=0.11，Pr>F=0.9992)和處理間(F=0.25，Pr>F=0.9817)不同種質差異均不顯著。但與對照相比，狗牙根耐鋁及鋁敏感種質的電導率都有不同程度的增加。鋁敏感種質相對電導率增加的幅度略高于耐鋁種質，其中鋁敏感種質A172，A137和A256分別增加了10.51%，16.93%和17.72%；耐鋁種質A556，A551和A84分別增加了2.85%，6.81%和3.81%。

圖2 酸鋁脅迫對狗牙根相對電導率的影響Fig.2 The effect of acidity and aluminum stress on the relative electrical conductivity of Cynodon dactylon accessions

2.3 酸鋁脅迫對狗牙根丙二醛含量的影響

如圖3所示，對同一處理不同種質間進行方差分析，在酸鋁脅迫處理條件下，對照間(F=1.22，Pr>F=0.3370)和處理間(F=1.91，Pr>F=0.1103)不同種質差異均不顯著。但與對照相比，不同狗牙根種質的丙二醛含量均有不同程度增加，鋁敏感種質增加較為明顯，其中A172，A137，A256和A326分別增加了45.20%，56.62%，53.47%和52.30%；耐鋁種質A551，A22和A84分別增加了15.38%，22.13%和1.77%。

圖3 酸鋁脅迫對狗牙根丙二醛含量的影響Fig.3 The effect of acidity and aluminum stress on the MDA content of Cynodon dactylon accessions

2.4 酸鋁脅迫對狗牙根游離脯氨酸含量的影響

如圖4所示，對同一處理不同種質間進行方差分析，在酸鋁脅迫處理下，對照間(F=1.13，Pr>F=0.3855)和處理間(F=0.64，Pr>F=0.7474)不同種質差異均不顯著。但與對照相比，耐鋁種質和鋁敏感種質的游離脯氨酸含量均發生不同程度的增加，兩種類型狗牙根種質增加幅度都比較輕微，耐鋁種質A556，A22和A84分別增加了1.22%，4.43%和1.80%；鋁敏感種質A538，A137和A326分別增加了0.08%，0.69%和0.63%。

圖4 酸鋁脅迫對狗牙根游離脯氨酸含量的影響Fig.4 The effect of acidity and aluminum stress on the proline content of Cynodon dactylon accessions

2.5 酸鋁脅迫對狗牙根過氧化物酶活性的影響

如圖5所示，對同一處理不同種質間進行方差分析，在酸鋁脅迫處理下，對照間(F=6.76，Pr>F=0.0002)差異極顯著，處理間(F=2.49，Pr>F<0.0432)差異顯著。與對照相比，酸鋁脅迫下不同狗牙根種質的POD含量均上升，但耐鋁種質增加的幅度略高于鋁敏感種質，其中耐鋁種質A75，A22和A84分別增加了31.47%，22.44%和31.95%，鋁敏感種質 A538，A256和A326分別增加了21.24%，16.17%和0.51%。

圖5 酸鋁脅迫對狗牙根過氧化物酶(POD) 活性的影響Fig.5 The effect of acidity and aluminum stress on the POD activity of Cynodon dactylon accessions

2.6 酸鋁脅迫對狗牙根超氧化物歧化酶活性的影響

如圖6所示，對同一處理不同種質間進行方差分析，在酸鋁脅迫處理下，對照間(F=6.06，Pr>F=0.0004)和處理間(F=7.85，Pr>F<0.0001)差異均呈極顯著。與對照相比，不同狗牙根種質在鋁脅迫處理下超氧化物歧化酶活性都有所增加，但耐鋁種質增加較為明顯，其中A75，A556，A551和A22分別增加了35.75%，31.32%，39.65%和31.43%；鋁敏感種質增加幅度相對較小，其中A172，A137和A256分別增加了4.12%，5.57%和22.84%。

圖6 酸鋁脅迫對狗牙根超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響Fig.6 The effect of acidity and aluminum stress on the SOD activity of Cynodon dactylon accessions

2.7 酸鋁脅迫對不同狗牙根可溶性總糖含量的影響

由圖7可知，在酸鋁脅迫處理下，對照間(F=28.76，Pr>F==0.0001)差異極顯著，處理間(F=3.11，Pr>F=0.0165)差異顯著。與對照相比，狗牙根耐鋁及鋁敏感種質的可溶性總糖含量都有所降低，但鋁敏感種質降低較為明顯，其中鋁敏感種質A538，A172和A256分別降低了27.41%，15.56%，24.71%；耐鋁種質A556，A22和A84分別降低了18.91%，14.29%和8.71%。

圖7 酸鋁脅迫對不同狗牙根可溶性總糖含量的影響Fig.7 The effect of acidity and aluminum stress on the soluble sugar content of Cynodon dactylon accessions

2.8 各指標綜合評價

植物的耐鋁性是一個復合性狀，難以用單一指標進行評價。隸屬函數分析法提供了一條在多指標測定基礎上對材料特性進行綜合評價的途徑，可以克服僅少數指標進行評價的不足，使結果更客觀、準確。因此，選取狗牙根的葉綠素、電導率、丙二醛、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、游離脯氨酸和可溶性總糖作為分析指標，計算出各指標的隸屬函數值，進行綜合評價，其中只有電導率和丙二醛為反隸屬函數，其他均為正隸屬函數。隸屬函數均值越大，說明其綜合評價越高。綜合評價結果如表2所示，結果表明：A75的平均隸屬函數值(0.7483)最大，表明其耐鋁性最強，其次為A22、A556，耐鋁性較強。耐鋁性最差的是A326。

表2 鋁脅迫下10份狗牙根種質各指標的隸屬函數值Table 2 The average of membership function of 10 Cynodon dactylon accessions on aluminum soil stress

3 討論與結論

正常情況下，植株可以通過多條途徑不斷產生超氧陰離子自由基、羥自由基和過氧化氫等活性氧類(reactive oxygen species，ROS)物質，這些ROS物質的產生和清除處于動態平衡狀態，而逆境脅迫會打破植物體內的動態平衡，過量積累活性氧物質，導致細胞膜脂過氧化反應，影響植株的正常發育[20]。

大量研究表明鋁在引起氧化脅迫的同時也可以刺激ROS有關的酶活性提高，肖祥希等[24]研究發現鋁脅迫使龍眼(Euphorialongan)葉片中SOD、POD、CAT等活性升高；楊野等[25]也發現鋁脅迫提高了不同種類小麥(Triticumaestivuml)活性氧代謝活性；武孔煥等[26]研究發現，與酸敏感型的黑大豆(Glycinemax)相比，耐酸型黑大豆在鋁脅迫條件下具有較強的保護酶活性，其膜脂受氧化作用損傷的程度較低，從而表現出更強的耐鋁脅迫能力。本研究結果顯示，鋁脅迫28 d 后狗牙根耐鋁種質與鋁敏感種質體內的MDA含量上升了，表明鋁毒引起狗牙根體內產生氧化脅迫，誘使體內活性氧水平上升，膜脂發生過氧化，但耐鋁種質受到的影響明顯小于鋁敏感種質，同時狗牙根耐鋁種質SOD、POD活性的上升幅度略高于鋁敏感種質，SOD、POD是植物體內清除活性氧的主要保護酶，在抵抗脅迫中承擔重要作用。由此可以說明在鋁脅迫下，狗牙根耐鋁性種質體內的某些基因的表達，促使其抗氧化物酶活性升高，清除較多的活性氧，使其免受氧化脅迫或者降低受害程度。