耐低鉀山羊草基因型的篩選與鑒定

張正社， 牛 娜， 宋瑜龍， 馬守才， 張改生， 王軍衛(wèi)*

(1. 西北農林科技大學農學院 國家楊凌農業(yè)生物技術育種中心/國家小麥改良中心楊凌分中心/小麥育種教育部 工程研究中心/陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點實驗室， 陜西 楊凌 712100；2. 旱區(qū)作物逆境生物學國家重點 實驗室， 陜西 楊凌 712100；3. 草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 蘭州大學草地農業(yè)科技學院， 甘肅 蘭州 730020)

我國土壤全鉀含量在0.05%～2.5%之間，呈由南向北降低趨勢，鉀元素的虧缺是一個全國性的嚴重問題[1]。目前我國耕地有30%以上表現為缺鉀(有效鉀含量小于50 mg·kg-1)甚至嚴重缺鉀，土壤供鉀不足已嚴重影響著農作物的生產[2]。相關調查顯示，目前我國耕地土壤速效鉀含量依然在逐年減少，年減少量已達到0.58～3.32 mg·kg-1。雖然農業(yè)生產上每年都會施入大量的鉀肥，但是鉀元素的當季利用率較低，僅有20%～60%，加之我國又是鉀礦資源缺乏的國家[3]。因此，發(fā)掘優(yōu)良的種質資源，培育耐低鉀品種，已成為眾多研究者亟需解決的問題。

鉀作為植物生長發(fā)育的必要元素，參與植物體內60多種酶的活化，對于提高作物產量、改善作物品質、增強作物的抗逆性起著非常重要的作用[4-6]。有關基因型耐低鉀指標的篩選及鑒定的研究在國外開展較早[7]，國內起步較晚，且多集中于水稻(Oryzasativa)[8-9]、玉米(Zeamays)[10]、甘薯(Ipomoeabatatas)[1]、棉花(Gossypiumspp)[11]、大麥(Hordeumvulgare)[12]、小麥(Triticumaestivum)[13]等作物，而有關山羊草(Aegilops)的研究目前尚未見報道。山羊草是小麥的近緣屬植物，在生物進化過程中，山羊草不但適應了各種逆境條件，而且還保留了許多優(yōu)良的抗逆特性，因此，被廣泛應用為遠緣雜交育種的試驗材料[14]。

本研究以小麥的近緣種山羊草為試驗材料，采用水培方法研究低鉀條件下不同山羊草種質苗期的生長發(fā)育及鉀營養(yǎng)特性，基于多項指標計算隸屬函數值，綜合評價供試山羊草種質的耐低鉀脅迫特性，篩選和鑒定耐低鉀基因型，為進一步研究山羊草的耐低鉀分子機制，以及育種上利用耐低鉀山羊草種質提供了材料和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料為9個山羊草種質(表1)，由西北農林科技大學農學院小麥雜優(yōu)利用課題組提供。

表1 供試山羊草種質Table 1 Aegilops germplasm

1.2 試驗方法

1.2.1盆栽試驗 挑選籽粒均勻、飽滿的山羊草種子，首先用9%的雙氧水對種子進行30 min的消毒，然后用蒸餾水沖洗干凈，浸泡在培養(yǎng)皿中放入恒溫(21℃)培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至露白，等出芽后轉移至光照條件下，根據情況補充水分培養(yǎng)2天，挑選長勢均勻的幼苗移栽到80 mm×120 mm花盆中，1～2 mm石英砂做基質。移栽初期用蒸餾水澆苗，等幼苗長到三葉期使用Hoagland營養(yǎng)液(pH=6.0，表2)處理幼苗[11]。試驗設正常供鉀(2.0 mmol·L-1KCl)和低鉀(0.02 mmol·L-1KCl)兩個處理，每種山羊草種4盆，每盆5株，其中1盆作為對照，其余3盆為重復處理[11,13]。從第一次營養(yǎng)液處理開始計時，每2天澆一次營養(yǎng)液，連續(xù)處理40天。培養(yǎng)過程中觀察葉色、葉形等的變化，并進行拍照記錄。盆栽試驗于2014年3月-4月在西北農林科技大學農學院綜合樓實驗室進行，室溫保持在21℃，每天保持光照12小時。

表2 營養(yǎng)液配方Table 2 Nutrient solution formula

注：*正常鉀濃度為2.0 mmol·L-1，低鉀濃度為0.02 mmol·L-1
Note: *Normal potassium level was 2.0 mmol·L-1KCl, low potassium level was 0.02 mmol·L-1KCl

1.2.2測定指標及方法 在山羊草的六葉期，對植株進行收獲，地上部和根部分開，分別裝入紙袋中。置于烘箱內進行105℃殺青30 min。80℃下烘干8 h，稱重，再烘干2 h 稱重，兩次重量差異在1% 內即可。否則再進行烘烤。

測定指標：根長、地上部長、根冠比、根干重、地上部干重、含鉀量、鉀積累量、鉀利用效率。鉀利用效率 = 全株干重/全株鉀積累量，鉀積累量 = 植株干重×植株含鉀量[15]。

含鉀量用火焰分光光度計測定[16]。采用濃H2SO4-H2O2消煮法制備待測液，并利用原子吸收光譜儀(由西北農林科技大學水土保持研究所提供)測定鉀離子含量。鉀含量的計算方法[17]：K/% = (c×V×ts× 10-4)·m-1

式中，c：從標準曲線查得顯色液鉀離子的質量濃度(mg·L-1)；V：顯色液體積(mL)；ts：分取倍數；m：烘干樣品質量(g)。

1.2.3數據分析 為消除不同種質個體間的差異，不同種類山羊草間的相互比較用相對值(相對性狀值=低鉀狀態(tài)下性狀值/正常供鉀狀態(tài)下同一性狀值)，同一種山羊草的不同處理比較用絕對值(實際測量值)。

用Excel軟件對數據進行處理，利用SPSS軟件對處理后數據進行相關性分析、主成分分析[18]。并利用隸屬函數值對幾種山羊草的耐低鉀特性進行綜合評價[13,19-22]。運用公式如下：

U(Xj) = (Xj-Xmin)·(Xmax-Xmin)-1
j= 1, 2……n

(1)

Wj=Pj·(∑Pj)-1j= 1, 2 …… n

(2)

Di= ∑[U(Xj) ×Wj]i= 1, 2 …… k

(3)

隸屬函數值公式(1)中Xj表示第j個因子得分值，Xmin，Xmax分別表示第j個因子得分的最小值和最大值。

權重公式(2)中Wj表示第j個公因子在所有公因子中的重要程度，Pj為第j個公因子的貢獻率。

綜合評價公式(3)中Di為材料在低鉀條件下用綜合指標評價所得的耐低鉀特性綜合評價值，k為材料個數。

2 結果與分析

2.1 山羊草苗期表型觀察

在提供正常鉀素水平培養(yǎng)液的情況下，幼苗生長良好，莖稈粗壯、直立，葉色青綠，生長正常；在缺鉀條件下，僅有個別材料與對照差異不明顯外，其余材料同對照相比均表現出莖短細弱，葉色暗淡且沒有光澤，并出現倒伏(圖1)。其病狀首先出現在老葉上，表現為缺綠斑點，有些甚至呈燒焦狀，呈現出明顯的缺鉀癥狀。

2.2 山羊草苗期耐低鉀基因型篩選指標分析

確定有效地篩選指標對篩選山羊草鉀高效基因型至關重要，而基因型變異程度是衡量篩選指標是否適宜的重要依據，變異程度越大，說明該性狀指標越能代表基因型間的差異。如表3和表4所示，不同基因型山羊草(苗期)不同鉀素處理水平下，各性狀間表現出很大差異，在正常鉀處理條件下，變異系數較大的性狀是根長、根冠比、地上干重、鉀積累量和鉀利用效率，其最大值和最小值的倍數關系分別是4.67，3.19，47.84，78和2.33；在低鉀處理條件下，變異系數較大的性狀是根長、根冠比、地上干重、含鉀量、鉀積累量和鉀利用效率，其最大值和最小值的倍數關系分別是16.95，4.15，18.5，2.83，13.2和2.75。

圖1 9種山羊草在不同鉀水平下的苗期生長表現Fig.1 Growth performances of nine Aegilops genotype germplasms in the seedling stage under different potassium levels

表3 正常鉀處理下山羊草苗期各指標的變異Table 3 Variation of indexes in the seedling stage of Aegilops under normal potassium treatment setting

表4 低鉀處理下山羊草苗期各指標的變異Table 4 Variation of indexes in the seedling stage of Aegilops under low potassium treatment setting

為了消除基因型間自身生物學特性的差異，確定主要篩選指標，對變異系數較大的5個性狀指標在正常鉀處理和低鉀處理水平下的相對變化做進一步分析。結果如表5所示，變異系數的大小為相對地上干重(105%)>相對鉀積累量(104.64%)>相對鉀利用效率(37.11%)>相對根長(29.30%)>相對根冠比(28.80%)，這5個性狀變異系數均較大，說明他們對于不同山羊草基因型的耐低鉀的靈敏度較高，可以作為苗期鉀高效種質篩選的重要指標。

表5 不同鉀處理水平下山羊草苗期各指標的變異表現Table 5 Variation of indexes in the seedling stage of different potassium treatment setting

表6 低鉀條件下山羊草不同基因型各指標的相關系數矩陣Table 6 Correlation matrix of indexes of different Aegilops in low potassium treatment setting

2.3 山羊草苗期各生長指標的相關分析

將相對根冠比、相對根長、相對地上部干重、相對鉀積累量和相對鉀利用效率這5個指標進行相關分析(表6)，其中相對地上部干重與相對鉀積累量呈極顯著正相關(r= 0.875，N = 130，P<0.01)，與相對根冠比呈顯著正相關(r= 0.224，N = 130，P<0.05)，相對鉀積累量與相對鉀利用效率呈極顯著負相關(r= -0.321，N = 130，P<0.01)，相對根冠比與相對根長呈極顯著正相關(r= 0.773，N=130，P<0.01)，說明地上部干重隨鉀積累量增大而增大。

2.4 山羊草苗期生長指標的主成分分析

與對照相比，低鉀脅迫處理后的9種山羊草植株受到不同程度的影響。根據其相對指標(表5)，進行相關分析(表6)可以看出，9種山羊草的5個相對指標之間都存在一定的相關性，從而使得他們所提供的信息發(fā)生重疊，同時各指標在耐低鉀中所起的作用也不盡相同。所以直接利用這些單個指標進行耐低鉀評價具有片面性。

對9種山羊草的5個相對指標進行主成分分析，提取3個綜合指標(表7)，其貢獻率分別為41.34%，33.02%和20.53%，累積貢獻率達94.89%。第一主成分包括相對地上干重和相對鉀積累量；第二主成分包括相對根冠比和相對根長；第三主成分包括相對鉀利用率。這樣，把原來5個單項指標轉換為3個新的相互獨立的綜合指標。

表7 各綜合指標的系數及貢獻率Table 7 Coefficient of comprehensive indicates and proportion

2.5 不同種類山羊草耐低鉀基因型的鑒定結果

根據因子得分值，由公式(1)分別求出9種山羊草所有因子的隸屬函數值U(x)(表7)。再根據3個綜合指標貢獻率大小，由公式(2)分別求出各綜合指標的權重[19]。利用綜合指標評價公式(3)求出綜合評價值D。根據各綜合指標的指標系數及各單項指標的相對值，分別計算出每種山羊草的3個綜合指標的得分值C(x)(表8)。

綜合評價值(D值)反映了各材料耐低鉀能力的大小，數值越大，表明耐低鉀脅迫能力越強。結果顯示：雙角山羊草、偏凸山羊草、粗厚山羊草、擬斯卑爾托山羊草、尾狀山羊草、粘果山羊草、易變山羊草、歐山羊草、小傘山羊草的D值分別為0.383，0.898，0.327，0.516，0.007，0.682，0.338，0.346，0.655。由此可知，耐低鉀脅迫能力強弱順序為：偏凸山羊草>粘果山羊草>小傘山羊草>擬斯卑爾托山羊草>雙角山羊草>歐山羊草>易變山羊草>粗厚山羊草>尾狀山羊草。

表8 9種山羊草的公因子得分值C(x)、隸屬函數值U(x)、綜合評價值DTable 8 The values of component score C(x), subordinative function U(x) and comprehensive evaluation D of 9 different genotypes of Aegilops

3 討論

隸屬函數分析是一種在多指標測定的基礎上對材料進行綜合評價的方法，將其應用于植物耐低鉀種質的的篩選，更具科學性和可靠性。植物體是一個統(tǒng)一的有機體，所測的生理指標可能性質相同或相互關聯(lián)，如果使用單個指標來評價某種植物的耐低鉀性質則會對結果造成偏差。山羊草耐低鉀脅迫是一個復雜的、受多因素影響的數量性狀。不同山羊草的耐低鉀機制不盡相同，同時，不同山羊草對某一具體指標的耐低鉀性質反映也不盡相同，因此，單一指標難以準確全面的反映其耐低鉀性的強弱。本研究選用主成分分析法將原來個數較多的且彼此關系錯綜復雜的指標轉換為新的、個數較少的且彼此獨立的綜合指標[23-25]。這些綜合指標既能多方面的反映原生理指標的信息，又能將差異不十分明顯的各個原指標的信息集中表現出來。之后，在綜合指標的基礎上，運用隸屬函數法進行綜合評價得到的結果更加可靠。

不同的試驗方法得出的結論可能會有差異，本試驗采用的方法為營養(yǎng)液培養(yǎng)，該方法的優(yōu)點是培養(yǎng)過程容易控制，其他常用方法還有大田試驗、盆栽試驗等，但是這些方法很難控制單一元素的缺乏研究，對山羊草耐低鉀種質篩選而言不可行，而采用營養(yǎng)液培養(yǎng)法更為簡單有效，因此可以作為山羊草耐低鉀種質篩選的首選方法[9, 26]。根據山羊草苗期生長的表型觀察，僅有個別材料在低鉀條件下表型與對照差異不明顯，其余材料同對照相比均表現出莖短細弱，葉色暗淡且沒有光澤，并出現倒伏。其病狀首先出現在老葉上，表現為缺綠斑點，有些甚至呈燒焦狀，呈現出明顯的缺鉀癥狀。這些特征與其他作物在低鉀處理下的變化一致[27-29]。

通過對9種山羊草在低鉀脅迫條件下相應指標的測定，利用隸屬函數加權平均法，得到耐低鉀性度量值(D值)。研究結果表明，偏凸山羊草的耐低鉀能力最強，尾狀山羊草耐低鉀能力最弱。種質間耐低鉀的差異具有可比性，同時也可根據需求將其劃分為不同的耐低鉀類型。這樣，既考慮了各指標間的相互關系，又考慮到各指標的重要性，從而使得出的結論與實際結果較為接近。

小麥是我國主要糧食作物之一，在農業(yè)生產中占有重要的地位。隨著社會的發(fā)展，小麥的產量越來越受到民眾的關注。生產上，為了提高小麥產量，人們大量的施用鉀肥，這不僅增加了生產成本，而且還加劇了鉀礦資源的消耗。由于小麥耐低鉀育種材料有限，因此通過育種方法直接選育可應用于生產的小麥耐低鉀品種困難較大。因此本研究擬通過研究山羊草的耐低鉀脅迫特性，篩選和鑒定出耐低鉀山羊草種質(偏凸山羊草)，后續(xù)希望進一步研究其耐低鉀脅迫抗性基因，并通過基因工程等手段將耐低鉀脅迫抗性基因轉入到小麥中，從而改善小麥耐低鉀的性質，獲得耐低鉀的小麥育種材料，直接或間接培育耐低鉀小麥品種。

4 結論

本研究以9種不同基因型山羊草為供試材料，采用改進的Hoagland培養(yǎng)液及砂培盆栽的方法，設低鉀和正常供鉀兩個水平，地上部干重、鉀積累量和鉀利用效率可以作為苗期耐低鉀種質篩選的重要指標；通過主成分分析將5個單項指標轉化為3個相互獨立的綜合指標，并利用隸屬函數法進行耐低鉀性狀綜合評價，得出耐低鉀強弱順序為：偏凸山羊草>粘果山羊草>小傘山羊草>擬斯卑爾托山羊草>雙角山羊草>歐山羊草>易變山羊草>粗厚山羊草>尾狀山羊草，這與苗期表型觀察結果基本相一致。本研究初步建立了山羊草耐低鉀種質的評價指標，分析了9種山羊草的耐低鉀特性，為進一步研究山羊草的耐低鉀分子機制，以及育種上利用耐低鉀山羊草種質提供了材料和理論依據。