擁抱數字病理時代

鄭眾喜

(四川大學華西醫院病理研究室，四川 成都 610041)

擁抱數字病理時代

鄭眾喜

(四川大學華西醫院病理研究室，四川 成都 610041)

相對于傳統光學顯微鏡技術，數字顯微技術正帶給病理學巨大的變革，由此衍生的數字切片技術為病理學擁抱大數據、互聯網、云計算和人工智能等前沿科技奠定了基礎。病理學在疾病診斷中起著決定性的作用，但目前仍然是利用光學顯微鏡對細胞和組織的形態學信息輔以原位分子信息進行分析研究。數字顯微設備可以對整張病理切片進行高質量全數字化掃描，形成數字切片后經計算機實現動態觀察、并通過網絡實現遠程傳輸與共享等。數字切片可以集成到已有醫院信息數據庫，人們可通過內網或者英特網訪問這些數據并用于教學、診斷、遠程咨詢等。組成數字切片的上億級的離散像素的海量數據匯集讓計算機圖像分析和人工智能診斷成為可能。因此，充分利用日益強大的計算機技術和網絡技術將改變病理工作流程，極大地提升工作效率。而數字病理的普及還面臨諸多因素的制約，包括標準化、網絡安全、網絡效率和法律法規等關鍵因素。隨著這些問題的不斷解決，全新的數字病理將帶來病理學科一次技術上與應用模式的變革。

數字病理；數字顯微設備；數字切片；遠程病理；計算機輔助診斷；人工智能；智慧病理

上世紀90年代末，自CCD相機用于拍攝顯微鏡圖像開始，科學家們便開始研究將一系列數字顯微圖像拼接成一張巨大的切片圖像，實現經計算機顯示和訪問。在本世紀早期，數字顯微設備，或者虛擬顯微鏡經歷了開拓新技術的內在困難和缺少合適IT技術支撐，用于表達顯微切片信息大容量數據文件的時代。今天，隨著數字顯微技術和各種相關計算機軟件工具的成熟，數字顯微設備已經開始成為形態學領域便利的日常工具，尤其在病理學的應用。在未來5年內，計算機技術和網絡技術的進一步發展，數字顯微技術的應用將更加廣泛，并日漸普及。數字病理時代正在以勢不可擋的速度向我們走來。

病理專家通過顯微鏡觀察和研究染色過的組織切片，研究在疾病發生發展過程中的組織細胞形態結構的變化和分子變化，最后的判讀與診斷。在惡性腫瘤的診療過程中，結合對分子靶向敏感生物標志物的觀測，更能提升病理專家綜合地位。雖然分子技術的進步讓人們對發病過程的生物學背景有了更深的認知，但組織形態和細胞形態診斷依然占據主導地位。分子形態學技術與分子結構信息的結合，對應用原位雜交(ISH)組學檢測染色體和基因變異，免疫組化(IHC)探明轉移蛋白在健康向病變細胞轉變的機理起到越來越重要的作用。對于一些腫瘤病理，需要在細胞或者亞細胞層面量化一系列生物標志物數值指標。嚴格的診斷標準和海量復雜的信息處理越來越離不開強大的計算機人工智能的支持。醫院管理系統和診斷報告系統已經充分利用了集成文字數據、靜態顯微鏡圖像數據、放射影像數據和語音識別數據等綜合數據，只要具備合適的計算機處理能力和網絡傳輸基礎，全切片顯微圖像同樣可以完美地集成到醫院的數據庫系統。

相對于傳統光學顯微鏡，數字顯微設備有很多優越特性。利用專門軟件工具，在移動終端可動態快速獲取任意一張染色切片，以任意倍率進行觀察和瀏覽。同時所形成的數字切片可以突破時空的制約，讓全球病理專家共享。因此數字顯微設備成為實現遠程咨詢診斷、遠程教育、專業考試以及質量控制的有效工具。此外，數字化切片圖像也是計算機輔助診斷和人工智能診斷的基礎。

數字顯微技術和數字切片技術奠定了病理技術走向數字化的基礎，互聯網技術和人工智能的融合，傳統病理正在迎接數字病理和智慧病理時代的到來。

1 全切片數字化(Whole Slide Scanning)

利用自動對焦和自動白平衡技術，數字顯微設備可以把生物樣本組織細胞的細節以高顏色還原性和高分辨力呈現出來，并生成大容量數字文件。數字顯微設備通過對玻璃切片進行自動掃描，生成數字切片。數字切片由上億個圖像像素組成，每個像素包含有XY坐標位置信息、顏色信息和灰度信息等。采集病理圖像信息的掃描方式一般分為面掃描和線掃描兩大類。兩者的最大區別是，前者使用面陣CCD(或CMOS)相機，后者使用線陣CCD(或CMOS)相機。通常數字切片以金字塔結構進行數據組織，金字塔的上層，放大倍率越小，每一層都是由最底層的數據通過高效算法壓縮而成(圖1)。在切片樣本的厚度方向進行分層掃描還可以模擬光學顯微鏡的焦距微調效果。

數字切片的空間分辨率主要取決于物鏡的光學分辨率和相機的像素陣列。數字顯微設備通常使用高數字孔徑(NA值大于0.65以上)的20倍物鏡，對于需要更高分辨率的樣本，通常使用高數字孔徑(NA值大于0.85)的40倍物鏡，使用40倍物鏡通常會以犧牲掃描速度和成倍(約4倍)數據容量為代價。

從樣本切片衍射產生的光子通過CCD或CMOS光電傳感器收集后轉換為數字信號。目前市面上大多數切片掃描儀都具有自動馬達驅動、自動連續實時對焦和面掃描或者線掃描等功能。

面陣掃描的代表有優納(UNIC)、麥克奧迪(Motic)和3DHISTECH等設備，可以高速成像，成千上萬張彼此相鄰的顯微圖像(FOV)在數十秒鐘內完成，通過無縫拼接算法生成數字切片圖像。線陣掃描的代表有Aperio、江豐等設備，設備通常用4096像素的線陣像素傳感器，對樣本切片進行一行一行地掃描，再通過拼接算法生成數字切片。但是理論上線陣掃描的速度因受限于其較低的光子收集能力，很難應用于熒光掃描領域。在此基礎上，以Hamamatsu為代表推出了時間遲延積分(TDI)線陣掃描，采用64線陣或者128線陣以上的光電傳感器，彌補了單線陣掃描光子收集能力弱的缺陷，相對于單線陣光電傳感器，可以實現高速掃描。近幾年，隨著面陣傳感器的發展，連續面陣掃描已經成為時間遲延積分掃描的有力競爭。

圖1 數字掃描原理 由逐層掃描獲得的數據經算法處理獲得完整圖像

2 數字切片的特點

與經顯微鏡目鏡切片瀏覽模式相比，計算機瀏覽的各種便利功能和經顯示器切片瀏覽模式更符合人體工程學。基于金字塔數據結構(見圖2)的數字切片可以實現無級放大倍率的無滯后切換，無需切換物鏡，不再需要重新調整焦距和光源等。同時數字放大還可將很多原有光學放大倍率未能呈現的細節信息呈現出來。

圖2 數字切片數據結構

數字切片可以實現永久性標注、直線距離測量、曲線距離測量、周長和面積測量及更高級別的圖像分析。不同染色的數字切片可進行同時比對，甚至免疫組化和熒光原位雜交可相互關聯和比對等。

圖像像素具有坐標、顏色和灰度等特征，這些特征可以用來進行計算機目標分割和自動量化。基于形狀、大小和紋路等特征，還可以實現對形態和功能區塊(譬如腺體增生、異常排列的上皮巢)的自動模式識別。在樣本切片的Z軸方向生成一系列數字切片還可以進行樣本組織的三維重構，便于觀察腫瘤內部的立體結構信息。集數字切片、標注信息、尺寸信息等于一體的數字病理信息可以與院內外必要的人員即時共享。通過計算機對數字切片進行存儲、歸類管理。重新觀察都會變的輕松自由。數字切片的所有這些特性都可以通過專門的軟件工具以極其友好的界面給使用者呈現出來，但前提是有足夠的計算機處理能力、足夠的網絡帶寬、足夠的存儲空間和數據安全保障等。

3 數字切片在教學和繼續教育的應用

數字顯微設備在專業病理教學和繼續教育領域有著越來越多的應用。盡管每個地方的電腦與教學媒體裝備和所處地域不同，但基本教學系統需求與遠程病理會診系統非常相似(圖3)。相對于購買、維護光學顯微鏡及需要定期替換教學切片，數字病理的成本優勢非常明顯。數字病理最大的優勢是讓每個人可以打破時空制約，同時實施訪問和瀏覽最標準的切片庫。同時數字切片可以把罕見的病例或者需要昂貴輔助手段(譬如免疫組化和熒光原位雜交等)制作的切片與無限額的學生共享。數字切片的優勢還體現在可同步瀏覽多張數字切片，通過文字和標注可以指導學生完成遠程學習和自我測試或者通過數字切片實施學生的技能考試。通過特定軟件工具可以隨機選擇試題并進行自動閱卷評分。另外利用計算機技術可將傳統的單人操作顯微鏡或者多頭顯微鏡診斷延伸，實現多人在線遠程會診。

數字切片還可嵌入到病理教科書，如中山大學王連唐等主編的《病理學》第3版。各種國內外的病理讀片會和學術研討會的數字切片庫也可以在相應官網上訪問。美國病理學會(The College of American Pathologists)還開放常規病理及其亞專科的數字切片庫以及針吸細胞學數字切片庫。

圖3 數字切片教學

4 遠程咨詢和遠程診斷

對疾病發生發展過程呈現出來的大量形態學、臨床循證學以及分子學知識的積累，病理學已經成為高度亞專科化的學科分支。目前要開展涵括皮膚、神經、軟組織以及各系統等亞專科的全科病理診斷非常困難。基層醫院病理科主要依賴于外援開展服務，尤其是邊遠地區和欠發達地區的病理資源嚴重匱乏，病理學科的滯后嚴重影響著基層整體診療水平的提高，制約著外科、臨床的發展，尋求院外病理診斷資源顯得尤為迫切。傳統的郵寄切片的模式存在郵寄途中的切片丟失、切片破損等風險，并且貽誤患者最佳的治療時機。遠程病理的目的是通過數字切片支持快速診斷咨詢，或直接提供診斷服務。

基于傳輸靜止圖片的靜態遠程病理存在取圖區域的主觀性和隨機性等缺點，最理想的模式是病理醫生可以通過動態的遠程病理系統隨意觀察數字切片的任意區域以及相關的臨床數據和影像數據等。其中動態遠程病理還有一個主要屬性是為行動不便的專家等提供平等的為臨床為患者服務的機會。高通量自動切片掃描儀可以連續不斷的將數字切片傳送到服務器，通過內網或者因特網實現共享。用數字切片進行診斷涉及到多方面的技術、專業和醫療法規等復雜問題，與掃描速度、服務器性能和網絡速度、圖像質量、存儲空間、合適的備份系統、工作站質量、圖形界面、專業培訓、院內數據庫的安全等綜合因素相關。目前數字顯微設備主要應用于術中冰凍切片診斷，日常病理診斷服務以及遠程病理診斷咨詢服務與遠程會診服務等(圖4)。

圖4 遠程病理 通過計算機或網絡快速瀏覽，可進行遠程病理會診、科內數字化切片管理、智能輔助分析等，并可取代傳統光學顯微鏡，應用在形態學教學、臨床病理診斷、科學研究等領域。

目前，動態遠程病理的主要瓶頸涉及到超大圖像數據網絡傳輸，同時受醫院信息安全保護的防火墻過濾等制約。實際應用經驗證明，保證相對流暢數字切片瀏覽的最小速度應該不小于1 Mbit/s。解決數字顯微設備應用的這些問題需要醫院信息科、病理科和醫院IT專業人員的密切合作，同時需要醫院提供足夠的網絡基礎設施和條件等。

遠程病理診斷咨詢也可以應用于對診斷結果進行二次復診，確保診斷質量。在歐洲和美國均已經開始應用數字病理技術進行診斷質量的監督。同時已經有些廠商開始應用數字切片進行制片質量的量化評價的研究。更進一步，數字切片可以為病理診斷流程的質量和規范化提供新的工具和手段，提升其可追溯性和可重復性等。如通過流程系統的集成，可以跟蹤組織學病理從樣本接收到診斷報告全過程，并形成統一標準的質量檢測指標。

5 人工智能及輔助診斷

對分子形態學技術信號進行經驗分析是一件枯燥無味的工作，其結果隨不同觀察人員的主觀感覺不同而變化，因此其重現性低，統計可信度受限。顯微鏡下人眼觀察辨識細胞，是基于其細胞核、細胞質和細胞膜等明顯相似特性(顏色、密度和大小形狀等)，及其區域邊界的細微變化特征進行判斷。但是這是相對主觀的辨識，數字切片是由離散像素組成的圖像，各種特征可以在計算機上準確計算出來。這樣可以實現計算機自動圖像分割，以及對細胞內的細胞核、細胞質、還有組織結構特征和相關特定分子信號的自動計數和識別(圖5)。

圖5 計算機輔助診斷 a:細胞質分析；b:印戒細胞檢測

生物標志物信號強度與被檢測到的分子密度成正比，因此數字切片圖像可用于生物標志物的自動量化檢測。目前市面上已經有用于自動免疫組化(IHC)和熒光原位雜交(FISH)的掃描設備和圖像分析軟件，與組織微陣列結合還可以實現生物標志物表達的自動篩查。但是由于細胞生化的復雜性和難于對處理實現標準化的原因，還沒有對組蛋白的標準化進行控制。熒光原位雜交檢測染色體和基因的數量畸變，可以在熒光掃描模式下通過多層掃描模式下獲得高精度的量化檢測結果。

一般的染色是多種顏色的組合，不同染色圖像像素的顏色范圍需要與其它染色顏色范圍進行分割。目前市面上已經有多種顏色分割(顏色去卷積)算法，常見的可以實現三種顏色的分割。更精準的顏色光譜分割還可以通過光譜成像相機采集多波長光的圖像實現。

常用的圖像分析工具大都用于研究和標志物的驗證，主要基于細胞大小、形狀、顏色和密度等信息。還有主要用于HER2蛋白檢測和細胞核信號檢測，尤其是雌激素受體蛋白(ER)和孕酮受體蛋白檢測的專用算法，可以實現對乳腺癌的自動分類和對免疫治療的反應效果預測，對處理結果還可以進一步進行各種圖表統計分析。大量基因和染色體異常也可以通過專門的分割算法實現自動分析，還可以通過算法工具對數字切片庫的切片圖像按照各種特征進行快速排序和分類等。

隨著深度學習模型的突破，基于機器學習的宮頸癌篩查算法、結直腸癌圖像分析算法和乳腺癌的分析模型等成了近期研究的熱點。

6 結論

一個多世紀以來用于組織學和細胞形態學研究的光學顯微鏡正在迎接新成員的到來—數字顯微設備。相對于傳統光學顯微鏡，數字顯微設備具有快速信息處理、快速存儲、無限共享、快速遠程訪問等優勢，這些是大數據和云計算的技術特性。因此，以數字顯微設備為核心的數字病理是連接病理學與大數據/云計算技術的橋梁。形態學已經被賦予了越來越多的大量原位分子信息測試，這些測試信息必須進行非常精密的處理以便決定患者的個性化治療方案。同時發病過程中累積的大量經驗和知識已經讓病理學發展成為非常重要的專業化學科。數字顯微設備還可以為病理學研究、病理診斷提供強大的信息化支援工具，極大地提高工作效率，尤其是研究生和博士專業教學、遠程病理診斷和遠程病理咨詢、院內和院際間病理質控、高通量篩查、計算機圖像分析及客觀量化的診斷結果解釋等。盡管如此，新的數字病理技術的普及還需要進一步突破信息標準化、流程標準化、用戶界面優化、數字化掃描速度優化、網絡速度優化、數字病理專業人員培訓以醫療法律法規等制約。作為傳統光學顯微鏡的技術升級，數字顯微技術必將帶來病理學的一場技術變更和工作模式變革。

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Embracingtheupcomingeraofdigitalpathology

ZHENGZhong-xi

(Pathologylaboratory，WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041，China)

Compared to the traditional optical microscope technique， the digital microscope technique nowadays is bringing pathology tremendous revolutions.The digital slide techniques derived from the digital microscope technique will lay the foundation for pathology to embrace cutting-edge technologies such as big data， internet， cloud computing and artificial intelligence (AI).Pathological analysis plays a decisive role in disease diagnosis， but， at the present， it still focuses on analysis of morphologic changes in cells and tissues by optical microscope supplemented with the in situ molecular information.The digital microscope equipment is able to provide high quality digital scanning for the whole slide and offers dynamic observation， tele-transmission and date sharing via internet.Digital slide can be integrated into hospitals’ information databases， which can be accessed through intranet for teaching， clinical diagnosis， tele-consultation and so on.Digital slides can offer hundreds of millions of massive data of discrete pixels， based on which computer image analysis can be achieved and artificial intelligence diagnosis comes true.Therefore， the routine workflow of pathology labs will be changed and work efficiency will be extremely improved with powerful tools of computer and network techniques.However， digital pathology is still facing many restricted factors including standardization， network security， network efficiency， laws and regulations.Due to the increasing solutions of these problems， an innovative digital pathology will lead to the revolution in technology， and application patterns of pathology.

Digital pathology；Digital microscope equipment；Digital slice；Remote pathology；Computer aided diagnosis；Artificial intelligence；Intelligent pathology

鄭眾喜，男，博士，教授，博士生導師。中國醫學裝備協會理事，中國醫學裝備協會病理裝備技術專業委員會副主任委員。主要研究方向：數字病理技術和應用研究。

R446.8

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1672-6170(2017)05-0006-04

2017-07-31)