雙熒光標記小鼠模型研究破骨細胞融合

唐 勇，吳家順，牛好曼，代璐嶺，楊 肖

(1.成都銅雀臺整形美容醫院美容牙科，四川 成都 610041；2.四川大學華西口腔醫學院，四川 成都 610041)

雙熒光標記小鼠模型研究破骨細胞融合

唐 勇1，吳家順2，牛好曼2，代璐嶺2，楊 肖2

(1.成都銅雀臺整形美容醫院美容牙科，四川 成都 610041；2.四川大學華西口腔醫學院，四川 成都 610041)

目的利用雙熒光標記小鼠模型觀察破骨細胞的融合過程并探討不同濃度的細胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL)和甲狀旁腺激素(PTH)對破骨細胞融合效率的影響。方法使用5周齡CTSK-Cre和的ROSAmt/mg兩種轉基因小鼠，前者無熒光表達而在其破骨細胞中表達CRE重組酶，后者表達紅色熒光(tomato)。處死兩種小鼠并沖出骨髓間充質干細胞(BMSCs)且以1∶1的比例混合培養。將不同濃度的RANKL和PTH加入共培養體系，計算綠色熒光的量。結果CTSK-Cre和ROSAmt/mg2種轉基因小鼠BMSCs共培養第5天觀察到綠色熒光陽性的細胞出現；RANKL組：隨著RANKL濃度的升高，共培養體系內綠色熒光陽性的細胞數不斷增加；PTH組：共培養體系內綠色熒光陽性的細胞數與PTH濃度之間未發現明顯的相關性。結論基于cre-loxp系統建立的cre重組酶誘導的雙熒光標記小鼠模型可有效用于破骨細胞融合過程的研究；RANKL的濃度越高其誘導破骨細胞融合的效率越高；PTH與破骨細胞的融合效率之間無明顯的劑量相關規律。

破骨細胞；細胞融合；CTSK-Cre；ROSAmt/mg

骨吸收異常是當代醫學試圖克服的重大難題之一。異常的骨吸收會導致一系列的臨床疾病，包括骨質疏松癥、惡性高鈣血癥，以及包括牙槽骨在內的骨的炎癥性吸收和牙齒萌出異常等。而破骨細胞在骨吸收過程中發揮著最主要的作用。破骨細胞是由骨髓中的髓系祖細胞分化而成的單核巨噬細胞相互融合，所形成的多核巨細胞[1]。而細胞融合是破骨細胞形成過程中必不可少的環節，也是破骨細胞重要的特點之一。研究破骨細胞融合的傳統方式往往對其形成過程探究有限。因此我們試圖尋找一種簡單直接而又有效的方法來研究破骨細胞的融合過程。本實驗采用基于cre-loxp系統建立的cre重組酶誘導的雙熒光標記小鼠模型來研究破骨細胞的融合過程及其影響因素。旨在為破骨細胞融合及骨吸收的臨床用藥提供新的指導。

1 材料與方法

1.1實驗動物2014年12月至2017年2月，轉基因小鼠CTSK-Cre與ROSAmt/mg各12只(The Jackson Laboratory，美國)，5周齡，SPF級。該轉基因小鼠購自美國杰克遜實驗室。飼養于四川大學生物治療國家重點實驗室基因工程小鼠中心。所用飼料營養全面均衡，經過嚴格無菌處理。小鼠飲用水、木屑墊料及培養籠經嚴格高溫高壓處理，空氣經層流過濾，動物房飼養環境達到無特定病原體SPF級別。

1.2試劑a-MEM、特級胎牛血清(hyclone公司，澳大利亞)、青霉素/鏈霉素(Hyclone公司，美國)，鼠重組細胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，MCSF)(Peprotech公司，美國)、熒光顯微鏡(Olympus CKX41，Japan)。

1.3兩種轉基因小鼠骨髓間充質干細胞混合培養頸椎脫臼法處死5周齡CTSK-Cre與ROSAmt/mg小鼠，兩種小鼠使用同樣的方法處理并取骨髓間充質干細胞混合75%乙醇浸泡消毒2分鐘。無菌條件下分離股骨及脛骨于無菌PBS中，去除附著肌肉及韌帶，剪斷兩側骨骺端，用注射針頭將a-MEM輕輕沖洗骨髓腔于50 ml無菌離心管中。分別全都沖出后，注射器反復吹打成細胞懸浮液，細胞計數，用a-MEM完全培養液將細胞密度調整至5×106個/ml。將兩種小鼠來源的細胞以1：1的比例混合后接種于6孔板中，每孔培養基2 ml。37 ℃，5%CO2條件下完全培養基(含 α-MEM培養基、10%胎牛血清、1% 青霉素/鏈霉素)培養。分別在細胞培養后的每天使用熒光顯微鏡觀察是否有綠色熒光(GFP)表達，當GFP出現時采圖。

1.4不同濃度的RANK和PTH對破骨細胞融合效率的影響將兩種轉基因小鼠骨髓來源的單核細胞以1∶1的比例混合后種于6孔板中，每孔培養基2 ml，每孔加入巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF，終濃度為50 ng/ml)。同時將不同濃度的RANKL和PTH(分別為10、50、100、200、300 ng/ml)加入以上的共培養體系。37 ℃，5%CO2條件下完全培養基(含 α-MEM培養基、10%胎牛血清、1% 青霉素/鏈霉素)培養。分別在細胞培養第3、6、9天，使用熒光顯微鏡觀察細胞行為并采圖。從細胞培養第二天開始直至培養結束，每天通過對孔板內表達GFP的細胞數量計數，繪制綠色熒光細胞數隨著細胞培養時間變化的趨勢圖。

2 結果

2.1兩種轉基因小鼠骨髓間充質干細胞混合培養后的熒光表達情況當培養至第2天時熒光顯微鏡下并未觀察到明顯的GFP陽性的細胞出現(圖1 a所示)，而培養進行至第5天時鏡下出現明顯空泡狀的破骨細胞(灰色箭頭)，同時熒光顯微鏡下就可以觀察到GFP陽性的細胞(綠色箭頭)出現(圖1b)。

2.2不同濃度的RANKL與PTH對共培養體系內破骨細胞融合效率的影響標號1-5Rankl的濃度依次為10、50、100、200、300 ng/ml。熒光顯微鏡采集的圖片顯示，隨著Rankl濃度的增高，視野內GFP的量也隨之增加，而紅色熒光(tomato)的表達量會隨之減少(圖2a)。并根據不同濃度的Rankl組表達GFP陽性細胞數隨時間的變化，繪制其變化趨勢圖(圖2b)。

圖1 混合培養體系熒光及倒置顯微鏡采圖 a.混合培養2天；b.混合培養5天(10X)

而不同濃度的PTH組，標號1-5PTH的濃度依次為10、50、100、200、300 ng/ml。隨著PTH濃度的增加，視野內GFP陽性的量并未表現出明顯的劑量相關性(圖3a)。并根據不同濃度的PTH組表達GFP陽性細胞數隨時間的變化，繪制其變化趨勢圖(圖3b)。

圖2 RANKL組GFP陽性細胞熒光及變化趨勢圖 a.Rankl組熒光圖(10X)；b.Rankl組GFP變化趨勢圖

圖3 PTH組GFP陽性細胞熒光及變化趨勢圖 a.PTH組熒光圖(10X)；b.PTH組GFP變化趨勢圖

3 討論

破骨細胞是來源于造血干細胞或單核前體細胞的多核巨細胞[1]，細胞融合在破骨細胞的形成以及行使功能的過程中發揮著重要的作用。骨穩態由成骨細胞和骨細胞共同維持[2]，而破骨細胞功能異常會引起一系列的臨床癥狀和功能異常，因此研究破骨細胞的融合過程以及其影響因素，可以為臨床治療及用藥提供指導意義。為了更直觀有效地觀察破骨細胞的融合過程，我們構建了雙熒光標記的轉基因小鼠模型。在該模型中我們可以根據綠色熒光是否出現以及其出現的量的多少來判斷破骨細胞前體是否發生融合以及融合效率的差異。

為了驗證該模型的有效性，我們首先將兩種轉基因小鼠，即CTSK-Cre與ROSAmt/mg骨髓來源的單核細胞以1∶1的比例混合培養。二者共培養5天后便觀察到了綠色熒光的出現，該結果表明CTSK-Cre與ROSAmt/mg轉基因小鼠的破骨細胞前體細胞發生了融合，Cre重組酶發揮作用并剪切后者編碼紅色熒光(tomato)的基因片段，使得融合后的破骨細胞表達GFP。

因此本實驗利用該模型來研究不同濃度的PTH和RANKL對破骨細胞融合效率的影響。RANKL屬于腫瘤壞死因子配體超家族成員，對于破骨細胞的形成、發揮功能及存活是必須的。同時有研究表明，在淋巴細胞分化、乳腺發育、腸內皺褶細胞的產生、雌性動物的體溫調節等過程中RANKL也發揮著重要的作用[3]。RANKL有兩種受體：一種是RANK，主要表達于破骨細胞前體及破骨細胞表面；當RANKL與破骨細胞膜表面的RANK受體結合時，便會啟動一系列基因轉錄，并且誘導破骨細胞前體相互之間的融合，進而促進破骨細胞的形成及分化，并抑制其凋亡；另一種受體為OPG，其對RANKL和RANK的結合起負調節作用，進而抑制破骨細胞的形成和分化[4]。RANKL/RANK/OPG系統在調節骨代謝和維持骨穩態的過程中發揮重要作用[5]。本實驗中為了研究不同濃度的RANKL對破骨細胞融合效率的影響，將稀釋后的不同濃度的RANKL加入到兩種轉基因小鼠骨髓來源單核細胞的共培養體系，我們發現RANKL對破骨細胞融合效率的影響與以往的研究一致，即Rankl濃度越高，破骨細胞的融合效率越高，破骨細胞的形成對Rankl呈現出濃度依賴性。

PTH是由甲狀旁腺分泌的用以調節機體內鈣、磷代謝平衡的重要激素之一，其主要靶器官是骨、小腸和腎臟。在骨組織內，PTH是調節骨重建的主要激素，通過對骨形成和骨吸收的調控作用行使其功能。當間歇性給予PTH時，它會通過增加成骨細胞的量及其活性來促進骨形成；而持續給藥時，PTH會通過刺激骨吸收來減少骨形成。PTH的受體主要在成骨細胞以及前成骨細胞表達。因此，我們認為，當持續給予PTH時，其對骨吸收的促進作用是由于PTH首先作用于成骨細胞，成骨細胞分泌的因子激活破骨細胞，進而導致骨吸收。有文獻指出當骨吸收作用被抑制時，間歇性應用PTH對于骨形成的促進作用也會受到影響，因此PTH對于骨形成的促進作用可能需要骨吸收的誘導[6]。而此過程最終的結果是骨形成多于骨吸收，而骨吸收的發生只是成骨細胞發揮作用前一過性的反應。然而此過程中破骨細胞的激活機制仍不清楚。所以PTH是通過成骨細胞間接的發揮對破骨細胞的調節作用，并通過二者之間復雜的相互作用來調節骨重建。而在PTH對于破骨細胞融合效率的研究中，我們直接將不同濃度的PTH直接加入到骨髓來源的單核細胞，PTH對于破骨細胞的調節作用十分復雜，對于體內環境的模擬有限。因此實驗結果并未反應出二者明顯的相關性。找到并建立一種合適的模型對于研究PTH對破骨細胞的雙重作用至關重要，并為PTH治療骨代謝紊亂疾病提供臨床指導。

[1] Chambers TJ.The cellular basis of bone resorption[J].Clin Orthop Relat Res，1980，151(151)：283-293.

[2] 吳爽，蔣科，蔚芃，等.骨代謝指標與骨關節炎患者骨密度變化的相關性研究[J].實用醫院臨床雜志，2015，12(3)：57-59.

[3] Hanada R，Leibbrandt A，Hanada T，et al.Central control of fever and female body temperature by RANKL/RANK[J].Nature，2009，462：505-509.

[4] Karmakar S，Kay J，Gravallese EM.Bone damage in rheumatoid arthritis：mechanistic insights and approaches to prevention[J].RheumDis Clin North Am，2010，36(2) ：385-404.

[5] 田娟，龍麗，周彬.類風濕關節炎骨侵蝕研究進展[J].實用醫院臨床雜志，2017，14(2)：133-136.

[6] 萬啟龍，王強，李祖兵.PTH對骨代謝雙重作用的研究進展[J].中國口腔頜面外科雜志，2011，9(4)：343-346.

楊 肖

R318

A

1672-6170(2017)05-0020-03

2017-03-11；

2017-07-23)