黃曲霉毒素B1對(duì)原代人皮膚成纖維細(xì)胞毒性作用研究

劉 珊，羅仲秋，譚 洪

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610031；3.成都市第一人民醫(yī)院普外科，四川 成都 610041)

黃曲霉毒素B1對(duì)原代人皮膚成纖維細(xì)胞毒性作用研究

劉 珊1，羅仲秋2，譚 洪3

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610031；3.成都市第一人民醫(yī)院普外科，四川 成都 610041)

目的探討黃曲霉毒素B1(AFB1)對(duì)原代培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)的毒性作用。方法分離培養(yǎng)原代HSF細(xì)胞，不同濃度的AFB1處理HSF細(xì)胞后，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果AFB1能抑制HSF細(xì)胞生長(zhǎng)，隨著AFB1染毒濃度和染毒時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖能力減弱。100 μmol/L和200 μmol/L的AFB1處理HSF細(xì)胞15天后，分別有62.4%和89.2%的細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制。結(jié)論AFB1對(duì)HSF細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用。

黃曲霉毒素B1；原代人皮膚成纖維細(xì)胞；細(xì)胞毒性

黃曲霉毒素(aflatoxins，AF)是糧食食品霉變過(guò)程中主要由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的劇毒代謝產(chǎn)物。其中，在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)最為多見(jiàn)，其毒性和致癌性也最強(qiáng)，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1～3]。目前，AFB1的強(qiáng)烈危害性已引起各國(guó)廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)AFB1暴露能引起人體多個(gè)系統(tǒng)的毒性效應(yīng)，包括消化系統(tǒng)毒性、肝臟毒性、生殖發(fā)育毒性等[4～7]。皮膚作為人體面積最大的組織器官，是人體接觸外來(lái)物質(zhì)的第一道屏障，也是最容易接觸到AFB1的器官。但目前關(guān)于AFB1對(duì)皮膚毒性作用的研究，國(guó)內(nèi)外尚未有報(bào)道。因此，2015～2017年作者分離培養(yǎng)健康人原代皮膚成纖維細(xì)胞(human skin fibroblast cells，HSF)，用AFB1處理HSF細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。為暴露于AFB1污染環(huán)境的人群提供一定的參考價(jià)值，并為AFB1對(duì)人皮膚細(xì)胞毒性作用的研究提供相關(guān)基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、Model 680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。AFB1(純度≥99%)(美國(guó)Sigma公司)、CCK-8試劑盒(日本Dojin公司)、二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)HyClone公司)、小牛血清(美國(guó)HyClone公司)，0.25%胰蛋白酶溶液(美國(guó)Thermo Fisher公司)、波形蛋白抗體(美國(guó)Labvision公司)、二抗免疫組織化學(xué)試劑盒(武漢晶美試劑公司)。

1.2原代HSF細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化和鑒定健康志愿者前臂皮膚經(jīng)75%乙醇消毒后，取小塊皮膚組織置于含3×105U/L青霉素、300 mg/L鏈霉素的PBS緩沖液中保存。迅速送往實(shí)驗(yàn)室后，在培養(yǎng)皿中，除去脂肪、結(jié)締組織和皮下血管，放入含100 mU/ml dispase酶中4 ℃消化過(guò)夜。第二天，剝?nèi)ケ砥樱瑢⒄嫫蛹舫? mm3大小的組織塊，用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液37 ℃消化10 min，過(guò)100 μm篩網(wǎng)去除未消化組織塊。分離得到的細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)基(100 ml/L小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、2 mM L-谷氨酰胺和DMEM低糖培養(yǎng)基)，貼壁培養(yǎng)1 h，洗掉未貼壁細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，放入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過(guò)差速貼壁法，進(jìn)一步純化細(xì)胞后，采用波形蛋白抗體鑒定皮膚成纖維細(xì)胞。

1.3實(shí)驗(yàn)分組和處理取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSF細(xì)胞，按5×103/孔接種于96孔板，過(guò)夜培養(yǎng)14～18 h，使其充分貼壁。次日，將血清培養(yǎng)基替換為100 μl終濃度為100、200、300、400 μmol/L AFB1的培養(yǎng)基。溶劑對(duì)照孔中加入相應(yīng)濃度的DMSO溶液。培養(yǎng)5、10、15天后，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。每個(gè)染毒組設(shè)置3個(gè)平行孔。

1.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率AFB1染毒結(jié)束后，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞存活率。每孔加入10 μl CCK-8試劑，于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h。使用酶標(biāo)儀在檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm、參比波長(zhǎng)630 nm處分別測(cè)定每孔吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(樣品A630 nm-樣品A450 nm)/(對(duì)照A630 nm-對(duì)照A450 nm)×100

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察AFB1染毒后，通過(guò)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)，對(duì)照組中HSF細(xì)胞形態(tài)正常，貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形，滿視野生長(zhǎng)，排列緊密。AFB1處理HSF細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)無(wú)改變，貼壁生長(zhǎng)，但細(xì)胞數(shù)量減少。隨AFB1染毒濃度、染毒時(shí)間的增加，細(xì)胞數(shù)量越來(lái)越少。100 μmol/LAFB1處理15天后，細(xì)胞數(shù)量減少約40%；當(dāng)AFB1濃度增加到200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞數(shù)量?jī)H有對(duì)照孔的10%(圖1)。這表明隨著AFB1染毒濃度和時(shí)間的增加，HSF細(xì)胞增殖活性越低。

圖1 AFB1對(duì)HSF細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用

2.2AFB1對(duì)HSF細(xì)胞毒性作用觀察細(xì)胞形態(tài)變化后，進(jìn)一步用CCK-8法對(duì)AFB1染毒后的細(xì)胞存活情況進(jìn)行定量檢測(cè)。100、200、300、400 μmol/LAFB1處理細(xì)胞5天后，100、200 μmol/LAFB1處理的細(xì)胞存活率和對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，但300、400 μmol/LAFB1處理的細(xì)胞存活率低于對(duì)照組(P< 0.05)。隨著染毒時(shí)間的增加，細(xì)胞存活率越來(lái)越低。100 μmol/LAFB1染毒15天后，細(xì)胞存活率不到40%；當(dāng)AFB1濃度增加到200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率僅有10.8%。見(jiàn)表1。

表1 CCK-8定量分析AFB1染毒后HSF細(xì)胞存活率 (%)

*與對(duì)照組比較，P< 0.05

3 討論

AFB1具有極強(qiáng)的毒性和致癌性，廣泛存在于各種糧食食品和飼料中，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[8～11]。研究表明AFB1對(duì)肝臟、腎臟、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等都具有一定的毒性，能夠造成相應(yīng)細(xì)胞損傷[12～14]。然而，AFB1對(duì)皮膚的毒性作用鮮有報(bào)道，更是尚未有AFB1對(duì)原代分離培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞毒性作用的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用原代皮膚成纖維細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株，研究AFB1對(duì)皮膚細(xì)胞的毒性作用。原代培養(yǎng)的細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上相似性大，能更好地反應(yīng)AFB1對(duì)人體皮膚的毒性效應(yīng)。該研究可為暴露于AFB1污染環(huán)境的人群提供一定價(jià)值，以及為AFB1皮膚損傷作用的研究提供參考。

本研究發(fā)現(xiàn)，AFB1對(duì)HSF細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用。隨著AFB1染毒濃度和染毒時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖活性減弱。已有多項(xiàng)研究報(bào)道了AFB1對(duì)多種其他體外培養(yǎng)細(xì)胞的毒性損傷作用。Ribeiro等研究發(fā)現(xiàn)AFB1對(duì)體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞具有損傷作用，染毒劑量增加后，細(xì)胞大量凋亡而死亡[15]。Golli-Bennour等發(fā)現(xiàn)AFB1能使P53表達(dá)上調(diào)、Bcl-2表達(dá)下調(diào)，從而引起猴胚腎細(xì)胞核斷裂、細(xì)胞死亡[7]。Lewis和Palanee等通過(guò)MTT法分別定量檢測(cè)了AFB1對(duì)人食管上皮細(xì)胞和人非小細(xì)胞肺癌的毒性作用[16，17]。這些研究結(jié)果都表明AFB1通過(guò)引起細(xì)胞死亡對(duì)相應(yīng)的體外培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，AFB1不引起HSF細(xì)胞死亡，而是通過(guò)引起HSF細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、增殖能力減弱產(chǎn)生毒性效應(yīng)。這提示AFB1對(duì)人皮膚細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的機(jī)制可能不同，值得進(jìn)一步研究。

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CytotocixityofaflatoxinsB1onprimaryhumanskinfibroblastcells

LIUShan1，LUOZhong-qiu2，TANHong3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China；2.SchoolofMedicalScienceandTechnology，ChengduUniversityofTCM，Chengdu610031，China；3.DepartmentofGeneralSurgery，theFirstPeople’sHospitalofChengdu，Chengdu610041，China)

TANHong

ObjectiveTo investigate the cytotoxicity of aflatoxin B1(AFB1) on primary human skin fibroblast cells (HSF).MethodsPrimary HSF cells were isolated，cultured and treated with AFB1at different concentrations.The morphological changes were observed.Cell viability was measured by CCK-8 kit.ResultsAFB1could inhibit the growth of HSF cells.Cell viability was decreased with the increase of exposed dose and time.When HSF cells were treated with AFB1at concentrations of 100 μmol/L and 200 μmol/L for 15 d，62.4% and 89.2% of cell growth was inhibited，respectively.ConclusionAFB1exhibits significantly cytotoxic effects on HSF cells.

Aflatoxins B1；Primary human skin fibroblast cells；Cytotoxicity

譚 洪

R446.5

A

1672-6170(2017)05-0030-03

2017-02-06；

2017-04-24)