MiR-126、血管內皮生長因子的表達與微血管密度在上皮性卵巢癌組織中的變化

秦巧紅，，

(鄭州大學第三附屬醫院婦科，河南 鄭州 450052)

MiR-126、血管內皮生長因子的表達與微血管密度在上皮性卵巢癌組織中的變化

秦巧紅，任琛琛，劉星爍

(鄭州大學第三附屬醫院婦科，河南 鄭州 450052)

目的探討miR-126、血管內皮生長因子(VEGF)的表達與微血管密度(MVD)在上皮性卵巢癌組織中的變化及意義。方法采用qRT-PCR檢測21例正常卵巢組織、23例良性卵巢腫瘤組織及45例上皮性卵巢癌組織中miR-126表達水平，采用免疫組化法檢測VEGF蛋白表達及MVD。結果MiR-126在上皮性卵巢癌組織中的表達明顯低于正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織(P<0.05)；VEGF陽性率和MVD在上皮性卵巢癌組織中明顯高于正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織(P<0.05)。上皮性卵巢癌組織中miR-126、VEGF及MVD與FIGO分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)。結論MiR-126、VEGF可能與上皮性卵巢癌的發生、發展、腫瘤異常血管營養及侵襲轉移有關。

上皮性卵巢癌；微小核糖核酸；血管內皮生長因子；微血管密度

卵巢癌是女性生殖系統常見3大惡性腫瘤之一，惡性程度最高，病情發展快，且由于缺乏有效的早期診斷指標，疾病發現時多已為中晚期。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miR)是近年來新發現的一類長約21～25個核苷酸的小分子RNA，主要參與調控細胞生長分化、能量代謝、凋亡等各個重要而基本的細胞生理過程，并已經被證實與腫瘤的發生、發展、轉移、預后有著密切的關系[1-5]。MiR-126在多種腫瘤中表達下調，可能在腫瘤發生過程中發揮抑癌基因的作用[6-7]，但其在卵巢癌中的研究國內外報道甚少且存在差異，miR-126可以靶向調控血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，通過與VEGF mRNA的3’非翻譯區中的互補位點結合，在翻譯水平抑制VEGF的表達。因此本課題針對miR-126在上皮性卵巢癌組織中的表達情況進一步研究，并發現與之密切相關的VEGF及微血管密度(microvessel density，MVD)在上皮性卵巢癌組織中的變化情況。

1 材料與方法

1.1材料來源選取2010年3月至2016年8月鄭州大學第三附屬醫院婦科收治的病理科存檔的經病理學證實的89例組織標本，包括正常卵巢上皮組織21例、良性卵巢腫瘤組織23例、上皮性卵巢癌組織45例。其中正常卵巢組織取材于因良性宮體疾病行附件切除患者；良性卵巢腫瘤組織取材于術前未經化療、放療等輔助治療的良性卵巢腫瘤患者；上皮性卵巢癌組織取材于術前未行化療、放療等輔助治療的上皮性卵巢癌患者。45例上皮性卵巢癌患者年齡27～73(47.6±5.5)歲；按FIGO(2013)分期標準：Ⅰ、Ⅱ期12例，Ⅲ、Ⅳ期33例；組織學分級：低分化25例、中分化11例、高分化9例；病理類型：漿液性卵巢癌29例，黏液性卵巢癌8例，子宮內膜樣癌4例，透明細胞癌4例；淋巴結轉移：有34例，無11例。術中切取卵巢部分組織立即置液氮中速凍后移入-80 ℃冰箱中保存，用于qRT-PCR檢測；部分組織用質量分數4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，用于免疫組化檢測。

1.2主要試劑TRIzol試劑盒、逆轉錄試劑盒及SYBR Master Mix均購自美國Tiangen公司；引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。兔抗人VEGF一抗購自美國Santa Cruz公司，S-P試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京博奧森公司。

1.3免疫組化S-P法檢測VEGF蛋白的表達及MVDVEGF主要定位于細胞質和細胞膜,細胞質含有棕黃色顆粒的細胞計為陽性，選擇5個高倍鏡下計數的卵巢上皮組織細胞數和陽性細胞個數,得出陽性細胞百分率,采用半定量積分法判定結果，以其陽性細胞百分比計，≤5%為陰性(-)，6%～25%為弱陽性(+)，26%～50%為中等強度陽性(++)，≥51%為強陽性(+++)，其中后三者均記為陽性。CD34以血管內皮細胞染為棕黃色作陽性標準。腫瘤細胞間質內孤立的棕黃色血管內皮細胞或管腔面積<8個紅細胞，且管壁無肌層者代表1條單獨的微血管在低倍鏡(×200)下檢查微血管染色情況，取5個癌巢間質血管最多的視野即血管熱點區，換高倍鏡(×400)計數每個區域的MVD,平均值即作為該例標本的MVD值。

1.4qRT-PCR檢測miR-126表達1)RNA提取、檢測：使用miRNA提取試劑盒，在液氮下將卵巢組織研磨成粉狀，紫外分光光度計測定總RNA純度及濃度；2)miR-126反轉錄、擴增：取3 μL總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA,反應體系為10 μL，逆轉錄反應條件：37 ℃孵育60 min；用qRT-PCR檢測，以U6 snRNA作為內參，取cDNA 1 μL,總反應體系為20 μL；反轉錄條件：95 ℃ 15 min;95 ℃ 10 s;60 ℃ 60 s,共40個循環。以2-△ct表示組織中目的基因表達量相對于內參基因的表達倍數。引物序列見表1。

表1 MiR-126相關引物序列

2 結果

2.13種卵巢組織中miR-126表達水平上皮性卵巢癌組中miR-126相對表達量(ln值)為-1.759(-3.506～-0.001)，低于正常卵巢組織[0.796(-0.578～2.810)]、良性卵巢腫瘤組織[-0.659(-1.194～0.001)](P<0.05)。上皮性卵巢癌組織中miR-126相對表達量(ln值)與上皮性卵巢癌的FIGO分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)。見表2。

表2 MiR-126表達與上皮性卵巢癌臨床病理參數的關系

2.23種卵巢組織中VEGF表達水平3種卵巢組織中VEGF表達水平總體比較差異有統計學意義(P<0.001)。上皮性卵巢癌組織中VEGF陽性表達率[80.00%(36/45)]明顯高于正常卵巢腫瘤組織[23.81%(5/21)]和良性卵巢腫瘤組織[52.17%(12/23)](P<0.017)。見表3。

2.33種卵巢組織中MVD計數結果3種卵巢組織中MVD總體比較差異有統計學意義(P<0.001)。MVD值在上皮性卵巢癌組織(22.013±3.329)中明顯高于正常卵巢組織(6.133±2.090)、良性卵巢腫瘤組織(11.478±2.337)(P<0.05)。上皮性卵巢癌組織中MVD與FIGO分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)。見表4。

2.4上皮性卵巢癌組織中miR-126、VEGF、MVD之間的相關性MiR-126與VEGF呈負相關(r=-0.532，P<0.05)；miR-126與MVD呈負相關(r=-0.589，P<0.05);VEGF與MVD呈正相關(r=0.703，P<0.05)。

表3 VEGF表達與上皮性卵巢癌臨床病理參數的關系 n(%)

表4 MVD與上皮性卵巢癌臨床病理參數的關系

3 討論

MiR是一類不編碼蛋白質的單鏈小RNA[5]，在腫瘤疾病中miR可以作為癌基因或抑癌基因，在卵巢癌中miR也發揮重要作用，但miR-126在上皮性卵巢癌中的研究卻存在著差異。本研究結果顯示，miR-126在上皮性卵巢癌組織中的表達低于正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織，且miR-126表達與上皮性卵巢癌的FIGO分期及淋巴結轉移有關，提示該指標可能與上皮性卵巢癌預后相關，有作為上皮性卵巢癌的預后檢測指標的潛能。VEGF是目前發現的最重要的促進血管新生的因子，能夠促進腫瘤血管新生，使腫瘤細胞更易于侵入和穿透血管，實現腫瘤的侵襲和轉移，研究[6]表明VEGF可能參與了上皮性卵巢癌的發生、發展，并在上皮性卵巢癌的侵襲轉移中有著重要作用。MVD是評估血管生成情況的指標之一[7]。本研究結果顯示，VEGF、MVD在上皮性卵巢癌組織中的表達高于正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織，且兩者均與上皮性卵巢癌的FIGO分期及淋巴結轉移有關，提示VEGF、MVD可能參與卵巢癌的發生、發展。總之，在上皮性卵巢癌發生、發展過程中，可能由于miR-126表達的下降，對VEGF的表達抑制減弱，促進腫瘤血管的生成，這為上皮性卵巢癌的治療提供新的靶點選擇。

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ChangesofMiR-126,VascularEndothelialGrowthFactorandMicrovesselDensityintheEpithelialOvarianCancer

QIN Qiaohong, REN Chenchen, LIU Xingshuo

(DepartmentofGynecology,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

ObjectiveTo investigate the expressions of miR-126 and vascular endothelial growth factor (VEGF), microvessel density (MVD) in the epithelial ovarian cancer.MethodsqRT-PCR was performed to detect the expressions of miR-126 in the 21 cases of normal epithelial ovarian tissues, 23 cases of benign epithelial ovarian neoplasm tissues, 45 case of epithelial ovarian cancer tissues; immunohistochemical staining S-P method was performed to detect VEGF and microvessle density.ResultsThe expression of miR-126 in the epithelial ovarian cancer was significantly lower than those in the normal epithelial ovarian tissues and the benign epithelial ovarian neoplasm tissues (P<0.05); VEGF and MVD in the epithelial ovarian cancer were significantly higher than those in the normal epithelial ovarian tissues and the benign epithelial ovarian neoplasm tissues (P<0.05)； miR-126, VEGF and MVD were related with the FIGO pathological types and lymph node metastases (P>0.05).ConclusionMiR-126 and VEGF play an important role in the occurrence, progression, angiogenesis, invasion and metastasis of epithelial ovarian cancer.

epithelial ovarian cancer; micro ribonucleic acid; vascular endothelial growth factor; microvessel density

秦巧紅(1983-)，女，主治醫師，主要從事婦科腫瘤方面的研究。E-mail：qin_qiaohong@126.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.04.001

R737.31;R730.23

A

1673-5412(2017)04-0277-04

2016-10-23)