豬β-防御素cDNA在枯草芽抱桿菌中的高效表達

王 娜，李 鋼，鄒輝琴，溫 靜，陳 松，張皓然，茍興華*

豬β-防御素cDNA在枯草芽抱桿菌中的高效表達

王 娜1，李 鋼2，鄒輝琴2，溫 靜2，陳 松2，張皓然2，茍興華1*

(1.成都大學，四川成都 610106;2.四川華德生物工程有限公司，四川成都 610063)

【目的】豬β-防御素(β-defensin)是豬自身分泌的一種能夠殺菌、調節免疫功能的小分子抗菌肽，是豬生長繁殖不可缺少的蛋白質。【方法】根據NCBI數據庫中的豬防御素cDNA序列，人工合成該基因序列，同時引入相關調控序列及適當酶切位點。酶切該人工合成的DNA后，連接到表達載體pHT43中，然后轉化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α，獲得的轉化子用于篩選重組表達質粒。將獲得的重組表達質粒pHT43-SS-BD轉化到枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)WB800N中，獲得基因工程菌株。使用蔗糖誘導基因工程菌表達豬β-防御素，SDS-PAGE鑒定其分子量大小，抑菌試驗測定其抑菌活性。【結果】SDS-PAGE電泳結果顯示在蔗糖誘導后得到約5 KDa的目的蛋白條帶;平板抑菌試驗結果表明，蔗糖誘導后的上清液對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抑菌效果，而沒加蔗糖的對照組上清液無抑菌效果。【結論】該研究實現豬β-防御素cDNA在枯草芽抱桿菌中的高效表達，為解決抗菌肽來源限制及枯草芽抱桿菌的生產應用奠定了技術基礎。

豬β-防御素;基因表達;活性檢測;枯草芽抱桿菌

【研究意義】當今世界人們的經濟水平提高，對食物的品質要求也提高，豬肉已經成為人們日常生活必不可少的食物。由此可見，豬肉具有巨大的市場。在養豬的過程中，防止其感染、生病以避免造成經濟損失，控制豬的死亡率是非常重要的。通常人們在養殖過程中會對豬注射抗生素，但是由于抗生素的濫用造成的微生物的耐藥性問題令科學家頭痛不已。因此，開發或尋找替代抗生素的產品已經成為當今醫藥業、畜牧業的熱點。防御素是生物體自身合成的一類多肽，由6個半胱氨形成3對二硫鍵。1972年由瑞典科學家首次從果蠅中分離出來并證明其具有抗菌效果[1]。動物種類分析顯示防御素在動物基因復制發生物種特異性擴張，目前在豬的身上發現只含有β-防御素是可以解釋的[2]。β-防御素是特異性免疫因子，功能有:細胞信號、化學引誘物、免疫、再生等[3]。【前人研究進展】目前，研究表明，β-防御素幾乎存在所有生物類群體內，是生物體長期進化過程中與病原微生物斗爭的產物，對部分真菌、原蟲、病毒甚至是癌細胞都有明顯的殺傷作用，同時參與脊椎動物的特異性和非特性免疫調節反應，對細胞沒有溶血活性[4]。對于動物來說，自身組織器官產生的防御素非常重要，特別是對免疫缺陷或低的動物，可以提高其存活率[5]。到目前為止，很少發現防御素有誘導產生耐藥菌株的情況，是一類具有重要潛在應用價值的活性物質。【本研究切入點】本實驗采用基因工程技術，將豬的β-防御素克隆到枯草芽孢桿菌中，通過發酵得到基因工程防御素，并測定其分子量及對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陽性菌的抗菌活性。【擬解決的關鍵問題】β-防御素基因能夠在枯草芽孢桿菌中正常表達且具有抗菌活性同時不對枯草芽孢桿菌產生毒性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株和質粒 SS-BD、pHT43、E.Coli DH5α、B.subtilis WB800N。

1.1.2 重組質粒構建相關試劑耗材 限制性內切酶Bam H I和Kpn I，ligation試劑盒，PCR片段純化試劑盒均購置于Takara;氨芐青霉素和氯霉素購自AMRESCO公司;質粒DNA小抽試劑盒購置于QIAUGEN。其它化學試刻均為國產試劑。

1.1.3 主要儀器和設備 DNA電泳儀、PCR儀、凝膠成像儀、超凈工作臺、離心機、恒溫培養箱、溫控搖床、蛋白電泳系統、脫色搖床、恒溫水浴鍋和紫外分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 NCBI數據庫中調取已知豬防御素(BD)序列 序列如下所示:1 GACCACTACA TATGTGCCAA GAAAGGGGGG ACCTGCAACT TCTCCCCCTG CCCG CTCTTC 61 AACAGGATTG AAGGGACCTG TTACAGTGGC AAGGCCAAGTGCTGCATCCG CTGA。

1.2.2 目的基因序列的設計 在豬防御素基因(Accession No:214442)前面加上Sac B和Samy Q序列，Sac B作為蔗糖誘導型啟動子可以使宿主菌通過蔗糖誘導表達出目的蛋白。Samy Q作為一種信號肽基因可以使宿主菌表達的目的蛋白分泌到胞外。并在兩端加入Kpn I和Bam HⅠ識別位點后直接由Invitrogen合成。

1.2.3 重組質粒的連接 用Kpn I和Bam HⅠ對目的基因及pHT43進行雙酶切，連接并轉化大腸桿菌DH5α，進行陽性克隆驗證，將驗證完成的陽性克隆挑選幾個送檢測序，待序列完全吻合以后獲得重組質粒pHT-BD提取質粒備用。

1.2.4 枯草芽抱桿菌感受態細胞的制備和轉化

根據MoBiTec提供的《枯草芽孢桿菌表達載體》的參考方法說明，將重組質粒pHT43-BD轉入感受態枯草芽孢桿菌WB800N中。涂含5μg/mL的氯霉素平板，置于37℃培養箱中過夜。

1.2.5 目的蛋白的誘導表達 將轉化板上新鮮單克隆分別接種于5 mL體積LB培養基中(蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，5μg/mL氯霉素，pH自然)，置于搖床，37℃，180 r/min，過夜培養。按1%的接種量將上述過夜的一級培養液分別接種于50 mL新鮮LB培養基中(蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，5μg/mL氯霉素，pH自然)，置于搖床，37℃，225 r/min條件下培養。當OD600達到0.8左右時加入蔗糖至終濃度10 mM，在37℃誘導，誘導時間24 h。將誘導表達的菌懸液留樣備用。以不加蔗糖的作為陰性對照，處理條件同上，培養完成后收集菌懸液備用。

1.2.6 目的蛋白的的活性檢測 將菌懸液12 000 r/min，離心10 min收集上清液，通過真空冷凍干燥將上清液濃縮成粉劑以后，用無菌蒸餾水將粉劑按照0.2 g/mL的濃度配置成樣液，然后通過平板擴散法活性檢測，指示菌:大腸桿菌;金黃色葡萄球菌。A和A2陽性對照:針對不同指示菌的2種抗生素。B2供試樣品:經蔗糖誘導的真空冷凍干燥的上清液粉劑。C陰性對照:未經蔗糖誘導的真空冷凍干燥的上清液粉劑。

2 結果與分析

2.1 豬β-防御素基因的PCR鑒定

隨機挑選菌落，以目的基因的上下游為引物進行菌落PCR后，跑核酸電泳。結果為:1、9泳道都為DNA Marker，2～8號泳道都是挑取進行菌落PCR擴增后的產物，2～8號泳道在含有500 bp左右的目的基因片段，說明所挑選的菌落中含有pHT43-SSBD質粒(圖1)。

2.2 重組豬β-防御素的SDS-PAGE鑒定

含有豬β-防御素基因的枯草芽孢桿菌，需要通過LB培養基培養適宜時間后，蔗糖誘導，取菌液上清液，對比不添加蔗糖的陽性枯草芽孢桿菌培養后的菌液上清液。進行SDS-PAGE電泳結果為:1號泳道為蛋白Marker，在4 kDa處2～5號泳道(蔗糖誘導后的陽性枯草芽孢桿菌菌液)有清晰可見的條帶，而6號(未添加蔗糖的陽性枯草芽孢桿菌)沒有可見條帶，說明豬β-防御素已經被成功誘導分泌表達(圖2)。

圖1 豬β-防御素基因的檢測Fig.1 Detection of porcineβ-defensin genes

圖2 蛋白電泳結果Fig.2 Result of SDS-PAGE

2.3 平板抑菌實驗

為了進一步檢測防御素是否在枯草芽孢桿菌中成功表達，通過豬β-防御素對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑菌活性的性質進行檢測。其間需要用對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑菌活性的抗生素為正對照，沒經過誘導的菌液為負對照。從圖3可以看出，2種抗生素分別抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，含豬β-防御素的菌液B2對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都具備抑菌效果，而沒經過誘導的菌液則對2種指示菌都沒有抑菌效果。菌液沒有抗生素的抑菌效果好是因為沒有進行純化，濃縮，活性單位不夠高導致的。

3 討 論

圖3 豬β-防御素活性檢測Fig.3 Detection of porcineβ-defensin activity

通過密碼偏愛性設計豬β-防御素基因在大腸桿菌中表達，比沒有偏愛性設計的活性高了4～5倍，但作者并沒有詳細介紹其產量及活性[6]。同樣也有在畢赤酵母中表達豬β-防御素，但是表達周期太長，需要140 h左右，時間成本過大[7]。在動物方面，轉基因豬過表達豬β-防御素能抵御胸膜肺炎防線桿菌的感染[8]。本研究用枯草芽孢桿菌WB800N作為宿主，其缺少自身分泌的8種蛋白酶可以減小β-防御素被降解的概率[9-11]。枯草芽孢桿菌作為宿主菌與大腸桿菌比較有很多優點:大腸桿菌有熱源性脂多糖、易致病;有噬菌體和質粒合適于用作克隆載體;分泌蛋白能力強，大大縮短提取目的蛋白的過程;具有良好發酵基礎和生產技術。近十年來，枯草桿菌表達系統不斷被發展和完善，許多外源蛋白獲得高效表達[12]。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的sac B基因編碼的蛋白為分泌型的蔗糖果聚糖酶，此酶能催化蔗糖水解產生葡萄糖和果聚糖[13]。Sac B基因賦予細胞的蔗糖敏感特性作為一種陰性篩選克隆的標記，在生物研究中特別是在基因克隆等遺傳操作中有著廣泛的應用[14-16]。Samy Q作為一種信號肽基因可以使宿主菌表達的目的蛋白分泌到胞外，減少提取工藝。枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑以內生孢子形式存在于飼料中，能耐高溫、耐酸、耐膽鹽。研究表明，枯草芽孢桿菌進入動物腸道能迅速萌發成具有新陳代謝作用的營養型細菌，調節腸道菌群平衡、提高飼料利用率、增強動物機體免疫力，從而提高動物的健康水平[17]。

所有脊椎動物防御素(α-防御素、β-防御素、θ-防御素)有不同結構和不同的抗菌活性。人體存在α-防御素，pH會影響其活性[18];β-防御素一般在上皮組織表達[19]，在牛舌中第一次發現他的存在，人、猿、牛、齒類動物都有，豬和鳥體內只表達β-防御素[20]。豬體內的發現β-防御素都是通過基因序列分析，除了豬β-防御素1[21]。θ-防御素是防御素家族中唯一有環狀結構的多豬β-防御素2對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陽性菌有很好的抑菌效果，對從病禽體內分離出來的多重耐藥菌也有抑制作用[22]。

β-防御素通過6個半胱氨酸序列鑒定出來，CX6-C-X4-C-X9-C-X6-C-C，X代表任何氨基酸殘基，活性中心的氨基酸序列也是鑒別方法之一。豬β-防御素由30～45個氨基酸構成，5～12個帶正電荷氨基酸殘基如賴氨酸和精氨酸。典型的豬β-防御素包含一個α-螺旋和3個β-折疊[23]。該結構雖然沒有證明是否對其活性有影響，但是可以維持其穩定性防止被其他酶水解。許多假設認為影響β-防御素活性的是帶正電荷和其等電點，這樣就可以和細菌細胞膜上帶負電荷的脂多糖和磷脂相互作用增強細胞膜滲透性造成細菌死亡，也可以進入細胞和DNA、RNA結合來殺死細胞。雖然豬β-防御素在動物體內免疫機理不是很明顯，但是國內已經有人著手研究抗豬β-防御素的抗體，因抗體的特異性和靈敏度來研究豬β-防御素在豬體內的表達及一些機理[21]。

目前豬β-防御素的最新研究主要有:用精氨酸或賴氨酸代替豬β-防御素的個別氨基酸，來研究正電荷對豬β-防御素的抗菌活性影響[24]。Zn2+和L-異亮氨酸加入表達β-防御素的IPEC-J2細胞12 h后，表達β-防御素的mRNA和β-防御素含量明顯提高，在100μmol/mL Zn2SO4和25μg/mL L-異亮氨酸表達量達到最高[25]。比較眉山本地豬和雜交豬不同組織表達β-防御素的量，大多器官中眉山豬表達量要，所以其免疫力要高一些[26]。在畢赤酵母中表達豬β-防御素，但是表達量不高，活性屏蔽[27]。從最新研究進展中可以得出:雖然有大腸桿菌做宿主但是活性并沒有多理想，而畢赤酵母的生長周期太長、活性低，所以豬β-防御素在枯草芽孢桿菌中表達很有前景。未來對β-防御素的研究方向可以在基因組添加適宜的精氨酸或賴氨酸基因序列來提高其活性;在培養基中添加Zn2+和L-異亮氨酸來提高其表達量，為以后對其在體內的作用機制提供研究。

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(責任編輯 陳 虹)

High Expression of Porcineβ-defense in Bacillus subtilis

WANG Na1，LIGang2，ZOU Hui-qin2，WEN Jing2，CHEN Song2，ZHANG Hao-ran2，GOU Xing-hua1*
(1.Chengdu University，Sichuan Chengdu 610106，China;2.Sichuan Rota Bioengineering Company，Sichuan Chengdu 610063，China)

【Objective】Porcineβ-defensin(beta-defensin)is secreted by pig，and it is a smallmolecule antibacterial peptidewhich can sterilizemicrobe and regulate immunity，and also it is indispensable in pig's growth and reproduction.【Method】In this study，the orcineβ-defensin cDNA sequence based on NCBI database was synthesized，and the regulatory sequences and restriction sites were also added to the synthesized sequence.The cDNA was digested by restriction enzyme and then inserted into expression vector pHT43 for ligation，and the production of ligation was transformed into Escherichia coli DH5αfor screening of the positive expression plasmid.The pHT43-SS-BD was selected by colony PCR and gene sequencing.The recombinant plasimid was transformed into Bacillus subtilis WB800N.When recombinant strain was induced by sucrose，themolecular size of the production of inducing was identified by SDS-PAGE，and the antibacterial activity from the inducing production was determinated by inhibition test.【Result】SDS-PAGE electrophoresis results showed that the interest protein was5 KDa.Inhibition test indicated that the supernatant from the induced genetic engineering strain had antibacterial effect on both gram positive bacteria and gram negative bacteria.【Conclusion】The study achieved the high expression of porcineβ-defense in Bacillus subtilis and paved the way for overcoming source restrictions of antibacterial peptide and for application of B.subtilis.

Porcineβ-defensin;Gene expression;Antibacterial activity;Bacillus subtilis

S828

A

1001-4829(2017)8-1910-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.037

2017-01-20

成都市科技惠民技術研發項目(2015-HM01-00176-SF)

王 娜(1992-)，女，四川南充人，碩士研究生，研究方向為微生物與生化藥學，E-mail:865003651@qq.com，Tel: 18215525177，*為通訊作者:茍興華，E-mail:641615043@qq. com。