荔波瑤山雞TGFβ3基因多態性與繁殖性狀的相關性

吳松成，朱麗莉，唐繼高，伍革民

荔波瑤山雞TGFβ3基因多態性與繁殖性狀的相關性

吳松成，朱麗莉，唐繼高，伍革民*

(貴州省畜牧獸醫研究所，貴州貴陽 550005)

【目的】為探明荔波瑤山雞TGFβ3基因與繁殖性狀的關系，尋找可作為雞繁殖性狀的遺傳標記。【方法】針對TGFβ3基因設計6對引物，采用PCR測序法篩選多態位點，并利用荔波瑤山雞母系60個個體進行繁殖性狀的關聯分析?！窘Y果】荔波瑤山雞TGFβ3基因有17個多態位點，TGFβ3基因53(T→C)、1653(C→T)和1755(A→G)位點各300日齡產蛋量、首次就巢日齡、首次就巢持續時間、首次就巢至重新開產間隔和300日齡就巢次數間呈顯著或極顯著相關(P＜0.05或P＜0.01);3343(C→T)與首次就巢持續時間、首次就巢至重新開產間隔和300日齡就巢次數均呈顯著或極顯著相關(P＜0.05或P＜0.01);3540(C→T)與開產日齡、300日齡產蛋量和首次就巢持續時間均呈顯著或極顯著相關(P＜0.05或P＜0.01);4786(C→T)和7471(G→A)分別與300日齡產蛋量和首次就巢日齡均呈顯著相關(P＜0.05);7263(C→T)與首次就巢持續時間呈顯著相關(P＜0.05)?！窘Y論】TGFβ3基因53(T→C)、1653(C→T)、1755(A→G)、3343(C→T)、3540(C→T)、4786(C→T)、7263(C→T)和7471(G→A)與就巢性狀關聯顯著，可作為降低就巢性提高繁殖力的輔助選擇標記。

TGFβ3基因;基因多態位點;荔波瑤山雞;繁殖性狀

【研究意義】荔波瑤山雞是貴州省的優良地方雞品種資源之一，具有耐粗飼、抗逆性強、適應性強、肉質鮮美細嫩等特點，但因開產日齡、產蛋量、就巢性等重要經濟性能偏低限制其產業化發展[1]。因此，篩選影響荔波瑤山雞高繁殖力的主效候選基因，闡明其繁殖性狀的控制調節機理，對荔波瑤山雞優良種質資源的保護及利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】TGFβ(transforming growth factor-β，轉化生長因子-β)是TGFβ超家族成員之一，是一種二聚體多肽，相對分子量為25 kDa的蛋白，最初以無活性的前體蛋白形式合成，主要通過獨特的轉膜Ser/Thr激酶受體實施生物學應答[2]。研究表明，TGFβ存在于大多數正常細胞及組織中，廣泛參與細胞的增殖與分化、細胞外基質的產生、創傷愈合、胚胎發育、血管生成、纖維化、細胞凋亡及機體免疫系統等生理過程[3]。目前共發現5種TGFβ異構體，在哺乳動物中己鑒定出3種，分別為TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，位于不同的染色體上，但其生物學作用相似，且在氨基酸序列上具有極高的同源性，均含有7個外顯子[4]。TGFβ1在卵巢組織中高表達，與卵泡發育、顆粒細胞的增殖、分化和排卵有關[5];大白豬的TGF-β1基因多態性與產仔數間顯著關聯(P＜0. 05)[6]。TGFβ2位于卵泡膜細胞和黃體細胞中，可以調節顆粒細胞和黃體細胞中抑制素和活化素的產生[7];在豬顆粒細胞中TGFβ2會抑制FSH誘導的cAMP應答元件結合蛋白的轉錄激活[8]。TGFβ3在牛卵泡的顆粒細胞以及膜細胞中，TGFβ3mRNA的表達水平遠高于TGFβ1和TGFβ2[9];TGFβ3基因在湖羊的生殖器官表達相對較高，在高產組與低產組間差異極顯著(P＜0.01)[10]?！颈狙芯壳腥朦c】以上研究結果表明，TGFβ3在動物卵泡生長和發育過程中有十分重要的調控作用?！緮M解決的關鍵問題】采用PCR測序法篩選多態位點，并分析TGFβ3基因多態性與繁殖性狀的關聯性，尋找TGFβ3基因的多態位點作為繁殖性狀遺傳標記的可行性，以期為荔波瑤山雞的選擇性育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗雞群選自貴州省貴陽市烏當區百宜鄉洛壩村種雞場的荔波瑤山雞母雞，60只，群體一致性較好，性能較為穩定，采用常規飼養管理方式個體籠養。翅下靜脈采血1～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20℃保存，用于提取基因組DNA。

1.2 性狀測定

120日齡母雞轉入產蛋舍單個籠養至300日齡，逐個測定開產日齡、開產體重、就巢性等繁殖性狀，測定方法按照NY/T 823-2004[11]進行。

1.3 基因組DNA提取及引物設計

采用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒提取血樣中的DNA。根據GenBank中雞的TGFβ3基因序列(登錄號:NC-006092.3)，由天根生化科技有限公司合成6對引物(表1)檢測TGFβ3基因在荔波瑤山雞60個個體中的基因型遺傳變異情況。

1.4 PCR擴增及測序

PCR反應體系20μl:DNA模板1μl，上下游引物各1μl，2×Taq PCR MasterMix試劑10μl，加ddH2O至20μl。PCR反應參數:95℃預變性6 min;95℃變性30 s，特定溫度(各引物的退火溫度)退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環;最后72℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，委托諾賽基因組研究中心有限公司純化回收后進行雙向測序。

1.5 數據處理

使用DNAstar軟件對測序結果進行校正，進入基因庫網站采用BLAST分析序列SNPs，采用DNAMAN軟件分析SNPs變異導致蛋白質編碼變異情況，利用Spss18.0軟件采用單因子方差分析方法分析基因型與繁殖性狀的相關性。

表1 用于荔波瑤山雞TGFB3基因型檢測的引物信息Table 1 Primers used in detection of TGFβ3genotype in Liboyaoshan Chicken

2 結果與分析

2.1 多態位點及遺傳多態性

從表2可知，6對引物在荔波瑤山雞TGFB3基因中共檢測出17個多態位點，其中引物1檢測出2個多態位點，均位于外顯子1上;引物2檢測出2個多態位點，分別位于外顯子2和內含子2上;引物3檢測出5個多態位點，均位于內含子3上;引物4檢測出1個多態位點，位于外顯子4上;引物5檢測出4個多態位點，1個位于外顯子5上，3個位于內含子5上;引物6檢測出3個多態位點，2個位于外顯子6上，1個位于內含子5上。TGFβ3基因17個多態位點的多肽信息含量在0.06～0.38。

表2 荔波瑤山雞TGFB3基因的多態位點及其遺傳多態性Table 2 Polymorphic sites and genetic polymorphism of TGFβ3 gene in Liboyaoshan Chicken

表3 荔波瑤山雞TGFB3基因多態位點與不同繁殖性狀的關聯性Table 3 TGFβ3 gene polymorphic sites and their correlations related to different production traits in Liboyaoshan Chicken

2.2 17個多態位點與繁殖性狀的關聯性

TGFβ3基因的17個突變位點分別位于外顯子1的53(T→C)和140(T→C)，外顯子2的1653(C→T)，內含子2的1755(A→G)，內含子3的3343 (C→T)、3428(T→C)、3464(A→T)、3525(A→T)和3540(C→T)，外顯子4的4183(C→T)，外顯子5的4786(C→T)，內含子5的5019(A→G)、5039(C→T)、5066(C→T)和7214(A→G)，外顯子6的7214 (A→G)、7263(C→T)和7471(G→A)。經關聯分析，外顯子1上53(T→C)，外顯子2上的1653(C→T)，內含子2上1755(A→G)，內含子3上3343(C→T)和3540(C→T)，外顯子5上4786(C→T)，外顯子6上7263(C→T)和7471(G→A)位點分別與不同繁殖性狀存在顯著或極顯著相關(P＜0.05或P＜0.01)，其余9個突變位點與荔波瑤山雞的繁殖性狀關聯不顯著(表3)。

2.3 8個關聯位點與繁殖性狀的相關性

從表4可知，TGFβ3基因53(T→C)、1653(C→T)、1755(A→G)、3343(C→T)、3540(C→T)、4786 (C→T)、7236(C→T)和7471(G→A)8個關聯位點與繁殖性狀的相關性。其中，53(T→C)位點變異導致蛋白質第135位天冬酰胺發生同義突變[N( AUU→ACC)]。位點53變異將基因型分為TC、TT和CC，TT型的開產日齡分別比CC型和TC型晚23.17和19.85 d。CC型的300日齡產蛋量分別比TC型和CC型多49.95和54.17枚。CC型的首次就巢日齡比TC型推遲104.36 d，比TT型推遲85. 48 d。CC型的首次就巢持續時間比TT型和TC型短15.25和12.52 d;首次就巢至重新開產間隔時間比TT型和TC型短6.06和8.42 d;300日齡就巢次數比TT型和TC型少2.06和2.51次。

1653(C→T)位點變異導致蛋白質第209位精氨酸發生同義突變[R(CGC→CGT)]，CT型的300日齡產蛋量分別比CC型少61.43枚，比TT型少34.43枚;試驗期間CC型個體母雞未表現出就巢行為，因此CC型的首次就巢日齡、首次就巢日齡持續時間、首次就巢至重新開產間隔時間、300日齡就巢次數均與CT型和TT型呈極顯著差異。1755(A→G)位點GG型的300日齡產蛋量分別比AG型和AA型多59.92和43.27枚;首次就巢日齡分別比AG型和AA型晚152.50和106.11 d;首次就巢至重新開產間隔分別比AG型和AA型早7.15和7. 19 d;300日齡就巢次數分別比AG型和AA型少2. 22和2.02次。3343(C→T)位點C型的首次就巢持續時間分別比CT型和TT型短9.16和10.14 d;首次就巢至重新開產間隔分別比CT型和TT型短5.86和5.93 d;300日齡就巢次數分別比CT型和TT型少1.54和1.92次。3540(C→T)位點TT型的開產日齡分別比CT型和CC型晚18.5和30.66 d;300日齡產蛋量分比CT型和CC型少27.77和 24.77枚;首次就巢持續時間比CC型長15.78 d。4786(C→T)位點變異導致蛋白質第322位異亮氨酸發生同義突變[I(AUU→AUC)];CC型的300日齡產蛋量分比CT型和TT型少56.47和46.75枚;

首次就巢日齡分別比CT型和TT型晚82.17和57. 33 d。7263(C→T)位點變異導致蛋白質第322位脯氨酸發生同義突變〔P(CCC→CCU)〕，CT型的首次就巢持續時間比TT型長11.53 d。7471(G→A)位點AA型的300日齡產蛋量分比GG型和GA型少58.00和54.07枚;首次就巢日齡分別比GG型和GA型晚87.09和71.67 d。

表4 荔波瑤山雞TGFB3基因8個關聯位點與不同繁殖性狀的相關性Table 4 Correlations between 8 relevant sites of TGFB3 gene and different production traits in Liboyaoshan Chicken

3 討 論

目前，對雞TGFβ3基因的研究主要在雞的肌肉脂肪沉積、肝臟代謝和雞蛋殼強度的相關性方面，如TGFβ3基因對文昌雞蛋殼強度有顯著影響(加性作用)，T2T2基因型個體比T1T1基因型的蛋殼強度值高15.45%(P＜0.05)，比T1T2基因型高12.50 %(P＜0.05);TGFβ3基因對蛋殼強度以加性方式作用，其加性效應值為0.209(P＜0.05)[12]。TGF β3與Wnt-10α和Catenin-β等細胞外信號因子，協同調控IMF在矮小型雞肌肉組織中沉積的信號通路中發揮了重要作用[13]。通過雞細胞系過表達miR-122證明其對TGFβ3的調控在mRNA水平，表明miR-122可能通過調控TGF-β3基因在雞肝臟代謝中發揮調控作用[14]。目前，尚未見TGFβ3基因核苷酸變異與雞就巢性、產蛋量等繁殖性狀的相關性報道。研究表明，荔波瑤山雞TGFB3基因上53 (T→C)、1653(C→T)、1755(A→G)、3540(C→T)、4786(C→T)和7471(G→A)6個SNP變異位點不同基因型間的300日齡產蛋量、首次就巢持續時間存在顯著或極顯著相關，該基因可作為繁殖性狀標記輔助選育的候選基因。

4 結 論

荔波瑤山雞TGFβ3基因有17個SNP，其中53 (T→C)、1653(C→T)、1755(A→G)、3343(C→T)、3540(C→T)、4786(C→T)、7263(C→T)和7471(G→A)8個多態位點與荔波瑤山雞繁殖性狀存在顯著或極顯著相關(P＜0.05或P＜0.01);外顯子1、外顯子2、外顯子5和外顯子6上各自存在1個SNP位點引起相應編碼氨基酸種類的改變。荔波瑤山雞TGFβ3基因的多態性與產蛋量呈顯著或極顯著相關(P＜0.05或P＜0.01)，該基因可能是影響其產蛋量的主效基因或與主效基因緊密連鎖的標記基因，可作為繁殖性狀標記輔助選育的候選基因。

[1]朱麗莉徐龍鑫伍革民，等.多巴胺受體基因多態性及其與雞繁殖性狀的相關性[J].西南農業學報，2016(7):1735-1742.

[2]ARMSTRONG D G，WEBB R.Ovarian follieular dominance:the role of intraovarian growth faetors and novel proteins[J].Reproduction，1997，2(3):139-146.

[3]MOUSTAKASA，HELDIN C H.Non-Smad TGF-beta singnals[J].J CELL Sci，2005，118(pt16):3537-3584.

[4]BLOBEG C，SCHIERMANN W P，LODISH H F.Role of transforming growth factor beta in human disease[J].N Eng JMed，2000，342:1350-1358.

[5]PANGAS S A.Regulation of the ovarian reserve by members of the transforming growth factor beta family[J].Molecular Reproduction and Development，2012，79:666-679.

[6]WU Y P，WANGA G，LIN，etal.Association with TGF-β1 gene polymorphisms and reproductive performance of large white pig[J].Reproduction in Domestic Animal，2010，45(6):1028-1032.

[7]KNIGHT P G，GLISTER C.Local roles of TGF-beta superfamily members in the control of ovarian follicle development[J].Animal Reproduction Science，2003，78:65-183.

[8]HE P J，FUJIMOTO Y，YAMAUCHIN，etal.Real-timemonitoring of cAMP response elementbinding protein signaling in porcine granulosa cellsmodulated by ovarian factors[J].Mol Cell Biochem，2006，290: 177-184.

[9]NILSSON E E，DORAISWAMY V，SKINNER M K.Transforming growth factor-beta isoform expression during bovine ovarian antral follicle development[J].Mol Reprod Dev，2003，66:237-246.

[10]徐業芬.Smad信號轉導通路相關基因表達與湖羊高繁殖力關系的研究[D].南京:南京農業大學，2010.

[11]江蘇省家禽科學研究所，揚州大學畜牧獸醫學院.家禽生產性能名詞術語和度量統計方法:NY/T 823-2004[S].北京:中國農業出版社，2006.

[12]吳 旭.文昌雞產蛋性能及蛋品質性狀分子標記的研究[D].揚州:揚州大學，2006.

[13]牟和平，林樹茂，葉亞瓊，等.Wnt-10a/Catenin-β及TGFβ3下調促進矮小型雞肌內脂肪沉積[A]//中國畜牧獸醫學會動物解剖學及組織胚胎學分會第十七次學術研討會議論文集[C].太谷:中國畜牧獸醫學會，2012.

[14]王星果.雞肝臟和骨骼肌iriiRNA表達和功能研究[D].揚州:揚州大學，2013.

(責任編輯 馮 衛)

TGFβ3 Gene Polymorphism and Correlations between TGFβ3 Gene and Reproduction Traits in Liboyaoshan Chicken

WU Song-cheng，ZHU Li-li，TANG Ji-gao，WU Ge-min*
(Institute of Animal Husbandry and Veterinary in Guizhou Academy of Agricultural Science，Guizhou Guiyang 550005，China)

【Objective】This study aimed to explore the correlations between TGFβ3 gene and reproduction traits in Liboyaoshan Chicken and seek geneticmarketsof chicken reproduction trait.【Method】The correlationsbetween TGFβ3 gene and reproduction traitsare determined by analyzing 60 Liboyaoshan hens based on PCR technology.【Result】There are17 polymorphic sites in TGFβ3 gene of Liboyaoshan Chicken. 53(T→C)，1653(C→T)and 1755(A→G)sites are related to total egg number from 120 to 300 d age(EN300)，age at first broodiness behavior(AFBB)，duration of age at first broodiness behavior(DAFBB)，interval of age at first broodiness behavior between anew laying (IAFBBA)and times of broodiness behavior from 120 to300 d of age(TBB300)significantly or very significantly.3343(C→T)site is related to AFBB，IAFBBA and TBB300 significantly or very significantly.3540(C→T)site is related to AFE，EN300 and DAFBB significantly or very significantly.4786(C→T)and 7471(G→A)site is significantly related to EN300 and DAFBB respectively.7263(C→T) site is related to DAFBB significantly.【Conclusion】53(T→C)，1653(C→T)，1755(A→G)，3343(C→T)，3540(C→T)，4786(C→T)，7263(C→T)and 7471(G→A)sites of TGFβ3 gene are significantly related to reproduction traits，which indicates that these polymorphic sites can be used as assistant selection markers for improvement of reproductive capacity of Liboyaoshan Chicken.

TGFβ3 gene;Polymorphic site;Liboyaoshan Chicken;Reproduction trait

S831

A

1001-4829(2017)8-1823-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.040

2016-11-29

貴州省聯合基金項目“瑤山雞ONECUT1基因的CDS區克隆、差異表達及與生產性狀關聯分析”[黔科合LH字(2015)7067];貴州省基金項目“瑤山雞就巢性選育關鍵基因篩選”[黔科合J字(2014)2102];貴州省農業動植物育種項目“瑤山雞新品系選育”[黔農育專字(2014)008];貴州省農業科學院2014年博士基金項目“瑤山雞STAT5基因變異檢測及與產蛋性狀關聯分析”

吳松成(1966-)，男，貴州荔波人，學士，助理研究員，從事家禽遺傳育種與養殖技術研究，E-mail:13885151440@ 163.com，Tel:13885151440，*為通訊作者:伍革民，E-mail:wgmabcdef@163.com。