番茄SSR遺傳多樣性及其品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

黃 靜，王 苓，江 衛(wèi)，葉仕倫

番茄SSR遺傳多樣性及其品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

黃 靜，王 苓，江 衛(wèi)，葉仕倫*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所，四川成都 610300;2.蔬菜種質(zhì)與品種改良四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610066;3.農(nóng)業(yè)部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066)

【目的】本文旨在分析番茄資源材料的親緣關(guān)系及它們的遺傳多樣性，挖掘與番茄品質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。【方法】選用37對(duì)SSR多態(tài)性引物對(duì)30份番茄資源材料進(jìn)行聚類分析，在此基礎(chǔ)上采用Tassel3.0GLM方法進(jìn)行標(biāo)記位點(diǎn)與品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析。【結(jié)果】SSR結(jié)果顯示，37對(duì)SSR引物共檢測到102個(gè)等位變異位點(diǎn)，各種質(zhì)遺傳相似系數(shù)為0.61～0.97。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明與品種性狀顯著相關(guān)的位點(diǎn)有9個(gè)。供試材料之間有一定的遺傳差異，但遺傳背景較狹窄。【結(jié)論】利用SSR標(biāo)記分析了30份番茄資源材料的遺傳多樣性，30份番茄資源材料在遺傳相似系數(shù)0.71處被劃分為4大類，并通過關(guān)聯(lián)分析模型，找到了9個(gè)與總酸、成熟前果色、成熟果色、果面棱溝、番茄紅素相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。

番茄;遺傳多樣性;SSR;關(guān)聯(lián)分析

【研究意義】番茄(Solanum lycopersicum，Tomato)，別名西紅柿、洋柿子，屬茄科(SoLanaceae)番茄屬，原產(chǎn)南美洲西部太平洋沿岸安第斯山脈的秘魯、厄瓜多爾、玻利維亞、智利等國的高原或谷地[1]。是世界上重要的蔬菜作物之一。因SSR具有較高的多態(tài)性、共顯性分離、位點(diǎn)專化性、標(biāo)記覆蓋整個(gè)基因組且分布均勻、DNA樣本用量少、技術(shù)簡便易操作、重復(fù)性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)在小麥[2]、大豆[3]、玉米[4]等主要作物中廣泛用來構(gòu)建連鎖遺傳圖譜、進(jìn)行遺傳多樣性和分子標(biāo)記等研究。【前人研究進(jìn)展】在番茄方面，應(yīng)用SSR分析番茄材料的遺傳變異、構(gòu)建遺傳連鎖圖和分子標(biāo)記的研究也較多，以番茄敏感材料01137和耐熱材料CLN2001A雜交產(chǎn)生的F2單株為作圖群體，應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)篩選得到一個(gè)SSR標(biāo)記[5]。采用18對(duì)SSR多態(tài)性引物對(duì)20份番茄種質(zhì)資源材料進(jìn)行分析，擴(kuò)增出66條譜帶中有52條具有多態(tài)性，多態(tài)率為78.8%，以遺傳相似系數(shù)0.67為標(biāo)準(zhǔn)將20份番茄育種材料劃分為4大類[6]。但利用SSR分子標(biāo)記結(jié)合番茄品質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的報(bào)道還很少。【本研究切入點(diǎn)】本研究采用SSR標(biāo)記對(duì)30個(gè)番茄種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，同時(shí)通過分子標(biāo)記與品質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】旨在為番茄的親本選擇提供依據(jù)，進(jìn)一步探討與品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記位點(diǎn)，為培育高品質(zhì)的番茄提供理論基礎(chǔ)。

表1 30份番茄材料及其相關(guān)信息Table 1 30 tested tomato varieties and their relative information

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)選用了30份不同類型的番茄資源材料，于2014年3月初播種育苗，4月中旬定植于四川省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所姚渡基地大田中。供試材料的編號(hào)和特征農(nóng)藝性狀見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 番茄果實(shí)品質(zhì)性狀調(diào)查與測定 2014年5 -7月對(duì)番茄果實(shí)的品質(zhì)性狀進(jìn)行了調(diào)查和測定。與番茄果實(shí)有關(guān)品質(zhì)性狀大致可分為外觀品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)兩大類，本試驗(yàn)調(diào)查測定的外觀品質(zhì)有果橫徑、果縱徑、果形指數(shù)、果梗洼大小、果柄長度、果肩有無、果色(成熟前果色、成熟果色)和單果質(zhì)量、果實(shí)硬度、果面棱溝、果肉厚、心室數(shù)，方法參照《番茄種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[7]進(jìn)行;營養(yǎng)品質(zhì)有可溶性總糖含量、有機(jī)酸含量和糖酸比、可溶性固形物含量、番茄紅素含量、抗壞血酸含量，其中可溶性總糖的測定采用硫酸-蒽酮法，有機(jī)酸的測定采用酸堿滴定法，可溶性固形物的含量采用折光儀測定，番茄紅素的測定采用紫外-可見分光光度法，抗壞血酸的測定采用鉬藍(lán)比色法[8]。

1.2.2 SSR引物選擇 本試驗(yàn)SSR引物選自NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]，由上海生工生物工程股份有限公司合成。從120對(duì)SSR引物中篩選到37對(duì)多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物。

1.2.3 DNA的提取 本試驗(yàn)采用簡化CTAB法進(jìn)行DNA提取，取幼嫩番茄葉片0.1～0.3 g于2 mL離心管中，液氮速凍后研磨成粉末;快速加入65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液650μl，混勻后置于65℃水浴保溫30 min，其間不斷輕搖，顛倒混勻;冷卻至室溫加入700μl(氯仿-異戊醇(24∶1)，顛倒混勻5 min;4℃，12 000 r/min，離心15 min，吸取上清入另一離心管中，加入2倍體積的-20℃預(yù)冷的無水乙醇，緩慢混勻，-20℃放置30 min;4℃，12 000 r/ min，離心5 min，棄上清;用-20℃預(yù)冷的70%乙醇清洗沉淀2次，室溫風(fēng)干，用100μl TE溶解樣品DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

1.2.4 SSR基本程序 擴(kuò)增反應(yīng)使用BIO-RAD PCR儀，Taq酶使用購自北京康為世紀(jì)科技有限公司的2×Taq MasterMix。反應(yīng)總體積10μl:模板DNA 1μl(20～40μl/ng)，上下游引物各0.4μl(10 nmol/μl)，2×Taq MasterMix 5μl，ddH2O 3.2μl。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染顯色拍照[11]。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用人工讀膠的方法，有帶的讀1，無帶的讀0，不確定的記為-9。利用NTSYSpc2.10軟件中的Qualitativedate計(jì)算材料間的遺傳相似系數(shù)(Jaccard系數(shù))，采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，并繪制樹狀聚類圖。采用TASSEL3.0[12]中的GLM(General linearmodel)模型結(jié)合分子標(biāo)記數(shù)據(jù)和品質(zhì)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)記-性狀的關(guān)聯(lián)分析，確定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄群體SSR分子標(biāo)記多態(tài)性分析

在120對(duì)SSR引物中選擇了37對(duì)多態(tài)性效果好的引物，利用這些引物對(duì)30份番茄材料基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，SSR多態(tài)性引物及擴(kuò)增多態(tài)性結(jié)果列于表2。37對(duì)SSR引物在30份材料中共檢測到102個(gè)等位變異。變化范圍2～7個(gè)等位變異，其中引物Tom236-237檢測出的等位變異最多，達(dá)到7個(gè)。Tom236-237擴(kuò)增的SSR圖譜如圖1。

表2 SSR引物及擴(kuò)增多態(tài)性Table 2 SSR primers used in the experiment and numbers of polymorphic bands amplified

圖1 SSR標(biāo)記在30份材料中的DNA擴(kuò)增Fig.1 Amplification with SSR primer Tom236-237 for 30 tomato varieties

2.2 番茄種質(zhì)材料的聚類分析

利用37對(duì)SSR引物對(duì)番茄材料進(jìn)行鑒定，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，聚類樹狀圖結(jié)果(圖2)顯示，在相似系數(shù)0.71處30份番茄材料可分為4大類。第1大類包含4份材料，第2大類包含2份材料，大多數(shù)材料集中在第3大類，包含了22份材料，第4大類包含2份材料。30份番茄材料的遺傳相似系數(shù)分布在0.61～0.97，表明不同番茄材料之間有一定差異，但差異不大，各材料之間親緣關(guān)系較近，遺傳背景較窄[13]。

2.3 SSR標(biāo)記與品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

從表3可看出，檢測37對(duì)SSR引物，有9對(duì)引物的9個(gè)位點(diǎn)與品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)，其中與總酸相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有3個(gè)，與成熟前果色、成熟果色、果面棱溝相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有各有2個(gè)，與番茄紅素相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有1個(gè)。

3 討 論

3.1 番茄遺傳多樣性分析

SSR分子標(biāo)記是鑒定番茄材料親緣關(guān)系有效途徑之一，本研究用37對(duì)SSR多態(tài)性引物對(duì)30份番茄材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，在一定程度上反應(yīng)了30份材料的親緣關(guān)系，聚類分析結(jié)果顯示遺傳相似系數(shù)分布在0.61～0.97，以遺傳相似系數(shù)0.71為標(biāo)準(zhǔn)將30份番茄育種材料劃分為4大類。結(jié)果表明這些番茄材料在分子水平上遺傳差異不大，遺傳背景較狹窄，這個(gè)問題在番茄育種中普遍存在，因此亟需加強(qiáng)新種質(zhì)資源材料的引進(jìn)從而豐富育種基礎(chǔ)。從聚類樹狀圖中觀察到7和9號(hào)番茄材料未分離開，分析其原因可能就是沒有篩選到合適的引物，導(dǎo)致這2份材料無法分開，因此在進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析遺傳多樣性時(shí)，需要足夠多的多態(tài)性位點(diǎn)，并且這些位點(diǎn)要盡量均勻的覆蓋整個(gè)基因組[14]。

圖2 30份番茄材料UPGMA聚類圖Fig.2 Dendrogram of 30 tomato varieties by SSR-UPGMA based on genetic similarities

表3 與品質(zhì)性狀顯著相關(guān)的SSR標(biāo)記Table 3 SSR loci significantly associated with agronomic traits of tomato

3.2 番茄SSR分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

關(guān)聯(lián)分析(Association analysis)，又稱關(guān)聯(lián)作圖(Association mapping)，目前關(guān)聯(lián)分析在作物方面主要用在小麥[15]、玉米[16]、水稻[17]、棉花[18]等。利用SSR標(biāo)記分析113份大麥親本材料的遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)，并通過2種關(guān)聯(lián)分析模型，分別尋找到了9個(gè)與株高、穗長、芒長、穗粒數(shù)相關(guān)聯(lián)，6個(gè)與株高、芒長和小穗著生密度相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記[19]。本研究在37對(duì)引物上共檢測9對(duì)引物的9個(gè)位點(diǎn)與番茄的5個(gè)品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，存在同一個(gè)性狀與多個(gè)位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的情況，原因可能是番茄的許多品質(zhì)性狀均屬于多個(gè)基因控制的數(shù)量性狀[13]。

4 結(jié) 論

利用SSR標(biāo)記分析了30份番茄資源材料的遺傳多樣性，30份番茄資源材料在遺傳相似系數(shù)0.71處被劃分為4大類，并通過關(guān)聯(lián)分析模型，在37對(duì)引物上共檢查到9個(gè)位點(diǎn)與番茄總酸、成熟前果色、成熟果色、果面棱溝、番茄紅素相關(guān)聯(lián)。其中位點(diǎn)SSR320-2、SSR276-2、SSR244-1與總酸顯著相關(guān)(P＜0.05)，表型變異解釋率為38.32%，位點(diǎn)SSR32-2、SSR139-3與果面棱溝顯著相關(guān)(P＜0.05)，表型變異解釋率分別為37.54%，47.13%，位點(diǎn)SSR63-4與番茄紅素顯著相關(guān)(P＜0.05)，表型變異解釋率為38.26%。

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(責(zé)任編輯 陳 虹)

Genetic Diversity of Tomato Revealed by SSR M arkers and Its Association w ith Quality Traits

HUANG Jing，WANG Ling，JIANGWei，YE Shi-lun*
(1.Industrial Crops Research Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610300，China;2.Vegetable Germplasm Innovation and Variety Improvement Key Laboratory of Sichuan Province，Sichuan Chengdu 610066，China;3.Sichuan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops(Southwest Region)，Ministry of Agriculture，Sichuan Chengdu 610066，China)

【Objective】The present paper aimed to analyze tomato genetic diversity and reveal the molecularmarker loci related to tomato quality traits.【Method】A total of 37 simple sequence repeat(SSR)markerswere selected for the polymorphism detection of 30 materials，and based on cluster analysis，the association betweenmarker locus and quality trait by Tassel3.0 GLM program were analyzed.【Result】A total of102 allelics variations from 37 SSRmarkerswere detected，and the genetic similarity coefficients of their germplasms ranged from 0. 61 to 0.97.Tassel3.0 general linearmodel showed thata total of9 lociwere significantly correlated with 5 quality traits.There were genetic diversities among these tomatomaterials，but the genetic basis was narrow.【Conclusion】The genetic diversities of 30 tomato resources were analyzed by SSR markers.Thirty tomato resources were divided into four groups at the genetic similarity coefficient of 0.71.There were 9 SSR markers associated with total acid，mature color，ripe fruit color，fruit face furrow and lycopene under GLM program.

Tomato;Genetic diversity;Simple sequence repeat(SSR);Association analysis

S641.2

A

1001-4829(2017)8-1867-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.029

2016-09-13

四川省財(cái)政創(chuàng)新能力提升工程青年基金項(xiàng)目(2014QNJJ-004)

黃 靜(1985-)，女，四川雙流人，碩士，從事番茄育種與栽培研究，E-mail:2464790707@qq.com，Tel:13550202776，*為通訊作者，E-mail:kwww163@163.com。