番茄SSR遺傳多樣性及其品質性狀的關聯分析

黃 靜，王 苓，江 衛，葉仕倫

番茄SSR遺傳多樣性及其品質性狀的關聯分析

黃 靜，王 苓，江 衛，葉仕倫*

(1.四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所，四川成都 610300;2.蔬菜種質與品種改良四川省重點實驗室，四川成都610066;3.農業部西南地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，四川成都 610066)

【目的】本文旨在分析番茄資源材料的親緣關系及它們的遺傳多樣性，挖掘與番茄品質性狀相關的分子標記。【方法】選用37對SSR多態性引物對30份番茄資源材料進行聚類分析，在此基礎上采用Tassel3.0GLM方法進行標記位點與品質性狀的關聯分析。【結果】SSR結果顯示，37對SSR引物共檢測到102個等位變異位點，各種質遺傳相似系數為0.61～0.97。關聯分析結果表明與品種性狀顯著相關的位點有9個。供試材料之間有一定的遺傳差異，但遺傳背景較狹窄。【結論】利用SSR標記分析了30份番茄資源材料的遺傳多樣性，30份番茄資源材料在遺傳相似系數0.71處被劃分為4大類，并通過關聯分析模型，找到了9個與總酸、成熟前果色、成熟果色、果面棱溝、番茄紅素相關聯的標記。

番茄;遺傳多樣性;SSR;關聯分析

【研究意義】番茄(Solanum lycopersicum，Tomato)，別名西紅柿、洋柿子，屬茄科(SoLanaceae)番茄屬，原產南美洲西部太平洋沿岸安第斯山脈的秘魯、厄瓜多爾、玻利維亞、智利等國的高原或谷地[1]。是世界上重要的蔬菜作物之一。因SSR具有較高的多態性、共顯性分離、位點專化性、標記覆蓋整個基因組且分布均勻、DNA樣本用量少、技術簡便易操作、重復性和穩定性好等優點在小麥[2]、大豆[3]、玉米[4]等主要作物中廣泛用來構建連鎖遺傳圖譜、進行遺傳多樣性和分子標記等研究。【前人研究進展】在番茄方面，應用SSR分析番茄材料的遺傳變異、構建遺傳連鎖圖和分子標記的研究也較多，以番茄敏感材料01137和耐熱材料CLN2001A雜交產生的F2單株為作圖群體，應用SSR分子標記技術篩選得到一個SSR標記[5]。采用18對SSR多態性引物對20份番茄種質資源材料進行分析，擴增出66條譜帶中有52條具有多態性，多態率為78.8%，以遺傳相似系數0.67為標準將20份番茄育種材料劃分為4大類[6]。但利用SSR分子標記結合番茄品質性狀進行關聯分析的報道還很少。【本研究切入點】本研究采用SSR標記對30個番茄種質資源進行遺傳多樣性分析，同時通過分子標記與品質性狀關聯分析。【擬解決的關鍵問題】旨在為番茄的親本選擇提供依據，進一步探討與品質性狀相關聯的分子標記位點，為培育高品質的番茄提供理論基礎。

表1 30份番茄材料及其相關信息Table 1 30 tested tomato varieties and their relative information

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗選用了30份不同類型的番茄資源材料，于2014年3月初播種育苗，4月中旬定植于四川省農科院經濟作物育種栽培研究所姚渡基地大田中。供試材料的編號和特征農藝性狀見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄果實品質性狀調查與測定 2014年5 -7月對番茄果實的品質性狀進行了調查和測定。與番茄果實有關品質性狀大致可分為外觀品質和營養品質兩大類，本試驗調查測定的外觀品質有果橫徑、果縱徑、果形指數、果梗洼大小、果柄長度、果肩有無、果色(成熟前果色、成熟果色)和單果質量、果實硬度、果面棱溝、果肉厚、心室數，方法參照《番茄種質資源描述規范和數據標準》[7]進行;營養品質有可溶性總糖含量、有機酸含量和糖酸比、可溶性固形物含量、番茄紅素含量、抗壞血酸含量，其中可溶性總糖的測定采用硫酸-蒽酮法，有機酸的測定采用酸堿滴定法，可溶性固形物的含量采用折光儀測定，番茄紅素的測定采用紫外-可見分光光度法，抗壞血酸的測定采用鉬藍比色法[8]。

1.2.2 SSR引物選擇 本試驗SSR引物選自NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及相關文獻[9-10]，由上海生工生物工程股份有限公司合成。從120對SSR引物中篩選到37對多態性高、重復性好的引物。

1.2.3 DNA的提取 本試驗采用簡化CTAB法進行DNA提取，取幼嫩番茄葉片0.1～0.3 g于2 mL離心管中，液氮速凍后研磨成粉末;快速加入65℃預熱的CTAB提取緩沖液650μl，混勻后置于65℃水浴保溫30 min，其間不斷輕搖，顛倒混勻;冷卻至室溫加入700μl(氯仿-異戊醇(24∶1)，顛倒混勻5 min;4℃，12 000 r/min，離心15 min，吸取上清入另一離心管中，加入2倍體積的-20℃預冷的無水乙醇，緩慢混勻，-20℃放置30 min;4℃，12 000 r/ min，離心5 min，棄上清;用-20℃預冷的70%乙醇清洗沉淀2次，室溫風干，用100μl TE溶解樣品DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。

1.2.4 SSR基本程序 擴增反應使用BIO-RAD PCR儀，Taq酶使用購自北京康為世紀科技有限公司的2×Taq MasterMix。反應總體積10μl:模板DNA 1μl(20～40μl/ng)，上下游引物各0.4μl(10 nmol/μl)，2×Taq MasterMix 5μl，ddH2O 3.2μl。反應程序:95℃預變性3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，35個循環后，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產物在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染顯色拍照[11]。

1.2.5 數據統計分析 采用人工讀膠的方法，有帶的讀1，無帶的讀0，不確定的記為-9。利用NTSYSpc2.10軟件中的Qualitativedate計算材料間的遺傳相似系數(Jaccard系數)，采用UPGMA法進行聚類分析，并繪制樹狀聚類圖。采用TASSEL3.0[12]中的GLM(General linearmodel)模型結合分子標記數據和品質性狀數據進行標記-性狀的關聯分析，確定關聯位點。

2 結果與分析

2.1 番茄群體SSR分子標記多態性分析

在120對SSR引物中選擇了37對多態性效果好的引物，利用這些引物對30份番茄材料基因組DNA進行PCR擴增反應，SSR多態性引物及擴增多態性結果列于表2。37對SSR引物在30份材料中共檢測到102個等位變異。變化范圍2～7個等位變異，其中引物Tom236-237檢測出的等位變異最多，達到7個。Tom236-237擴增的SSR圖譜如圖1。

表2 SSR引物及擴增多態性Table 2 SSR primers used in the experiment and numbers of polymorphic bands amplified

圖1 SSR標記在30份材料中的DNA擴增Fig.1 Amplification with SSR primer Tom236-237 for 30 tomato varieties

2.2 番茄種質材料的聚類分析

利用37對SSR引物對番茄材料進行鑒定，對數據進行聚類分析，聚類樹狀圖結果(圖2)顯示，在相似系數0.71處30份番茄材料可分為4大類。第1大類包含4份材料，第2大類包含2份材料，大多數材料集中在第3大類，包含了22份材料，第4大類包含2份材料。30份番茄材料的遺傳相似系數分布在0.61～0.97，表明不同番茄材料之間有一定差異，但差異不大，各材料之間親緣關系較近，遺傳背景較窄[13]。

2.3 SSR標記與品質性狀的關聯分析

從表3可看出，檢測37對SSR引物，有9對引物的9個位點與品質性狀相關聯，其中與總酸相關聯的位點有3個，與成熟前果色、成熟果色、果面棱溝相關聯的位點有各有2個，與番茄紅素相關聯的位點有1個。

3 討 論

3.1 番茄遺傳多樣性分析

SSR分子標記是鑒定番茄材料親緣關系有效途徑之一，本研究用37對SSR多態性引物對30份番茄材料進行遺傳多樣性分析，在一定程度上反應了30份材料的親緣關系，聚類分析結果顯示遺傳相似系數分布在0.61～0.97，以遺傳相似系數0.71為標準將30份番茄育種材料劃分為4大類。結果表明這些番茄材料在分子水平上遺傳差異不大，遺傳背景較狹窄，這個問題在番茄育種中普遍存在，因此亟需加強新種質資源材料的引進從而豐富育種基礎。從聚類樹狀圖中觀察到7和9號番茄材料未分離開，分析其原因可能就是沒有篩選到合適的引物，導致這2份材料無法分開，因此在進行SSR分子標記分析遺傳多樣性時，需要足夠多的多態性位點，并且這些位點要盡量均勻的覆蓋整個基因組[14]。

圖2 30份番茄材料UPGMA聚類圖Fig.2 Dendrogram of 30 tomato varieties by SSR-UPGMA based on genetic similarities

表3 與品質性狀顯著相關的SSR標記Table 3 SSR loci significantly associated with agronomic traits of tomato

3.2 番茄SSR分子標記的關聯分析

關聯分析(Association analysis)，又稱關聯作圖(Association mapping)，目前關聯分析在作物方面主要用在小麥[15]、玉米[16]、水稻[17]、棉花[18]等。利用SSR標記分析113份大麥親本材料的遺傳多樣性及群體遺傳結構，并通過2種關聯分析模型，分別尋找到了9個與株高、穗長、芒長、穗粒數相關聯，6個與株高、芒長和小穗著生密度相關聯的標記[19]。本研究在37對引物上共檢測9對引物的9個位點與番茄的5個品質性狀相關聯，分析結果發現，存在同一個性狀與多個位點相關聯的情況，原因可能是番茄的許多品質性狀均屬于多個基因控制的數量性狀[13]。

4 結 論

利用SSR標記分析了30份番茄資源材料的遺傳多樣性，30份番茄資源材料在遺傳相似系數0.71處被劃分為4大類，并通過關聯分析模型，在37對引物上共檢查到9個位點與番茄總酸、成熟前果色、成熟果色、果面棱溝、番茄紅素相關聯。其中位點SSR320-2、SSR276-2、SSR244-1與總酸顯著相關(P＜0.05)，表型變異解釋率為38.32%，位點SSR32-2、SSR139-3與果面棱溝顯著相關(P＜0.05)，表型變異解釋率分別為37.54%，47.13%，位點SSR63-4與番茄紅素顯著相關(P＜0.05)，表型變異解釋率為38.26%。

[1]余延年，吳定華，陳竹君，等.番茄遺傳學[M].長沙:湖南科技出版社，1999.

[2]陳新民，何中虎，史建榮.利用SSR標記進行優質冬小麥品種(系)的遺傳多樣性研究[J].作物學報，2003，29(1):13-19.

[3]海 林，王克晶，楊 凱.半野生大豆種質資源SSR位點遺傳多樣性分析[J].西北植物學報，2002，22(4):751-757.

[4]Smith J S.An evaluation of the utility of SSR loci.As molecular marker sinmaize(Zea mays L.):comparison with data from RFLP sand pedigree[J].Theor Appl Genet，1997，95(1-2):163-173.

[5]許向陽，王冬梅，康立功，等.番茄耐熱性相關的SSR和RAPD標記篩選[J].園藝學報，2008，35(1):47-52.

[6]丘漫宇，張素平，郭 爽，等.番茄種質資源親緣關系的SSR分析[J].中國蔬菜，2012(24):39-42.

[7]李錫香，杜永臣.番茄種質資源描述規范和數據標準[M].北京:中國農業出版社，2006:51-71.

[8]劉紹俊，牛 英，劉冰浩，等.鉬藍比色法測定沙田柚果肉中還原型維生素C含量的研究[J].北方園藝，2011(1):8-12.

[9]Segers R P，Kenter T，deHaan L A，et al.Characterization of the gene encoding suilysin from Streptococcus suis and expression in field strains[J].FEMSMicrobiolLett，1998，167(2):255-261.

[10]Silva L M，Baums C G，Rehm T，et al.Virulence-associated gene profiling of Streptococcus suis isolates by PCR[J].Vet Microbiol，2006，115(1-3):117-127.

[11]駱晚俠，張 李，楊 凱，等.小豆SSR分子標記遺傳連鎖圖譜構建[J].中國農業科學，2013，46(17):3534-3544.

[12]BRADURYPJ，ZHANGZW，KROONDE，et al.TASSEL:software for association mapping of complex traits in diverse samples[J]. Bioinformatics，2007，23:2633-2635.

[13]馮英娜，柳李旺，劉衛東，等.茄子SSR遺傳多樣性及其農藝性狀的關聯分析[J].江蘇農業學報，2014，30(4):839-847.

[14]宋 建，陳 杰，陳火英，等.利用SSR分子標記分析番茄的遺傳多樣性[J].上海交通大學學報(農業科學版)，2006，24(6): 524-528.

[15]賴 勇，王鵬喜，范貴強，等.大麥SSR標記遺傳多樣性及其與農藝性狀關聯分析[J].中國農業科學2013，46(2):233-242.

[16]文陽平，賀浩華，王建革，等.關聯分析及其在玉米中的研究進展[J].安徽農業科學，2009，37(19):8947-8949，8956.

[17]張斐斐，楊雅云，董 超，等.關聯分析及其在水稻遺傳研究中的應用[J].云南農業大學學報，2014，29(5):752-758.

[18]聶新輝，尤春源，鮑 健，等.基于關聯分析的新陸早棉花品種農藝和纖維品質性狀優異等位基因挖掘[J].中國農業科學，2015，48(15):2891-2910.

[19]賴 勇，王鵬喜，范貴強，等.大麥SSR標記遺傳多樣性及其與農藝性狀關聯分析[J].中國農業科學，2013，46(2):233-242.

(責任編輯 陳 虹)

Genetic Diversity of Tomato Revealed by SSR M arkers and Its Association w ith Quality Traits

HUANG Jing，WANG Ling，JIANGWei，YE Shi-lun*
(1.Industrial Crops Research Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610300，China;2.Vegetable Germplasm Innovation and Variety Improvement Key Laboratory of Sichuan Province，Sichuan Chengdu 610066，China;3.Sichuan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops(Southwest Region)，Ministry of Agriculture，Sichuan Chengdu 610066，China)

【Objective】The present paper aimed to analyze tomato genetic diversity and reveal the molecularmarker loci related to tomato quality traits.【Method】A total of 37 simple sequence repeat(SSR)markerswere selected for the polymorphism detection of 30 materials，and based on cluster analysis，the association betweenmarker locus and quality trait by Tassel3.0 GLM program were analyzed.【Result】A total of102 allelics variations from 37 SSRmarkerswere detected，and the genetic similarity coefficients of their germplasms ranged from 0. 61 to 0.97.Tassel3.0 general linearmodel showed thata total of9 lociwere significantly correlated with 5 quality traits.There were genetic diversities among these tomatomaterials，but the genetic basis was narrow.【Conclusion】The genetic diversities of 30 tomato resources were analyzed by SSR markers.Thirty tomato resources were divided into four groups at the genetic similarity coefficient of 0.71.There were 9 SSR markers associated with total acid，mature color，ripe fruit color，fruit face furrow and lycopene under GLM program.

Tomato;Genetic diversity;Simple sequence repeat(SSR);Association analysis

S641.2

A

1001-4829(2017)8-1867-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.029

2016-09-13

四川省財政創新能力提升工程青年基金項目(2014QNJJ-004)

黃 靜(1985-)，女，四川雙流人，碩士，從事番茄育種與栽培研究，E-mail:2464790707@qq.com，Tel:13550202776，*為通訊作者，E-mail:kwww163@163.com。