Rb、β及γ-catenin蛋白在進展期胃癌及轉移淋巴結癌細胞中的表達及臨床意義

張宇龍 范曉燕 何東偉 智英輝 周曄 劉淑貞 蔡建輝

·論著·

Rb、β及γ-catenin蛋白在進展期胃癌及轉移淋巴結癌細胞中的表達及臨床意義

張宇龍 范曉燕 何東偉 智英輝 周曄 劉淑貞 蔡建輝

目的探討Rb、β與γ-catenin在進展期胃癌及轉移淋巴結癌細胞再表達情況及其與臨床病理諸因素的關系。方法應用免疫組織化學染色方法檢測Rb在腫瘤原發灶及β與γ-catenin在86例進展期胃癌原發灶及其轉移淋巴結癌細胞的表達情況。結果胃癌原發灶癌細胞中65.12%出現Rb陽性，38.37%轉移淋巴結癌細胞出現β與γ-catenin再表達陽性，Rb與腫瘤分化程度密切相關(P<0.05)，β與γ-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達陽性與腫瘤分化程度密切相關(P<0.05)，γ-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達與腫瘤病理類型密切相關(P<0.05)，β-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達與腫瘤病理類型無關(P>0.05)，Rb表達與β- catenin在轉移淋巴結癌細胞中再表達情況相關,與腫瘤病理類型、大小、浸潤程度等因素無關(P>0.05)。γ與β-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達相關(P<0.05)，Rb在腫瘤原發灶癌細胞表達和β與γ-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達無關(P>0.05)。β與γ-catenin再表達陽性者3年生存率與再表達陰性者比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論Rb表達與進展期胃癌發展過程密切相關，與β-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達有關,β與γ-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達是進展期胃癌發生過程中的重要事件，二者協同發揮作用，并對癌細胞在轉移灶中聚集生長起重要作用，聯合評價其功能具有重要臨床意義。

Rb；β與γ-catenin；進展期胃癌；轉移淋巴結；免疫組織化學；生存期

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，大量實驗研究表明，胃癌發生與多個癌基因激活及抑癌基因缺失或突變有關[1]。視網膜母細胞基因(Rb基因)通過調節細胞周期變化，進而在細胞生長和分化中發揮重要作用。在視網膜母細胞瘤、胃癌、食管癌等腫瘤中發現Rb基因的突變或缺失，表明其與腫瘤的發生、發展關系密切，是一種重要腫瘤抑制基因[2]。連環素(caternis)是一類細胞質蛋白，包括α-、β-、γ-catenin等多種形式。它們與E鈣粘蛋白(E-cadherin)結合起來完成細胞黏附功能。研究表明，γ-catenin可以介導E-cadherin與β-catenin結合形成復合體，附著于細胞骨架上起到維持細胞形態和分化的功能。其異常表達均與胃癌、食管癌、肺癌等的發生、分化、侵襲轉移及預后密切相關。本實驗應用SP免疫組化法檢測Rb、β與γ-catenin 在進展期胃癌及其轉移淋巴結癌細胞表達狀況，探討其與進展期胃癌各臨床病理因素、相互間及與患者預后之間關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2009年6月至2012年6月于石家莊市第一醫院外科手術切除并經病理證實的進展期胃癌標本86例，其中男70例，年齡37～75 歲；女16例，年齡42～72歲，平均年齡59.2±13.1歲。其中獲隨訪71例。腫瘤組織病理類型包括：管狀腺癌57例，粘液腺癌21例，印戒細胞癌4例，腺磷癌2例，未分化癌1例，磷癌1例。其中高分化14例，中分化21例，低分化51例，侵及漿膜層78例，未侵及漿膜8例。入選病例皆查實術前未進行化療或放療，無長期服用非甾體類抗炎物藥及皮質激素藥物史。

1.2 試劑 兔抗人多克隆β-catenin抗體購自NeoMarkers 公司，鼠抗人單克隆γ-catenin 及兔抗人多克隆Rb抗體購自Santa Cruz 公司，SP法試劑盒購自北京中杉公司。

1.3 方法 10%甲醛固定標本，石蠟包埋，4 μm切片。用免疫組化SP法，試劑盒使用依說明書。主要操作步驟如下，切片常規脫蠟，梯度酒精脫水(三次二甲苯，三次乙醇)。3%過氧化氫室溫孵育10 min，以滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗3次。將切片浸入0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH值6.0)中，微波加熱至沸騰后斷電，間隔5 min后重復2次，進行抗原修復，冷卻后以PBS洗滌2次。滴加5%羊血清工作液進行封閉，室溫處理20 min后棄去。滴加按一定比例稀釋的一抗4℃過夜, PBS洗滌3次。滴加生物素標記二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次。以DAB反應顯色，自來水充分沖洗后，以蘇木素復染。最后常規脫水，透明，干燥，封片，顯微鏡下觀察并拍照。PBS代替一抗為陰性對照，以切片上相對正常之粘膜組織為陽性對照。

1.4 結果判定

1.4.1 β與γ-catenin只有明顯細胞膜染色被判定為正常染色；如染色不連續，或明顯減弱、缺失，或者出現細胞漿染色，則被評定為不正常染色。每張切片按所有癌細胞之中的正常染色的細胞的百分比評定為三級：1級0～50%；2級51%～80%；3級81%～100%[3]。

1.4.2 原發灶如被評定為3級，則此病例則被認為是β與γ-catenin正常表達，而1級與2級染色則被認為是β與γ-catenin不正常表達；對于其轉移淋巴結，如染色評定為3級而原發灶為1級或2級，或轉移淋巴結染色評定為2級而其原發灶染色為1級，則此病例則被評定為β與γ-catenin再表達陽性；否則評定為再表達陰性。

1.4.3 Rb顯色陽性細胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分；基本不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，將兩類積分相乘0～1分為陰性,≥2分為陽性。

1.5 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，對數據使用χ2檢驗以及需要校正的χ2檢驗，分析進展期胃癌轉移淋巴結癌細胞β與γ-catenin再表達的差異，應用Sperman秩相關法分析各指標表達相關性，繪制Kaplan-Meier曲線比較患者術后生存情況，以Wilcoxon’s log-rank test 對生存曲線行組間差別檢驗，用Cox’s proportional-hazard對影響生存率因素進行多變量分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 β與γ-catenin在腫瘤原發灶的表達 在86例進展期胃癌病例中，β與γ-catenin在腫瘤原發灶癌細胞出現明顯的細胞膜染色減弱或缺失，部分出現胞漿染色。異常表達率為96.51%(83/86)和94.19%(81/86)，僅1例腫瘤原發灶癌細胞兩種連接蛋白表達正常。見圖1。

2.2 Rb在腫瘤原發灶的表達 在86例進展期胃癌病例中，Rb陽性表達56例(65.12%)，與進展期胃癌腫瘤細胞分化程度密切相關(P<0.05)；與腫瘤細胞病理分型(未分化癌、印戒細胞癌、鱗癌與腺鱗癌因樣本過小，未予統計)、腫瘤大小和浸潤深度無關(P>0.05)。見圖1,表1。

2.3 β與γ-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達情況及與臨床病理各因素關系 β與γ-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達率為25.58%及24.42%。全部86例中，出現一種或兩種連接蛋白陽性表達33例，出現一種連接蛋白陽性表達24例，出現兩種連接蛋白陽性表達9例。γ-catenin在高中分化腫瘤轉移淋巴結癌細胞再表達率為45.71%，高于低分化腫瘤轉移淋巴結癌細胞再表達21.57%(P<0.05)；β-catenin在高中分化腫瘤轉移淋巴結癌細胞再表達率為37.14%，高于低分化腫瘤轉移淋巴結癌細胞再表達17.65%(P<0.05)。γ-catenin再表達與腫瘤病理分型(未分化癌、印戒細胞癌、鱗癌與腺鱗癌因樣本過小，未予統計)密切相關(P<0.05)；β-catenin再表達與腫瘤病理分型無關(P>0.05)，γ-與β-catenin與腫瘤大小和浸潤深度無關(P>0.05)。見表1。

圖1 β,γ-catenin與Rb在腫瘤原發灶的表達(SP×200)

2.4 β與γ-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達及其與Rb表達相關性 22例β-catenin轉移淋巴結癌細胞再表達陽性者9例γ-catenin再表達陽性，64例β-catenin轉移淋巴結癌細胞再表達陰性者52例γ-catenin再表達陰性，β-catenin與γ-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達密切相關(P<0.05)。21例γ-catenin轉移淋巴結癌細胞再表達陽性者14例Rb陽性表達，65例γ-catenin轉移淋巴結癌細胞再表達陰性者23例Rb陰性表達，γ-catenin轉移淋巴結癌細胞再表達與Rb表達無關(P>0.05)。22例β-catenin轉移淋巴結癌細胞再表達陽性者11例Rb陽性表達，64例β-catenin轉移淋巴結癌細胞再表達陰性者18例Rb陰性表達，β-catenin轉移淋巴結癌細胞再表達與Rb表達相關(P<0.05 )。見表2～4。

表1 Rb在腫瘤原發灶表達和β與γ-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達與臨床病理各因素關系 例

表2 β及γ-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達相關性

2.5 Rb表達和β與γ-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達與患者預后關系 全部86例患者中71例獲隨訪，自手術日起至隨訪結束，生存時間7～68個月，平均生存時間36.2個月。獲隨訪71例患者3年生存率30.9%，其中β-catenin再表達陽性者生存均數95%可信區間(19，30)，其中位生存時間23個月，再表達陰性者生存均數95%可信區間(34，47)，中位生存時間31個月，再表達陽性與陰性比較差異有統計學意義(P<0.05)；γ-catenin再表達陽性者生存均數95%可信區間(24，39)，中位生存時間23個月，再表達陰性者生存均數95%可信區間(31，44)，中位生存時間28個月，再表達陽性與陰性比較差異無統計學意義(P>0.05)；Rb蛋白表達陽性者生存均數95%可信區間(29，41)，中位生存時間25個月，表達陰性者生存均數95%可信區間(28， 44)，中位生存時間30個月，表達陽性與陰性比較差異無統計學意義(P>0.05)。生存曲線行組間差別檢驗，發現彼此間差異無統計學意義。多變量分析發現，其中β-catenin在胃癌轉移淋巴結癌細胞再表達，可作為獨立判斷預后之因素(P<0.05 )。見表5、6,圖2～4。

表3 β-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達與Rb表達關系

表4 γ-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達與Rb表達關系

表5 Rb、β與γ-catenin組間兩兩比較

表6 Rb、β與γ-catenin多變量分析

圖2 β-catenin生存曲線

3 討論

E-cadherin-連接素復合體在多種惡性腫瘤中異常表達[4,5]。E-cadherin為跨膜蛋白，β-catenin一端在膜內與E-cadherin相連接，另一端與γ-catenin相連接，γ-catenin與肌動蛋白相連，構成維持細胞粘附的穩定復合體，表明β與γ-catenin對維持正常上皮組織結構起著重要作用。對上皮源性惡性腫瘤來說，在某些原因作用下發生的β或γ-catenin功能障礙均會破壞癌細胞間的粘著，導致癌細胞間粘附功能被破壞，進而癌細胞脫離腫瘤原發灶。原發灶癌細胞脫落本身并不致命，癌細胞在其他部位再聚集并出現轉移灶是主要致死原因。Bukholm等[6]已經注意到乳腺癌患者轉移灶內癌組織β-catenin再表達的情況。β-catenin不僅是E-cadherin/catenins復合物作用鏈中的重要環節，還通過與APC蛋白連接構成第2種非cadherin依賴獨立β-catenin復合物，與cadherin/catenins復合物聯接，共同介導上皮細胞間粘附[7]。此外,β-catenin是wnt基因家族控制信號傳導通路重要成分，在肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、Src基因及C-erb-B2等誘導下通過酪氨酸磷酸化影響E-cadherin、APC或c-myc，改變該復合物活性，進而促進癌細胞侵襲和轉移[8,9]。有發現,β-catenin還可以通過Gelsolin蛋白調節人類結腸癌細胞的遷移[10]。

圖3 γ-catenin生存曲線

圖4 Rb生存曲線

一些研究顯示,E-cadherin/catenins復合物在胃癌異常表達率為20%～90%[11,12]。本研究發現，僅極少病例中腫瘤原發灶癌細胞β與γ-catenin正常表達即粘附功能正常。在轉移淋巴結內癌細胞β與γ-catenin再表達陽性率遠高于原發灶腫瘤細胞正常表達說明，正如β與γ-catenin在腫瘤原發灶癌細胞高不正常表達與癌細胞自腫瘤原發灶脫落相關一樣,他們在轉移灶的高再表達陽性與癌細胞在轉移部位的再聚集和生長有關。腫瘤原發灶中該復合體不正常表達導致癌細胞脫離，在淋巴結較高再表達則造成癌細胞的聚集。而且β與γ-catenin在轉移淋巴結再表達呈正相關，說明β與γ-catenin有可能偕同作用于癌細胞于腫瘤原發灶的脫落及在轉移淋巴結的聚集。本研究還表明，β與γ-catenin的再表達與患者預后密切相關。

Rb基因位于染色體長臂(13q14)，由27個外顯子構成，主要通過抑制轉錄因子E2F作用于細胞周期，對細胞生長分化有重要調控作用。該基因正常情況下對細胞分裂起抑制作用，如果這種抑制作用減弱將導致細胞的異常增殖，最終導致癌變，其失活方式可分為缺失、突變及、甲基化等。Rb基因對細胞增殖分化的調控與多種因子相關，如cyclins、CDKs、TGF-β2等。還受多種因素如病毒、癌基因及癌基因產物的影響,會干擾其正常功能并導致腫瘤發生[13]。

p16-cyclinD1-pRb與p53-p21-pRb通路是細胞周期G1-S期轉變兩條獨立分子信息傳導途徑，Rb蛋白對細胞周期調節起重要作用。Rb蛋白功能與磷酸化狀態密切相關。磷酸化Rb蛋白與轉錄因子E2F結合，細胞增殖停滯于G1期，有助于細胞DNA的損傷修復；磷酸化Rb蛋白抑制細胞由G0-G1期轉化所必須的c-myc與c-fos癌基因表達。某些原因致Rb蛋白磷酸化水平升高，導致轉錄因子E2F激活并釋放，DNA復制，細胞過度增殖，細胞于G1期未充分發育便進入S期，有可能導致惡性腫瘤的發生[14]。

C-mgc基因是β-Cat-Tcf/lef復合物靶基因[15]。細胞周期素(cyclinD1,CD1)是一種作用于G1期的細胞周期相關蛋白,促進細胞由G1/G0期進入S期。可見Rb與β-catenin對腫瘤在原發灶發生、發展相關。Rb作為一種重要抑癌基因，本應在腫瘤原發灶低表達，但本研究發現，Rb蛋白在腫瘤原發灶65.12%的高表達，理論上講,Rb蛋白的表達應抑制細胞增殖,不利于腫瘤的發生、發展。但不是所有的Rb突變均可見檢驗到Rb蛋白缺失,相反可導致一種無功能Rb蛋白,即突變型Rb蛋白表達[16]。有學者證實野生型Rb蛋白有抑制細胞增殖的功能,突變型的Rb蛋白則失去抑制作用[17]。本研究表明，Rb蛋白與β-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達有相關性，即二者有共同作用基因，不僅在腫瘤原發灶作用時有相關性，而且對β-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達也有關系，但具體機制不清。

綜上所述，β與γ-catenin功能異常為腫瘤發生、發展過程中的重要環節，并與其他因素共同作用促進腫瘤的發生、發展。在進展期胃癌轉移淋巴結癌細胞存在β與γ-catenin再表達，并對腫瘤發展起著重要的作用，而且與患者預后密切相關。Rb蛋白在腫瘤發生、發展過程中起重要作用，而且與β-catenin在轉移淋巴結癌細胞再表達有關,與患者預后密切相關。

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ExpressionandclinicalsignificanceofRbprotein,βandγ-catenininmetastaticlymphnodesfromadvancedgastriccarcinoma

ZHANGYulong*,FANXiaoyan,HEDongwei,etal.

*DepartmentofSurgery,TheFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

ObjectiveTo investigate the expression of Rb and re-expression of β and γ-catenin in cancerous cells of metastatic lymph nodes from advanced gastric carcinoma.MethodsThe expression levels of Rb and β and γ-catenin were detected by immunohistochemistry in 86 cases of primary focus of advanced gastric carcinoma as well as corresponding metastasis lymph nodes.ResultsAmong 86 cases of primary focus of advanced gastric carcinoma,the expression of Rb was detected in 56 case (65.12%),and re-expression of β-and γ-catenin in metastatic cancerous cells was detected in 33 case (38.37%). The expression of Rb was closely related with tumor differentiation degree (P<0.05),and the re-expression of β-and γ-catenin was closely correlated to tumor differentiation degree (P<0.05).The re-expression ofγ-catenin in metastatic cancerous cells was closely correlated to tumor pathological types (P<0.05),however, the re-expression of βcatenin in metastatic lymph nodes was not related with tumor pathological types (P>0.05). Moreover the expression of Rb in metastatic lymph nodes was related with that of β-catenin,however,which was not correlated to tumor pathological types,tumor size,infiltration degree (P>0.05). There were significant differences in 3-year survival rates between patients with positive re-expression of β or γ-catenin and patients with negative re-expression ofβ or γ-catenin.ConclusionThe expression of Rb protein is closely related with the progress of advanced gastric carcinoma and with the re-expression of β-catenin in cancerous cells of metastatic lymph nodes.The re-expression of β-and γ-catenin in cancerous cells of metastatic lymph nodes from advanced gastric carcinoma plays an important role in the pathogenesis of advanced gastric carcinoma and both factors have synergistic reaction and play important role in aggregation and growth of cancer cells in metastatic focus.

Rb; β and γ-catenin; advanced gastric carcinoma; metastatic lymph nodes; immunohistochemistry;survival duration

項目來源：河北省衛生與計劃生育委員會 (編號：ZD20140160，20130251)

050011 河北省石家莊市第一醫院外三科(張宇龍、智英輝)；河北省人民醫院腫瘤科(范曉燕、周曄、劉淑貞、蔡建輝)；河北醫科大學第四醫院臨床生物細胞室(何東偉)

范曉燕，050051 石家莊市，河北省人民醫院腫瘤科；

E-mail:xiaoyanfan1980@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.19.001

R 735.2

A

1002-7386(2017)19-2885-05

2017-03-20)