一株大腸桿菌的分離與鑒定

梅京京，韓海鋒，王龍飛，張丹，吳庭才，李小康

（1.漯河市畜牧直屬分局，河南漯河462000，2.漯河市動物衛生監督所，3.河南科技大學）

一株大腸桿菌的分離與鑒定

梅京京1，韓海鋒2，王龍飛1，張丹1，吳庭才3*，李小康3

（1.漯河市畜牧直屬分局，河南漯河462000，2.漯河市動物衛生監督所，3.河南科技大學）

選取洛陽自然保護區野生成年白鷺，通過無菌采取其口腔拭子和肛門拭子進行細菌的增殖，得到3株分離菌，再對其進行分離培養、染色鏡檢、生化鑒定及藥敏試驗。分離菌在麥康凱培養基上形成邊緣整齊表面光滑濕潤的紅色菌落，革蘭氏染色呈陰性。分離菌使甘露醇、鼠李糖、甘油、麥芽糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、葡萄糖及棉籽糖發酵變為黃色；該菌具有明膠酶，使明膠水解生成多肽再水解為氨基酸，使明膠液化。吲哚試驗呈陽性反應；V-P試驗為陰性；MR試驗為陽性。藥物敏感性試驗結果為對青霉素、慶大霉素、環丙沙星、氧氟沙星、鏈霉素5種藥物均為高度敏感。

野生禽類；大腸桿菌；分離；生化鑒定；藥敏試驗

大腸桿菌病是由大腸桿菌埃希氏菌的某些致病菌引起的疾病總稱，常引起禽類局部或全身性感染如心肌炎、肝周炎、氣囊炎、敗血癥、臍帶炎、眼炎和卵黃性腹膜炎等。目前，禽源大腸桿菌的研究資料絕大多數來源于家禽。有關野生禽源大腸桿菌的系統性研究相對較少。但隨著集約化養殖的急劇發展和環境污染的加劇，野生禽類也頻發此病，對養禽業的發展和野生禽類的保護影響甚大。選取洛陽自然保護區野生成年白鷺進行試驗研究，旨在為野生禽類大腸桿菌病的防治和野生動物的保護提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 病料

洛陽自然保護區管理處提供的野生成年白鷺的口腔黏液和糞便。

1.2 器材與試劑

超凈工作臺、恒溫培養箱、營養瓊脂、糖發酵（分解）試驗試劑及指示劑、V-P試驗試劑、甲基紅（MR）試驗試劑、吲哚試驗試劑、革蘭氏染色液、蛋白胨、牛肉膏等。

1.3 細菌分離與培養

無菌采取疑似病例的糞便和口腔黏液，加入適量生理鹽水，在無菌操作臺中用接種環接種于麥康凱瓊脂平板，在37℃恒溫培養箱中培養10～15 h進行培養與分離。

1.4 細菌增殖

無菌操作，將麥康凱培養基中的紅色單一菌落接種于LB液體培養基中，37℃搖床培養7～8 h。觀察生長狀況，放置冰箱保存備用。

1.5 革蘭氏染色

無菌操作，用接種環LB液體培養基中的菌液，涂于載玻片上，用酒精燈固定；在已干燥、固定好的玻片上，滴加草酸銨結晶紫染色液，經1～2 min水洗；加革蘭氏碘液與抹片上媒染，經1～3 min，水洗；加95%酒精與抹片上脫色，約1 min，水洗；加10倍稀釋石炭酸復紅液復染1～2 min，水洗；吸干或烘干，用100倍的油鏡進行菌體形態和染色特性的觀察；革蘭氏陽性細菌呈藍紫色，革蘭氏陰性細菌呈紅色［1］。

1.6 生化鑒定

制備生化試驗培養基，將分離純化過的待檢菌分別進行糖類發酵試驗即生化反應，主要包括蔗糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、V-P試驗、吲哚試驗及MR試驗。用挑菌環挑取菌液并溶于各生化管中，根據條件的不同放置不同設定的恒溫培養箱中，培養24 h或48 h后觀察。

1.7 藥敏試驗

該試驗所用方法為CLSI推薦的K-B法進行，將分離純化鑒定過的待檢菌在血清肉湯培養基中37℃下培養12 h，然后用微量移液器取20 μl菌液于LB培養皿中，用L棒涂抹均勻，貼上藥敏片，在37℃恒溫培養箱內培養15～24 h，再用直尺測量其抑菌環的直徑，判斷標準參考NCCLS藥敏紙片擴散法。抑菌圈直徑＞15 mm為高度敏感；在10～15 mm為中度敏感；抑菌圈直徑＜10 mm為低度敏感［2］。

2 結果與分析

2.1 培養特性

病原菌在麥康凱瓊脂平板上形成的菌落邊緣整齊或波形，稍凸起，表面光滑濕潤，直徑大約2.0 mm，呈紅色，因待檢菌發酵乳糖而產酸，使中性紅指示劑變紅色，長出紅色菌落。在普通的LB培養基上，則長出表面光滑無色半透明菌落。

2.2 革蘭氏染色

在油鏡下觀察革蘭氏染色結果為紅色短桿菌，無芽孢和莢膜，單獨和成對存在。

2.3 生化鑒定

生化試驗結果顯示：細菌使甘露醇發酵變為黃色；使鼠李糖、甘油、麥芽糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、葡萄糖及棉籽糖發酵變為黃色；該菌具有明膠酶，使明膠水解生成多肽再水解為氨基酸，使明膠液化。該菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，加入對二甲基氨基苯甲醛試劑時，形成紅色的玫瑰吲哚。該菌在分解葡萄糖過程可產生乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物，使甲基紅指示劑變紅。該菌的生化試驗結果與大腸桿菌的特征基本一致，見表1。

表1 生化試驗結果

2.4 藥敏試驗

藥敏試驗結果匯總見表2。

表2 藥敏試驗結果

3 討論

該試驗通過革蘭氏染色確定該分離菌為革蘭氏陰性短桿菌，且能在LB培養基和麥康凱培養基上迅速生長，并出現與大腸桿菌一致的生長特征。2010年劉華等人對一株孔雀源大腸桿菌進行分離鑒定，該株孔雀源大腸桿菌的鏡檢結果為兩端鈍圓，多數散在排列，偶有2～3個連在一起的革蘭氏陰性短桿菌；該菌株的培養特性為在麥康凱瓊脂平板上，形成中等大小，表面光滑濕潤的粉紅色菌落［3］。其相關試驗結果與該次試驗結果相一致。2013年李雙雙等人對兔源大腸桿菌進行鑒定，該菌鏡檢結果為革蘭氏陰性，兩端鈍圓，呈單個或多個散在排列；該菌在普通培養基上形成表面光滑、邊緣整齊、濕潤半透明的灰白色圓形突起菌落，在麥康凱瓊脂平板上形成紅色、中等大小、表面光滑、濕潤的單個菌落［4］。因此，根據細菌形態和培養特性的研究，可初步確定該分離株為大腸桿菌。

該試驗除采用常規細菌分離培養方法外，還進行了一系列生化鑒定試驗以便對其進行進一步的驗證，鑒定試驗結果為該分離株能利用鼠李糖、甘油、麥芽糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、葡萄糖及棉籽糖；V-P試驗陰性，MR試驗為陽性，吲哚試驗陰性。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊第八版》標準及《腸桿菌科生化鑒定編碼手冊》，此生化鑒定結果表明該分離株的生化特性與大腸桿菌的生化特性相一致。2015年孫蓉蓉等人對水貂大腸桿菌進行分離鑒定，其生化鑒定試驗結果為分離菌均可分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，產酸產氣，大部分菌株還可利用蔗糖；VP試驗陰性，MR試驗為陽性，吲哚試驗陰性［5］，與該次試驗結果相一致。2013年達娃次仁等人對西藏牦牛源大腸桿菌進行分離鑒定，其生化鑒定結果為分離菌能利用葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖和麥芽糖；MR試驗陽性，V-P試驗陰性，吲哚試驗陽性［6］，與該次試驗結果相一致。至此可基本確定該分離菌為大腸桿菌。

該研究還對待檢菌進行了藥物敏感性試驗，結果表明，該分離菌對青霉素、慶大霉素、環丙沙星、氧氟沙星、鏈霉素5種藥物均為高度敏感。說明該分離株對這幾種抗生素的耐藥性都比較低，可能是由于該野禽生存和活動的環境抗生素污染并不嚴重。該次的藥敏試驗結果可為維護公共衛生安全提供幫助，也可為該保護區野生禽類大腸桿菌病的防治提供依據。

［1］郭伶，代竹青.一例雞大腸桿菌的分離與鑒定［J］.中國畜牧獸醫，2010，37（1）：184-185.

［2］胡仕鳳，雷紅宇，寧玲忠，等.雞大腸桿菌病的診斷與防治［J］.養禽與禽病防治，2005，（5）：15.

［3］劉華，祁克宗，朱良強，等.一株孔雀源大腸桿菌分離鑒定與致病特性初步研究［J］.安徽農學通報，2010，16（9）：27-29.

［4］李雙雙，賀志沛，羅俊娜，等.兔源大腸桿菌的分離鑒定及藥物敏感性檢測研究［J］.江西農業學報，2013，25（8）：70-72.

［5］孫蓉蓉，鄒玲，劉文華，等.水貂大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗［J］.安徽農業科學，2015，43（11）：125-126.

［6］達娃次仁，格桑卓瑪，貢嘎，等.牦牛源大腸桿菌西藏分離株的血清型鑒定［J］.黑龍江畜牧獸醫，2013，62（21）：160-161.

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1004-5090（2017）08-0010-02

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