美洲大蠊提取物對H22荷瘤小鼠脾淋巴細胞的影響

吳道勛，邵維莉，常旭，歐紅麗，張瀚丹，陳俊雅，3*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理671000；2.大理大學基礎醫學院，云南大理671000；3.云南省昆蟲醫藥研發重點實驗室，云南大理671000）

美洲大蠊提取物對H22荷瘤小鼠脾淋巴細胞的影響

吳道勛1，邵維莉1，常旭2，歐紅麗2，張瀚丹1，陳俊雅1，3*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理671000；2.大理大學基礎醫學院，云南大理671000；3.云南省昆蟲醫藥研發重點實驗室，云南大理671000）

目的：研究美洲大蠊提取物對BALB∕c荷瘤小鼠脾淋巴細胞的影響。方法：灌胃給予BALB∕c荷瘤小鼠低、中、高劑量的（50、100、200 mg∕kg）美洲大蠊提取物（EPA），陽性組給予環磷酰胺（CTX，50 mg∕kg），給藥10 d后處死小鼠，測定小鼠脾臟中T淋巴細胞和外周血中LY、MO、GR細胞的含量，并計算抑瘤率。結果：EPA能增加脾臟中CD8+的含量，與模型組相比，明顯提高腫瘤生長抑制率（P＜0.05）。結論：美洲大蠊能抑制H22肝癌小鼠的腫瘤生長，其機制可能與脾臟中CD8+含量增加有關。

美洲大蠊；H22荷瘤小鼠；脾臟；淋巴細胞

美洲大蠊（Periplaneta americana）為昆蟲綱，蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱“蟑螂”，因其具有良好的活血化瘀功效，使得美洲大蠊成為國內主要飼養的藥用蜚蠊。傳統中醫學最早就有其藥用作用的記載，我國第一本經典藥學專著《神農本草經》有關于蜚蠊的記載為“味寒咸，主血淤，瘕堅，寒熱，破積聚，喉咽痹，內寒，無子”，現代藥理學關于蜚蠊的藥用價值有了更深層次的發現，如組織修復，抗炎，抗心肌缺血，抗心律失常，抗肝臟損傷，抗腫瘤和免疫增強等作用〔1-7〕。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料BALB∕c小鼠，體重（20±2）g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物合格證號為SCXK（湘）2013-0004；美洲大蠊提取物（EPA，由大理大學劉光明教授提供）；環磷酰胺（CTX，山西普德藥業股份有限公司，批號：04131206）；XFA6000動物血細胞分析儀用稀釋液（南京普朗醫療設備有限公司，批號：PD1501）；HB探針清洗液（南京普朗醫療設備有限公司，批號：PB9407）；ANI-3D溶血劑（南京普朗醫療設備有限公司，批號：PF2402）；HB含酶清洗液（南京普朗醫療設備有限公司，批號：PB7501）；FITC Hamster Anti-Mouse CD3e，（美國BD公司，批號：553062）；PE Rat Anti-Mouse CD4，（美國BD公司，批號：553049）；Per-CP Rat Anti-Mouse CD8a，（美國BD公司，批號：553036）。

1.2 實驗儀器臺式冷凍離心機（ScanSpeed，型號：1580MGR）；流式細胞儀（FACS Calibur，美國BD公司）；全自動動物血細胞分析儀（南京普朗醫療設備有限公司，型號：XFA6000）。

2 實驗方法

2.1 荷瘤小鼠造模取第2代腹水保種傳代的H22小鼠肝癌細胞，在光學顯微鏡下用臺盼藍拒染法計數活細胞的數量，保證細胞活率＞95%進行動物實驗。無菌條件下將細胞密度調整為2.0×106個∕mL，每只小鼠按0.2 mL接種于右腋皮下。

2.2 分組給藥取接種第2天后的BALB∕c小鼠30只，隨機分為5組，每組6只，實驗設置模型組（注射生理鹽水），陽性組（注射CTX，50 mg∕kg），EPA給藥組（低、中、高劑量分別為50、100、200mg∕kg），未接種瘤細胞小鼠為正常組。正常組和模型組每天給生理鹽水，陽性組按0.1 mL∕10 g小鼠體重腹腔注射環磷酰胺，連續給藥3 d，治療組按0.2 mL∕10 g小鼠體重給EPA，除陽性組外其余各組連續給藥10 d。

2.3 檢測指標

2.3.1脾細胞中T細胞亞群的測定給藥12 h后，無菌操作取脾臟，置于細胞篩網上，用PBS（含3%血清）研磨成單細胞懸液，臺盼藍計數，調整細胞濃度為107個∕mL，取細胞懸液100 μL加入流式管中，做FITC-CD3-Ab、PE-CD4-Ab、Per-Cp-CD8-Ab抗體染色，用流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+細胞百分比。

2.3.2外周全血中淋巴細胞（LY）、單核細胞（MO）、中性粒細胞（GR）測定末次給藥后禁食12 h，眼內眥靜脈取血，取20 μL加入稀釋液，用動物血細胞分析儀測淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞的數量。

2.3.3抑瘤率的測定頸椎脫臼處死小鼠取腫瘤并稱量，分別按下面公式計算腫瘤生長抑制率：腫瘤生長抑制率=［（對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重）∕對照組平均瘤重］×100%。

2.4 數據分析采用SPSS 21.0分析軟件進行統計學分析，數據用均數±標準差表示，各組均數的比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 EPA對外周血T細胞亞群的影響與正常組相比，EPA低、中、高劑量組對CD3+細胞、CD8+細胞、CD4+∕CD8+有下調的作用（P＜0.05），對CD4+細胞無明顯作用；與陽性組相比，EPA各組CD3+細胞均明顯的減少（P＜0.05或P＜0.01），EPA中、高劑量上調CD8+細胞、CD4+∕CD8+（P＜0.05），差異有統計學意義。見表1和圖1～4。

表1 EPA對H22肝癌腫瘤小鼠外周血T細胞亞群的影響

表1 EPA對H22肝癌腫瘤小鼠外周血T細胞亞群的影響

注：與正常組相比#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比*P＜0.05；與陽性組相比△P＜0.05，△△P＜0.01。

圖1 EPA對H22肝癌腫瘤小鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+細胞的影響

圖2 EPA對H22肝癌腫瘤小鼠外周血中CD4+∕CD8+細胞的影響

圖3 EPA對H22肝癌腫瘤小鼠外周血中CD3+細胞的影響

圖4 EPA對H22肝癌腫瘤小鼠外周血中CD4+和CD8+細胞的影響

3.2 EPA對外周血LY、MO、GR的影響陽性組與模型組相比LY、MO、GR的含量均明顯減少（P＜0.01）；EPA低、中、高劑量組與正常組相比，均能明顯增加MO、GR的含量（P＜0.05），與陽性組相比，EPA各組均對LY、MO、GR的細胞數有增加作用，除EPA低劑量組對LY的作用外，其余各組均表現出顯著的差異（P＜0.05或P＜0.01），差異有統計學意義。見表2和圖5。

表2 EPA對H22肝癌腫瘤小鼠外周血LY、MO、GR的影響

表2 EPA對H22肝癌腫瘤小鼠外周血LY、MO、GR的影響

注：與正常組相比#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性組相比△P＜0.05，△△P＜0.01。

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圖5 EPA對H22肝癌腫瘤小鼠外周血中LY、MO、GR的影響

3.3 EPA對H22肝癌腫瘤小鼠腫瘤抑制率的影響陽性組與模型組相比，瘤重顯著性下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；EPA中、高劑量組與模型組相比，瘤重明顯降低（P＜0.05），與陽性組相比，EPA低、中劑量對瘤重差異有統計學意義（P＜0.05）；見表3和圖6。

表3 EPA對H22肝癌腫瘤抑制率

表3 EPA對H22肝癌腫瘤抑制率

注：與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性組相比△P＜0.05。

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圖6 EPA對H22肝癌腫瘤抑瘤率

4 分析和討論

腫瘤的產生是一個復雜的過程，其產生的原因和治療手段都還未完全了解，但隨著對腫瘤與機體免疫的關系的深入研究，特別是對免疫微環境〔8〕、免疫監視和免疫逃逸〔9〕等相關概念的進一步認識，免疫治療逐漸成為治療腫瘤的一種方式。細胞免疫是機體免疫的一種重要方式，免疫系統對病毒和化學原因引起的腫瘤免疫作用中，T淋巴細胞占有重要的作用〔10-11〕，T淋巴細胞來源于骨髓中的淋巴樣前祖細胞，在胸腺中發育成熟，其可分為若干個亞群，各亞群之間相互調節，共同發揮其免疫學功能，其中CD3分子的功能是轉導T細胞抗原受體（TCR）的識別抗原所產生的活化信號作用，CD4和CD8分子只有成熟的T細胞才能表達，其主要功能輔助TCR識別抗原和參與T細胞活化信號的轉導，成熟的T細胞按其CD分子表型不同可分為CD3+、CD4+、CD8+細胞，其分化后，CD4+主要為效應Th細胞，而CD8+主要為細胞毒Tc細胞〔12〕，可特異性殺傷靶細胞。

本實驗用EPA作用H22肝癌移植瘤的BALB∕c小鼠，結果顯示，EPA相對于模型組能提高脾臟細胞中的CD8+的含量，CD4+∕CD8+的比值相對正常組也相對提高，與陽性組相比，EPA中、高劑量對CD8+細胞、CD4+∕CD8+有增加的作用，表明EPA能提高細胞免疫功能。通過對血中的LY、MO、GR的測量結果顯示，EPA對荷瘤小鼠的外周中的LY、MO、GR相對模型組沒有明顯的改變作用，但與陽性組相比，EPA各組均對LY、MO、GR的細胞數有增加作用，但在抑制腫瘤生長方面，EPA組的中劑量和高劑量組與模型組相比，能明顯的減輕腫瘤的重量，與陽性組相比，EPA低、中劑量對瘤重差異有統計學意義；EPA低、中、高劑量組抑瘤率分別為24.00%，38.29%，49.39%，說明在抗腫瘤方面有一定的作用。

以上結果表明，EPA可通過調節脾淋巴細胞的含量，增強機體免疫功能，進而發揮一定的抗腫瘤活性，為進一步研究和開發美洲大蠊的藥用價值提供了實驗基礎。

〔1〕牛春麗，曾菁，夏盟愷，等.肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎的影響〔J〕.大理學院學報，2015，14（4）:12-16.

〔2〕陳俊雅，李洪文，吳道勛，等.美洲大蠊提取物CⅡ-3抗炎作用及機制研究〔J〕.大理學院學報，2015，14（2）:8-11.

〔3〕陸麗，張旭強，甘平，等.美洲大蠊提取物對ISO致大鼠心肌缺血的保護作用〔J〕.大理學院學報，2014，13（8）:7-10.

〔4〕彭麗，陸麗，張旭強，等.美洲大蠊提取物CⅡ-3對大鼠心律失常的保護作用〔J〕.大理學院學報，2011，10（12）:6-9.

〔5〕張旭強，何旭，陳俊雅，等.美洲大蠊提取物CⅡ-3對大鼠急性酒精性肝損傷的保護作用〔J〕.大理學院學報，2011，10（12）:1-5.

〔6〕張小雪，李春艷，徐靜，等.美洲大蠊提取物對肝星狀細胞增殖能力的影響〔J〕.大理學院學報，2012，11（6）:16-19.

〔7〕李嬌，張冰清，劉光明，等.美洲大蠊脫脂膏對小鼠免疫功能的影響〔J〕.大理學院學報，2015，14（10）：1-5.

〔8〕廖云梅，阮志華.腫瘤微環境在腫瘤免疫治療中的研究進展〔J〕.免疫學雜志，2014，30（12）：1104-1107.

〔9〕王盛典，賈明明.腫瘤免疫微環境在腫瘤常規治療效應中的作用〔J〕.中國腫瘤生物治療雜志，2012，19（3）：229-238.

〔10〕XIA Y H，WANG Z M，CHEN R X，et al.T-cell apoptosis induced by intratumoral activated hepatic stellate cells is associated with lung metastasis in hepatocellular carcino?ma〔J〕.Oncol Rep，2013，30（3）：1175-1184.

〔11〕WANG W J，TAO Z，GU W，et al.Variation of blood T lym?phocyte subgroups in patients with non-small cell lung cancer〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（8）：4671-4673.

〔12〕張京雨，張曉明.CIK細胞過繼性免疫治療對結直腸癌化療患者免疫指標的影響〔J〕.腫瘤基礎與臨床，2009，22（1）：51-53.

The Effects of Periplaneta americana Extract on Spleen Lymphocytes of H22Tumor-bearing Mice

Wu Daoxun1,Shao Weili1,Chang Xu2,Ou Hongli3,Zhang Handan1,Chen Junya1,3*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Pre-clinical College,Dali University,Dali, Yunnan 671000,China;3.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To study the effects ofPeriplanet americanaextract on spleen lymphocytes of H22Tumor-bearing mice.Methods：BALB∕c mice were administered with low dose,middle dose and high dose ofPeriplaneta americanaextract（50,100,200 mg∕kg）by gavage.The positive group was injected with 50 mg∕kg cyclophosphamide.After 10-day feeding and injection respectively the content of T lymphocytes in the spleen,lymphocyte cells,Monocyte cells and granulocyte cells in peripheral blood were measured,and the anti-tumor rate was calculated.Results：ThePeriplaneta americanaextract could obviously increase the content of CD8+and the tumor growth inhibition rate（P＜0.05）compared with the normal group.Conclusion：Periplaneta americanaextract can inhibit the growth of H22liver tumor in mice and its mechanism may be related to the increase of the content of CD8+in the spleen.

Periplaneta americana；tumor H22-bearing mice；spleen；lymphocytes

R285

A

2096-2266（2017）08-0001-05

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.08.001

（責任編輯 李楊）

國家自然科學基金資助項目（81560600）；大理大學青年教師科研基金資助項目（KYQN201337；KYQN201309）

2016-09-30

2017-04-19

吳道勛，碩士研究生，主要從事天然藥物藥理學研究.

*通信作者：陳俊雅，實驗師.