聚肌苷酸-聚胞苷酸對(duì)人髓核細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-1、13表達(dá)的影響*

夏新宇，胡 松，劉 陽，鄒 強(qiáng)，常 山

1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 科研實(shí)驗(yàn)中心(成都 610500)；3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 骨科(成都 610500)

·論著·

聚肌苷酸-聚胞苷酸對(duì)人髓核細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-1、13表達(dá)的影響*

夏新宇1，胡 松2，劉 陽2，鄒 強(qiáng)2，常 山3△

1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 科研實(shí)驗(yàn)中心(成都 610500)；3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 骨科(成都 610500)

目的探究聚肌苷酸-聚胞苷酸[polyinosinic-polycytidylic acid，Poly(I:C)]對(duì)人髓核細(xì)胞(nucleus pulposus cells，NPC)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)-1、13表達(dá)的影響。方法取人椎間盤組織，采用酶消化法分離并體外培養(yǎng)NPC。不同時(shí)間不同劑量的Poly(I:C)刺激NPC，利用qPCR和Western blot方法檢測MMP-1、13的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況；siRNA分別沉默TLR-3、RIG-1和MDA-5后，Poly(I:C)刺激NPC，qPCR檢測MMP-1、13的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果分離培養(yǎng)的NPC 5～6 d后，貼壁生長；Poly(I:C)刺激NPC后，MMP-1、13的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；siRNA沉默TLR-3后，MMP-1、13的mRNA 表達(dá)水平受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；siRNA沉默RIG-1和MDA-5后，MMP-1、13的mRNA 表達(dá)水平不受影響(P>0.05)。結(jié)論P(yáng)oly(I:C)通過TLR-3受體途徑促進(jìn)NPC表達(dá)MMP-1、13。

髓核細(xì)胞；Poly (I:C)；基質(zhì)金屬蛋白酶-1、13；Toll樣受體3

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration ，IVDD)作為生活中常見的疾病，擁有較高的發(fā)病率及復(fù)發(fā)率，如引起頸腰腿痛發(fā)生的主要原因便是IVDD[1]。IVDD是一個(gè)由多因素共同作用的復(fù)雜過程，其中，椎間盤髓核的主要組成物質(zhì)-細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix ，ECM)成分的改變與IVDD密切相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)作為金屬蛋白酶，參與多數(shù)基質(zhì)成分的降解，包括糖蛋白類和蛋白聚糖類，特別是膠原蛋白類，其表達(dá)和分解平衡的失調(diào)是引起ECM改變的主要原因[2]。IVDD時(shí)，MMPs的表達(dá)與活性增高，引起ECM降解，髓核水分及彈性喪失，最終導(dǎo)致椎間盤生物學(xué)活性改變，而MMP-1、2、3、13在維持椎間盤ECM平衡的作用尤為重要[3-6]。既往研究[7]報(bào)道，IVDD患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)雙鏈DNA病毒(dsDNA)，提示病毒感染可能是影響IVDD的一個(gè)重要因素。人工合成類病毒聚肌苷酸-聚胞苷酸[polyinosinic-polycytidylic acid，Poly(I:C) ]，作為一種病毒類似物，在研究病毒感染過程中被廣泛應(yīng)用[8]。Poly(I:C)可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞MMPs表達(dá)增高，而在椎間盤中，Poly(I:C)是否引起MMPs改變，目前還未有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究通過Poly(I:C)來模擬病毒感染人髓核細(xì)胞(nucleus pulposus cells，NPC)，以研究病毒感染對(duì)MMP-1、13表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 組織來源 來自椎間盤摘除或置換術(shù)患者的髓核組織(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院脊柱外科)，在無菌條件下進(jìn)行原代NPC分離。

1.1.2 試劑 DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，F(xiàn)BS胎牛血清(Gibco，美國)，II型膠原酶(Gibco，美國)，胰蛋白酶(Sigma-Aldrich，美國)，RNAiso Plus(Takara，日本)，PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)，UPL probe(Roche，瑞士)，Mastermix FastStart Universal Probe(Roche，瑞士)，Poly (I:C)(Invivogen，美國)，MMP-1、13單克隆抗體(R&D)。

表1 qPCR 引物信息

1.2方法

1.2.1 人NPC的分離培養(yǎng) 獲取新鮮椎間盤組織(成都醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院脊柱外科，均獲得病人同意)，將組織剪碎成體積1 mm3，利用胰蛋白酶、II型膠原酶相結(jié)合的方法，從椎間盤組織中分離、培養(yǎng)NPC。使用含DMEM+10%FBS完全培養(yǎng)基，在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。每天定時(shí)觀察細(xì)胞生長狀況，每隔3 d換液，待細(xì)胞生長融合至80%時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2 分組 實(shí)驗(yàn)根據(jù)檢測內(nèi)容不同，共分3組(劑量效應(yīng)、時(shí)間效應(yīng)、受體通路)，設(shè)立實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，各組間重復(fù)檢測3次。劑量效應(yīng)：分別以50、100 μg/mL 劑量Poly(I:C)刺激NPC 24 h為實(shí)驗(yàn)組，Poly(I:C)未刺激NPC為對(duì)照組；時(shí)間效應(yīng)：50 μg/mL劑量Poly(I:C)刺激NPC 24、48 h為實(shí)驗(yàn)組，Poly(I:C)未刺激NPC為對(duì)照組；受體通路：siRNA沉默TOLL樣受體3(TOLL like receptor 3，TLR-3)、黑色素分化相關(guān)基因蛋白5(melanoma differentiation-associated gene 5 ，MDA-5)和細(xì)胞內(nèi)維甲酸誘導(dǎo)基因蛋白1(retinoic acid-inducible gene 1，RIG-1)表達(dá)后，Poly(I:C)刺激NPC為實(shí)驗(yàn)組，以Poly(I:C)直接刺激NPC為對(duì)照組。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染方法 根據(jù)LipofectamineTM2000試劑說明，將TLR-3(s235)、MDA-5(s34500)及RIG-1(s223616)siRNA轉(zhuǎn)染至NPC中，分別沉默TLR-3、MDA-5和RIG-1 3種受體基因，抑制其表達(dá)。細(xì)胞于37 ℃，CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h，完成轉(zhuǎn)染過程。

1.2.4 RNA提取及qPCR檢測MMP-1、13 mRNA的表達(dá) 采用Trizol試劑提取NPC總RNA，依據(jù)PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書，進(jìn)行RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，通過CFX96TMReal time System 進(jìn)行擴(kuò)增。PCR儀程序設(shè)定反應(yīng)條件為：起始95 ℃、10 min；然后95 ℃、10 S和60 ℃、30 S反復(fù)40個(gè)循環(huán)；最后40 ℃、30 S。所有qPCR均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次(表1)。

1.2.5 Western blot檢測MMP-1、13的蛋白質(zhì)表達(dá) 提取NPC總蛋白，使用BCA試劑盒對(duì)所提蛋白含量進(jìn)行測定，計(jì)算蛋白濃度，以GAPDH作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參。采用SDS-PAGE電泳法，對(duì)所提蛋白進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜，將含有蛋白質(zhì)的PVDF膜用5%脫脂牛奶，37 ℃封閉1 h或4 ℃封閉8 h。封閉后，加一抗抗體，4 ℃孵育過夜，最后加入二抗，室溫孵育1 h?？贵w孵育完成后，加入顯色液，化學(xué)發(fā)光成像儀曝光成像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1NPC原代培養(yǎng)

酶消化法分離后的NPC，原代培養(yǎng)5～6 d后貼壁生長，顯微鏡下觀察呈長梭型或不規(guī)則形狀(圖1)。

圖1 NPC原代培養(yǎng) 注：A.剪碎的新鮮髓核組織；B.培養(yǎng)5～6 d貼壁生長的原代NPC(×4)

2.2Poly(I:C)刺激人NPC后MMP-1、13mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組50、100 μg/mL劑量的Poly(I:C)分別處理NPC 24、48 h后，MMP-1、13的mRNA表達(dá)量比對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2 A、B)。Western blot檢測Poly(I:C)刺激NPC后MMP-1、13的蛋白質(zhì)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組50、100 μg/mL劑量的Poly(I:C)分別刺激NPC 24、48 h后，MMP-1、13蛋白質(zhì)的表達(dá)量刺激組與未刺激對(duì)照組之間相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2 C、D)。

圖2 Poly(I:C)刺激NPC后MMP-1、13的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果

注：A.qPCR檢測50 μg/mL劑量Poly(I:C)刺激NPC不同時(shí)間MMP-1、13的mRNA表達(dá)；B.qPCR檢測不同劑量Poly(I:C)刺激NPC 24 h后MMP-1、13的mRNA表達(dá)；C、D.Western blot檢測Poly(I:C)刺激NPC后MMP-1、13的蛋白質(zhì)表達(dá)；以未刺激為對(duì)照組，與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3Poly(I:C)誘導(dǎo)TLR-3、MDA-5、RIG-1基因沉默后的NPC表達(dá)MMP-1、13情況

實(shí)驗(yàn)組siRNA沉默TLR-3表達(dá)， Poly(I:C)刺激NPC 24 h后，MMP-1、13的mRNA表達(dá)量與對(duì)照組Poly(I:C)直接刺激NPC相比，表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組siRNA沉默MDA-5表達(dá)，Poly(I:C)刺激NPC 24 h后，MMP-1、13的mRNA表達(dá)量與對(duì)照組Poly(I:C)直接刺激NPC相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組siRNA沉默RIG-1表達(dá)，Poly(I:C)刺激NPC 24 h后，MMP-1、13的mRNA表達(dá)量與對(duì)照組Poly(I:C)直接刺激NPC相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

圖3 siRNA沉默TLR-3、MDA-5、RIG-1基因表達(dá)后MMP-1、13的mRNA表達(dá)結(jié)果

注：A、D. siRNA沉默TLR-3后Poly(I:C)刺激NPC表達(dá)MMP-1、13，以Poly(I:C)直接刺激為對(duì)照組；B、E. siRNA沉默MDA-5后Poly(I:C)刺激NPC表達(dá)MMP-1、13，以Poly(I:C)直接刺激為對(duì)照組；C、F. siRNA沉默RIG-1后Poly(I:C)刺激NPC表達(dá)MMP-1、13，以Poly(I:C)直接刺激為對(duì)照組；與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討論

IVDD的發(fā)生是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，引起IVDD的具體機(jī)制目前還未清楚，目前有研究[9]認(rèn)為，正常椎間盤組織中ECM成份的合成和分解處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)平衡打破，ECM成分改變時(shí)，則會(huì)引起IVDD的發(fā)生。MMPs作為ECM中主要含有的一類酶，其合成和分泌的失常是引起ECM成分改變的主要原因[10]。MMPs共分6類，含有20多個(gè)家族成員，而不同類MMPs的具體生物學(xué)作用不同，同一類型的MMPs在不同類型細(xì)胞中的表達(dá)量也不同。MMP-1、13屬于間質(zhì)膠原酶，其主要作用為水解纖維膠原，當(dāng)ECM中MMP-1、13表達(dá)升高時(shí)，纖維膠原降解，最終引起IVDD發(fā)生。既往研究[11-12]表明，IVDD中均檢測到MMP-1、13的表達(dá)量較正常椎間盤組織升高，因此，本實(shí)驗(yàn)通過研究影響MMP-1、13表達(dá)升高的因素，探究引起IVDD發(fā)生的原因。

不同類型細(xì)胞中，Poly(I:C)可以誘導(dǎo)多種MMPs的表達(dá)，如皮膚成纖維細(xì)胞中Poly(I:C)可通過IRF-3誘導(dǎo)MMP-1、2、3的表達(dá)[13]；肺成纖維細(xì)胞中Poly(I:C)促進(jìn)MMP-1、2、9的表達(dá)[14]；軟骨細(xì)胞中Poly(I:C)可誘導(dǎo)MMP-13的表達(dá)升高[15]。而在NPC中，Poly(I:C)是否可以調(diào)節(jié)MMP-1、13的表達(dá)，目前還未有研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過qPCR和Western blot方法，檢測Poly(I:C)刺激NPC后，MMP-1、13的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況，結(jié)果顯示：不同劑量的Poly(I:C)刺激不同時(shí)間，MMP-1、13的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。由此表明，病毒感染人體后，可以誘導(dǎo)NPC合成和分泌MMP-1、13，為進(jìn)一步研究病毒在IVDD發(fā)生過程中所起的作用提供依據(jù)。

Poly(I:C)作為配體作用于細(xì)胞的過程中，主要與TLR-3相結(jié)合發(fā)揮作用，而在某些類型細(xì)胞中，Poly(I:C)也可被MDA-5和RIG-1這兩種受體識(shí)別[16]，進(jìn)而發(fā)揮作用。因此，Poly(I:C)誘導(dǎo)NPC產(chǎn)生MMP-1、13的過程中，既可能依賴TLR-3途徑發(fā)揮作用，也可能與MDA-5和RIG-1兩種受體相結(jié)合發(fā)揮作用。為探明IVDD過程中，Poly(I:C)誘導(dǎo)NPC表達(dá)MMP-1、13依賴何種途徑，實(shí)驗(yàn)采用基因沉默方法，分別使用TLR-3、MDA-5和RIG-1對(duì)應(yīng)的siRNA沉默3種受體表達(dá)后，檢測Poly(I:C)刺激NPC后MMP-1、13的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示：沉默TLR-3表達(dá)后，Poly(I:C)刺激NPC后MMP-1、13的mRNA表達(dá)量相比對(duì)照組明顯降低(P<0.05)；而沉默MDA-5和RIG-1表達(dá)后，Poly(I:C)刺激NPC后MMP-1、13的mRNA表達(dá)量相比對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此，Poly(I:C)誘導(dǎo)NPC表達(dá)MMP-1、13過程依賴于TLR-3途徑，而非MDA-5和RIG-1兩種途徑。由此說明，在人NPC中，Poly(I:C)主要依賴與TLR-3相結(jié)合誘導(dǎo)MMP-1、13兩種金屬蛋白酶表達(dá)，TLR-3在病毒感染機(jī)體引起IVDD的過程中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，IVDD的發(fā)生可能與機(jī)體感染病毒有關(guān)(病毒感染可能是誘發(fā)IVDD的因素之一)。Poly(I:C)作用于NPC通過TLR-3受體途徑，引起MMP-1、13的表達(dá)量改變，進(jìn)而引起ECM平衡改變，最終導(dǎo)致IVDD發(fā)生。因此，深入研究病毒感染對(duì)IVDD發(fā)生的影響，對(duì)探討引起IVDD的因素具有一定意義。同時(shí)，也為IVDD的研究提供了新方向，給臨床治療IVDD提供了新思路。由于IVDD中MMPs表達(dá)升高往往伴隨炎癥因子的表達(dá)上調(diào)，因此，進(jìn)一步研究方向?qū)⑹荘oly(I:C)誘導(dǎo)NPC表達(dá)MMP-1、13是否依賴其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，何種因子參與了這個(gè)過程。

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TheEffectofPoly(I:C)ontheExpressionofMMP-1andMMP-13inHumanNucleusPulposusCells

XiaXinyu1,HuSong2,LiuYang2,ZouQiang2,ChangShan3△.

1.SchoolofBasicMedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China;2.CenterforScientificResearch,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China;3.DepartmentofOrthopedics,TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

ObjectiveTo explore the effect of polyinosinic-polycytidylic acid (Poly (I:C)) on the expression of matrix metalloproteinases (MMP)-1and MMP-13in human nucleus pulposus cells (NPC).MethodsThe human nucleus pulposus cells were isolated by enzyme digestion from the human disc tissue and cultured in vitro. The human nucleus pulposus cells were treated with Poly (I:C) with different dosages at different time and then the mRNA and protein expression levels of MMP-1and MMP-13were detected by qPCR and Western blot. TLR3, RIG-I and MDA-5were inhibited by siRNAs respectively and then the mRNA expression level of MMP-1and MMP-13in the human nucleus pulposus cells were detected by qPCR.ResultsThe human nucleus pulposus cells grew with adherence after being cultured in vitro after5to6days. Poly(I:C) significantly increased the mRNA and protein expression levels of MMP-1and MMP-13in the human nucleus pulposus cells (P<0.05). The expression level of MMP-1and MMP-13significantly decreased in the cells transfected with TLR-3siRNA (P<0.05), while there were no significant differences among the expression levels of MMP-1and MMP-13in the cells transfected with RIG-1siRNA and MDA-5siRNA respectively.ConclusionPoly (I:C) upregulated the expression of MMP-1and MMP-13in human nucleus pulposus cells via TLR3mediated mechanism.

Nucleus pulposus cells; Poly (I:C); MMP-1and MMP-13; TLR-3

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170707.0948.006.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.04.014

四川省教育廳科研項(xiàng)目(No:14ZA0225)

：常山，E-mail：sayufeng@163.com

R363

A

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