黃芩苷與人源RANKL胞外結構域相互作用的研究

陳相如，汪勁松，王衛東，張新潮，潘繼承

(1.湖北師范大學 生命科學學院，湖北 黃石 435002； 2.食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435002)

黃芩苷與人源RANKL胞外結構域相互作用的研究

陳相如1,2，汪勁松1,2，王衛東1,2，張新潮1,2，潘繼承1,2

(1.湖北師范大學 生命科學學院，湖北 黃石 435002； 2.食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435002)

細胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-kappa B ligand，RANKL)源于成骨細胞，對于破骨細胞分化和激活具有重要作用。RANKL能與破骨細胞表面受體RANK(receptor activator of NF-kappa B)結合，骨保護素(osteoprotegerin，OPG)作為誘騙受體競爭性地與RANKL結合，兩者共同調節骨平衡。兩者調節異常會引起骨形成與骨吸收失衡，導致骨代謝性疾病發生，如骨質疏松癥、關節炎等。黃芩苷，是從傳統中藥黃芩中提取的黃酮類化合物，在醫藥行業中被廣泛應用。熒光光譜法實驗表明：在體外黃芩苷對RANKL胞外結構域的內源熒光有明顯的猝滅作用，黃芩苷使RANKL內部生色基團所處微環境的極性增大；蛋白ANS熒光峰強度隨著黃芩苷的濃度先增后降，在8×10-5mol/L時達到峰值，說明RANKL疏水面暴露程度可能先增大后減小，在8×10-5mol/L時，疏水面暴露程度最大；分子模擬結果顯示：黃芩苷與人源RANKL/OPG-CRD復合物之間有較強的相互作用，且位于該復合物中心內部空腔，說明兩者結合緊密，預測了兩者相互作用的氨基酸位點。但黃芩苷是否抑制RANKL-RANK結合需進一步研究。研究黃芩苷與RANKL相互作用對闡明調節骨代謝紊亂及抗癌機理具有重要意義。

RANKL/RANK/OPG；黃芩苷；熒光光譜法；分子模擬

骨平衡由成骨細胞的骨形成功能和破骨細胞的骨吸收功能共同調節。細胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor κB ligand，RANKL)是一種Ⅱ型跨膜蛋白，由成骨細胞產生，對于破骨細胞分化和激活具有重要作用[1]。細胞核因子κB活化因子受體(receptor activator for nuclear factor κB，RANK)是一種Ⅰ型跨膜蛋白，在破骨細胞表面表達，與其配體RANKL都屬于腫瘤壞死因子家族(tumor necrosis factor receptor-ligand family)，介導破骨細胞生成[2]。骨保護素(osteoprotegerin，OPG)作為誘騙受體競爭性地與RANKL結合，能有效地抑制破骨細胞的成熟與激活[3-4]。RANKL與OPG的結合比能很好地調節骨代謝的方向，即骨形成或骨吸收。因此，RANKL與OPG的結合比調節異常會引起骨形成與骨吸收失衡，導致骨代謝紊亂性疾病發生，如骨質疏松癥、類風濕性關節炎等[5-8]。在發展治療骨吸收過量引起的骨代謝紊亂性疾病時，RANKL/RANK/OPG系統是調控破骨細胞生成的關鍵點，同時也成為公認的靶標[9]。 RANKL/RANK/OPG系統還參與了癌細胞的增殖與轉移，乳腺癌是女性患病和死亡人數最高的惡性腫瘤，遠處轉移是乳腺癌致死的主要原因，阻斷RANKL與RANK的結合可以達到間接抗癌的療效。

黃芩苷(Baicalin)是黃芩主要活性成分之一，屬于黃酮類化合物，具有降壓、鎮靜、抗菌、消炎、解熱、抗病原體、抗癌、修復腦損傷、保肝利膽、改善糖尿病腎病等多種藥理作用[10]。近年來，黃芩苷在口腔醫學領域研究較多，尤其是治療牙周炎方面有明顯效果，黃芩苷可以有效的抑制 LPS 誘導的大鼠牙周炎牙槽骨的吸收，可以降低人牙周膜細胞表面RANKL/OPG比值等[11]。Guo A J等人報道，黃芩苷通過Wnt/β-catenin誘導成骨細胞的分化，增強OPG mRNA表達水平，直接參與破骨細胞的活性的調控[12]。黃芩苷在骨質疏松癥預防與治療領域研究較少，由于黃芩苷可以調控RANKL/OPG表達，從理論上可以推測黃芩苷可以成為骨質疏松癥的潛在藥物。最近，桂林源等人(2016年5月)發現，用黃芩提取物(以總黃酮含量計算)對雌性骨質疏松模型SD大鼠進行腹腔注射后，骨體積和骨小梁數目增加，促進了骨髓間充質干細胞的增殖和成骨分化，可以在一定程度上預防和治療雌激素缺乏所致的骨質疏松[13]。

在人源RANKL/RANK信號通路中，黃芩苷與RANKL相互作用的研究尚無相關研究報道。為使傳統中藥黃芩在預防和治療骨質疏松方面具有更深入的研究，充分發揮其藥用價值，達到舊藥新用的目的，同時為體外研究人源RANKL的結構提供依據。因此，挖掘黃芩有效成分新功能以及深入研究人源RANKL的結構十分必要。本項研究采用熒光光譜法和分子模擬，研究黃芩苷與人源RANKL胞外結構域相互作用的熒光猝滅，同時預測黃芩苷與RANKL/RANK復合物相互作用的活性位點，嘗試解釋兩者的作用機理，但黃芩苷是否抑制RANKL與RANK結合以及臨床效果需進一步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

載體和菌種：pGEX-6P-1和E.coli Rosseta(DE3)，由本實驗室保存。

1.2 試劑與儀器

試劑：黃芩苷(黃石市藥品檢驗所提供)；氨芐霉素(Amp)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)等購自Amresco；1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)均購自Sigma；Ni親和層析柱填料購自GE。

實驗中常見溶液的配制參見《分子克隆(第三版)》[14]。

儀器：熒光分光光度計F-4500(Hitachi,Japan)、XO-650超聲波細胞粉碎機(南京先歐生物科技有限公司)、HD-3紫外檢測儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)、YC-1型電腦恒溫層析柜(北京博醫康實驗儀器有限公司)。

1.3 人源RANKL胞外結構域的表達與純化

本實驗室已將人源RANKL(141-317)號位氨基酸的活性區域重組至原核表達載體pGEX-6P-1，并通過表達菌株E.coliRosseta(DE3)進行人源RANKL胞外結構域(RANKL ectodomain,eRANKL)的誘導、表達與純化。操作過程中的具體條件參照文獻[15]。

1.4 黃芩苷與RANKL相互作用的熒光光譜法測定

1.4.1 黃芩苷工作液的配置

用DMSO作溶劑配置濃度為0.01 mol/L的黃芩苷母液，用0.01 mol/L PBS逐級稀釋得到0、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100×10-5mol/L的工作液。保證每組中DMSO和PBS量一致，黃芩苷濃度為單一變量，配置體系見表1。

表1 黃芩苷濃度體系(1 mL)

1.4.2 內源熒光的測定

調整RANKL濃度為22.56 μmol/L(A280=0.8)，采用表1中黃芩苷濃度梯度。固定反應體系中RANKL蛋白濃度，增加黃芩苷用量，考察RANKL的熒光強度變化。反應體系見表2。

表2 內源熒光反應體系

分別在10、20、30℃水浴30 min后，進行熒光光譜掃描，激發光波長295 nm，激發狹縫2.5 nm，發射狹縫5 nm，電壓700V，掃描速度1200 nm/min，記錄300～400 nm波段光譜數據。

1.4.3 外源熒光的測定

調整RANKL濃度為22.56 μmol/L(A280=0.8)，采用表1中黃芩苷濃度梯度。避光稱取ANS，蒸餾水溶解，離心(12000 r/min,5min)，避光取上清，立即使用。ANS濃度為蛋白50倍，按1:100加入蛋白溶液。反應體系見表3。

30℃水浴避光反應30min后，進行熒光光譜掃描，激發光波長380 nm，激發和發射狹縫均設為5 nm，電壓700V，掃描速度1200 nm/min，記錄400～600 nm波段光譜數據。

表3 ANS熒光反應體系

1.5 黃芩苷與人源RANKL/OPG復合物的分子模擬

人源RANKL與人源OPG上4個半胱氨酸富集區(cysteine rich domain,CRD)結合所形成的復合體(RANKL /OPG-CDR)的3D晶體結構是從PDB (http://www.pdb.org/,PDB ID: 3URF)中獲取。參照文獻[16]方法，在Sybyl-X 2.1.1中對蛋白和黃芩苷優化，柔性對接。

2 結果和分析

2.1 RANKL表達與純化

M：Marker；0：上清；1：40 mmol/L；2：80 mmol/L；

由圖1看出，通過Ni親和層析在150 mmol/L和200 mmol/L洗脫下來的蛋白經過SDS-PAGE的檢測，目標蛋白約為21 KD，且均一性較高。

2.2 內源熒光光譜

2.2.1 黃芩苷對RANKL內源熒光的猝滅作用

在本實驗條件下，熒光譜340 nm處有一熒光發射峰，不同溫度下的實驗結果見圖2。

圖(a)、(b)、(c)分別表示在10℃、20℃以及30℃溫度下，黃芩苷對RANKL作用，RANKL濃度為22.56 μmol/L，1～10分別代表表1中黃芩苷的濃度梯度。內插圖中“▲”表示最大熒光發射峰強度，“●”表示最大熒光發射峰強度對應的發射波長

圖2 三種溫度下黃芩苷與RANKL相互作用的內源熒光圖譜

由圖2可以看出，隨著黃芩苷濃度增加，RANKL熒光發射峰強度減弱，發射波長明顯紅移，說明黃芩苷使RANKL內部生色基團所處微環境的極性增大，RANKL構象發生變化。

2.3 外源熒光圖譜

ANS通過非共價結合蛋白分子的非極性區域中，其熒光光譜會隨著非極性的增加而發生藍移，且熒光強度也會隨之提高。30℃下，黃芩苷與RANKL相互作用的ANS熒光見圖3。

RANKL濃度為22.56 μmol/L，1～12分別代表表1中黃芩苷的

實驗結果顯示，隨著黃芩苷濃度的增加，蛋白ANS熒光峰強度先逐漸增加后逐漸下降，在8×10-5mol/L時達到峰值。說明RANKL疏水面暴露程度先增大后減小，在8×10-5mol/L時，疏水面暴露程度最大。

2.4 黃芩苷與人源RANKL/OPG復合物的分子模擬

Xudong Luan等人發表的人源RANKL結構域與OPG中4個半胱氨酸富集區所形成的晶體結構用于與黃芩苷分子對接，其中OPG中4個半胱氨酸的富集區(OPD-CRD)與人源RANK胞外結構域中4個半胱氨酸的富集區(RANK-CRD)序列相同[17]，這也是OPG能作為RANKL誘騙受體的主要原因。分子對接全局和局部情況見圖4，作用位點信息見表4。

(a)全局圖展示了黃芩苷在RANKL/OPG-CRD復合物中的具體位置；(b)局部圖顯示了黃芩苷分別在RANKL和OPG-CRD分別作用的氨基酸位點，黃色虛線表示氫鍵，黃色數字表示氫鍵鍵長，藍色β-折疊帶來自RANKL，綠色β-折疊帶來自OPG-CRD。

圖4 黃芩苷與人源RANKL/OPG-CRD復合物分子對接

黃芩苷與人源RANKL/OPG-CRD復合物分子對接的總得分為7.638，屬于高分，兩者作用的氫鍵有9個，表明黃芩苷與RANKL/OPG-CRD間氫鍵相互作用力較強，結合緊密。從對接的全局圖來看，黃芩苷恰好被復合物內部中心空腔包裹。從局部圖來看具體作用的氨基酸位點，很可能是黃芩苷發揮作用的位點。分子模擬結果為黃芩苷阻止RANKL/RANK復合物形成的機制提供理論依據。

3 結論

我們通過研究黃芩苷影響RANKL胞外結構域的聚集狀態，進而影響RANKL/RANK通路的形成。熒光光譜學數據表明：在體外，黃芩苷對RANKL內源熒光強度的減弱均呈劑量依賴關系，黃芩苷對RANKL的內源熒光有明顯的猝滅作用，黃芩苷使RANKL內部生色基團所處微環境的極性增大；蛋白ANS熒光峰強度與黃芩苷濃度并無劑量依賴關系，而是先增加后降低，在8×10-5mol/L時達到峰值，說明RANKL疏水面暴露程度可能先增大后減小，在8×10-5mol/L時，疏水面暴露程度最大。分子模擬結果顯示，黃芩苷與人源RANKL/OPG-CRD復合物之間有較強的相互作用，且位于該復合物中心內部空腔，說明兩者結合緊密，預測了兩者相互作用的氨基酸位點。推測黃芩苷可能有利于阻止RANKL-RANK復合物的形成，但在體外還需要通過等溫滴定量熱法進一步證明。黃芩苷在細胞水平和動物水平是否有效還需進一步深入研究，同時可以結合結構生物學方法準確地找出兩者結合的具體位置以及開展動物學實驗。

綜上所述，在體外黃芩苷能影響RANKL的結構變化，可能影響RANKL與RANK的結合，從而可能阻止RANKL/RANK信號通路的開啟，達到間接治療骨質疏松和抗癌藥效。因此，黃芩苷可能成為骨質疏松、乳腺癌等疾病的潛在藥物。

[1] Willard D,Chen W J,Barrett G,et al. Expression,purification,and characterization of the human receptor activator of NF-kB ligand(RANKL) extracellular domain[J]. Protein Expr Purif,2000,20:48-57.

[2] Ta H M,Nguyen G T,Nguyen G T,et al. Structure-based development of a receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) inhibitor peptide and molecular basis for osteopetrosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2010,107:20281-20286.

[3] Simonet W S,Lacey D L,Dunstan C R,et al. Osteoprotegerin: A novel secreted protein involved in the regulation of bone density[J]. Cell,1997,89:309-319.

[4] Yasuda H,Shima N,Nakagawa N,et al. Identity of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin (OPG): A mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro[J]. Endocrinology,1998,139:1329-1337.

[5] Tanaka S,Nakamura K,Takahasi N,et al. Role of RANKL in physiological and pathological bone resorption and therapeutics targeting the RANKL-RANK signaling system[J]. Immunol Rev,2005,208:30-49.

[6] Vega D,Maalouf N M,Sakhaee K. CLINICAL Review: The role of receptor activator of nuclear factor-kappaB (RANK)/RANK ligand/osteoprotegerin: clinical implications[J].J Clin Endocrinol Metab,2007,92:4514-4521.

[7] Theoleyre S,Wittrant Y,Tat S K,et al. The molecular triad OPG/RANK/RANKL: Involvement in the orchestration of pathophysiological bone remodeling[J]. Cytokine Growth Factor Rev,2004,15:457-475.

[8] Wright H L,McCarthy H S,Middleton J,et al. RANK,RANKL and osteoprotegerin in bone biology and disease[J]. Curr Rev Musculoskelet Med,2009,2:56-64. [9] Hur J,Ghosh A,Kim K,et al. Design of a RANK-mimetic peptide inhibitor of osteoclastogenesis with enhanced RANKL-binding affinity[J]. Mol Cells,2016,39:316-321.

[10] 歐陽俊杰. 黃芩苷及其衍生物抗病原體作用研究新進展[J]. 宜春學院學報，2015，37:28-30.

[11] 陳 悅.黃芩苷抑制牙周炎牙槽骨吸收的作用及機理研究[D].西安：第四軍醫大學，2008.

[12] Guo A J,Choi R C,Cheung A W,et al. Baicalin,a flavone,induces the differentiation of cultured osteoblasts[J]. J Biol Chem,2011,286:27882-27893.

[13] 桂林源，劉世宇，邱新毓，等. 黃芩小分子化合物對雌激素缺乏骨質疏松的預防和治療作用[J].牙體牙髓牙周病學雜志,2016,26(5):294-300.

[14] 莎姆布魯克 J,拉塞爾 D W.分子克隆實驗指南[M].3版.黃培堂,譯.北京：科學出版社，2002.

[15] 習雪麗. 生物活性多糖及黃酮類化合物與人源RANKL胞外結構域相互作用的研究[D].黃石：湖北師范大學，2014.

[16] Mi R,Li P Q,Hu Y J,et al. Biophysical studies on the interactions of jatrorrhizine with bovine serum albumin by spectroscopic and molecular modeling methods[J]. Mol Biol Rep,2013,40:4397-4404.

[17] Luan X,Lu Q,Jiang Y,et al. Crystal structure of human RANKL complexed with its decoy receptor osteoprotegerin[J]. J Immunol,2012,189:245-252.

(本文文獻格式：陳相如，汪勁松，王衛東，等.黃芩苷與人源RANKL胞外結構域相互作用的研究[J].山東化工,2017,46(7):56-60.)

The Study of the Interaction Between Baicalin and Human RANKL Ectodomain

ChenXiangru1,2,WangJinsong1,2,WangWeidong1,2,ZhangXinchao1,2,PanJicheng1,2*

(1.College of Life Science, Hubei Normal University; Huangshi 435002,China; 2.Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation and Utilization, Huangshi 435002,China)

RANKL (receptor activator of NF-kappa B ligand), steming from osteoblast, play an important role in the osteoclast differentiation and activation. RANKL can bind osteoclast surface receptor RANK(receptor activator of NF-kappa B), and OPG (osteoprotegerin), as decoy receptor,competitively combine with RANKL,which they jointly regulate the bone balance. The RANKL/RANK/OPG dysregulation causes the imbalance between bone formation and resorption,which results in bone metabolic diseases,such as osteoporosis,arthrophlogosis,et al. Baicalin,a kind of flavonoid extracted from Scutellaria baicalensis Georigi―a traditional Chinese medicine,are widely applied in the field of medicine. Fluorescence spectral measurements data showed that with the baicalin’s concentration increasing,accompanied with the fluorescence emission intensity dropping,the emission wavelength red-shift occurred. Further,ANS fluorescence data also showed that baicalin could result emission intensity obvious change. Thus,combined with intrinsic and ANS fluorescence evidences,and an conclusion seemed to be drawn that baicalin could cause RANKL’s conformational change. The results of molecular simulation revealed the existence of combination between baicalin and human RANKL/OPG-CRD (cysteine rich domain) ,which located in the inner cavity of RANKL/OPG-CRD compound,and predict the concrete amino acid residue sites of the stronger binding. The study of the interaction between baicalin and human RANKL carry important implication on the demonstration of the dysregulation of bone metabolism and the anticancer mechanism.

RANKL/RANK/OPG;baicalin;fluorescence spectral measurements;molecular simulation

2017-02-20

陳相如(1990—)，男，湖北武穴人，碩士研究生，研究方向：蛋白質結構與功能；通訊作者：潘繼承，教授。

TQ461

A

1008-021X(2017)07-0056-05