高效液相色譜手性固定相法拆分山莨菪堿

郭小倩，沈靜茹，沙 濤，章冰娜，舒亞玲，雷新友

(中南民族大學 化學與材料科學學院 分析化學國家民委重點實驗室，湖北 武漢 430074)

高效液相色譜手性固定相法拆分山莨菪堿

郭小倩，沈靜茹*，沙 濤，章冰娜，舒亞玲，雷新友

(中南民族大學 化學與材料科學學院 分析化學國家民委重點實驗室，湖北 武漢 430074)

以雙[-6-氧-(-3-脫氧檸檬酸單脂-4)]-β-環糊精鍵合全多孔型硅珠為HPLC手性固定相，以甲醇和三氟乙酸-三乙胺緩沖液為流動相，探究流動相比例、緩沖液濃度、緩沖液pH值、檢測波長、色譜柱溫和流速等條件對山莨菪堿二個外消旋體拆分效果的影響。在最佳分離條件(三氟乙酸濃度2mmol/L，pH值4.1，V甲醇∶V緩沖液=50%∶50%，流動相流速為0.5 mL/min，色譜柱溫20℃，檢測波長235nm)下山莨菪堿混合物被拆分為二個外消旋體，實現了基線分離，Rs達4.20；并得到了四個對映異構體拆分的結果。

山莨菪堿；手性分離；雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環糊精；高效液相色譜手性固定相

以環糊精(CD)及其衍生物作為手性選擇劑在高效液相色譜手性固定相中實現藥物拆分仍舊是目前非常重要的工具[1]。環糊精獨特的分子結構，同時擁有疏水性空腔和親水性邊緣，對手性拆分十分有利[2]。 β-環糊精衍生物更是具有優良的選擇性和廣泛的分離范圍[3]。山莨菪堿(Anisodamine)，含兩個手性中心，是一種作用于自主神經系統的抗膽堿藥物[4]。在臨床方面，山莨菪堿對過敏性休克、急性腎炎導致的合并心力衰竭、突發闌尾炎、高血壓導致的腦部疾病甚至敵敵畏中毒等均取得了較好療效，另外對于治療美尼爾氏綜合征、炮震性耳聾、妊娠中毒癥、胰腺炎、視網膜脈絡膜炎、顱腦外傷等疾患亦有不同程度的療效[5]。因其對多種疾患的良好治療效果，使得山莨菪堿對映體的分離研究十分必要[6]，Yang L M等人用ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱將山莨菪堿拆分為兩個外消旋體，然后用Daicel 的CHIRALPAK AD-H柱(在5μm粒徑硅珠表面涂覆直鏈淀粉衍生物手性柱)在液相色譜中分離了山莨菪堿的兩對異構體。本文用雙 [-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-CD鍵合硅珠手性HPLC固定相，實現了山莨菪堿外消旋體混合物的拆分，在一根HPLC手性柱上同時將山莨菪堿拆分為二個外消旋體，達到基線分離，同時實現了山莨菪堿四個對映異構體拆分的結果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀UItimate3000(賽默飛世爾科技有限公司)，超聲波清洗器(寧波科生儀器廠，As3120型)；酸度計(上海偉業儀器廠，ZD-2型)；電磁攪拌器(上海華光儀器儀表廠，CJ-1型)；山莨菪堿標準品(中國食品藥品檢定研究所)；其它試劑均為分析純。

1.2 樣品前處理及實驗條件

配制濃度4.2×10-4mol/L山莨菪堿標準品，經0.22μm濾膜過濾。將市售99.5%三乙胺與三氟乙酸配制成不同pH值的緩沖溶液，并與甲醇按比例混合作為流動相。流動相分別用0.22μm水系膜和有機膜過濾，脫氣，備用。

色譜柱：自制雙[-6-氧-(-3-脫氧檸檬酸單脂-4)]-β-環糊精鍵合硅珠固定相HPLC手性柱(150 mm×Φ4.6mm)；甲醇與三氟乙酸(濃度2mmoL/L)緩沖液為流動相，檢測波長235nm，流速0.5mL/min，進樣量20μL，柱箱溫度20℃。

2 結果與討論

2.1 探究緩沖液pH值變化對山莨菪堿分離情況的影響

以V甲醇∶V三氟乙酸-三乙胺=50%∶50%，在1.2的色譜條件下，山莨菪堿標準品濃度為4.2×10-4mol/L，緩沖液pH值在3.0～6.7范圍變化。結果示例如圖1所示，pH值3.0時，山莨菪堿混合物二外消旋體有較好分離，在pH值為4.1時，水峰干擾小；隨著酸度減小，pH值達到6.0時，可以發現分離出多個峰，存在多個對映體的分離。

a)pH值3.0；b)pH值4.1；c)pH值6.0

圖1 不同pH值條件下的HPLC圖

Fig.1 HPLC chromatograms under different pH conditions

2.2 探究流動相配比變化對山莨菪堿分離情況的影響

以三氟乙酸-三乙胺緩沖液pH值為4.1，在1.2色譜條件下，山莨菪堿標準品濃度為4.2×10-4mol/L，調節V甲醇∶V緩沖液分別為60%∶40%，50%∶50%，40%∶60%，30%∶70%，20%∶80%，拆分結果示例如圖2所示，結果顯示，緩沖體系中V甲醇∶V緩沖液的變化對分離結果影響較大，當流動相中甲醇比例較高，占60%時，有分離跡象，但峰形對稱性不高，分離度不佳；隨著甲醇含量降至50%時，山莨菪堿二個外消旋體混合物達到較好分離，且峰形對稱；隨著甲醇含量繼續降低，對映體的分離逐步實現。

圖2 不同流動相配比條件下的HPLC圖

Fig.2 HPLC chromatograms under different mobile phase ratios

2.3 精密度和線性范圍

在山莨菪堿混合物二個外消旋體最佳分離條件下將濃度為4.2×10-4mol/L的山莨菪堿標準品重復進樣7次，計算得到二個外消旋體的保留時間tR、峰面積A、峰高h和分離度Rs各參數的RSD分別為0.16%、0.04%、1.42%、0.16%，1.76%、0.11%和1.82%，分離度RS值均在4.29至4.60之間，說明二個外消旋體色譜峰保留時間的重現性最佳，峰面積重現性也優于峰高的重現性，而且后峰各項參數的重現性都優于前峰，說明溶劑對前峰有一定影響，分離度的重現性也低于2%。 山莨菪堿標準品溶液濃度在2.10×10-4～1.05×10-3mol/L范圍內，分別考察峰高、峰面積與濃度的線性關系，結果顯示前峰峰面積-濃度線性方程為y=2884x-2.518，線性相關系數r=0.9894；前峰峰高-濃度線性方程為y=20038x-2.212，線性相關系數r=0.9869；后峰峰面積-濃度線性方程為y=3911x-0.528，線性相關系數r=0.9935；后峰峰高-濃度線性方程為y=23623x-3.629，線性相關系數r=0.9955。說明山莨菪堿二個外消旋體在該濃度范圍內，呈現出良好的線性關系，后峰的線性關系優于前峰。

2.4 對比試驗

圖3 對比試驗

Fig.3 The comparison spectrum在1.2的色譜條件下以V甲醇∶V緩沖液=20%∶80%，緩沖液pH值為4.1，用4.2×10-4mol/L山莨菪堿標準品與溶劑水作對照實驗，結果如圖3所示，圖3a為山莨菪堿的四個異構體完全分離色譜圖，圖3b顯示溶劑(水)峰對山莨菪堿的分離干擾有限。

3 總結

使用自制的以雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環糊精為手性選擇劑的HPLC色譜柱，在Ultimate3000智能型高效液相色譜儀上對山莨菪堿的拆分結果是有效的，獲得了山莨菪堿混合物的二個外消旋體手性分離的最佳分離條件，考察精密度，各參數RSD均小于2%。在2.10×10-4～1.05×10-3mol/L范圍內，山莨菪堿的二個外消旋體濃度與峰高和峰面積有線性相關性，在甲醇與緩沖液體積比為20∶80, 其他條件不變時，可實現山莨菪堿的四個對映異構體的拆分，在一根色譜柱上同時實現了山莨菪堿二個外消旋體和四個對映異構體的分離，為高效液相色譜手性固定相法拆分山莨菪堿提供了新方法。

[2] Xia L,Zhou Z M,Di X,et al.Enantiomeric separation in high-performance liquid chromatography using novel β-cyclodextrin derivatives modified by R-configuration groups as chiral stationary phases[J]. Talanta,2011,84(4):1080-1092.

[3] Li L,Zhang M,Wang Y,et al.Preparation of chiral oxazolinyl-functionalized β-cyclodextrin-bonded stationary phases and their enantioseparation performance in high-performance liquid chromatography[J].Journal of separation science,2016,39(21):4136-4146.

[4] Bai S,Fu X,Gu X,et al.Intracoronary administration of different doses of anisodamine in primary percutaneous coronary intervention: protective effect in patients with ST-segment elevation myocardial infarction[J].Coronary Artery Disease,2016,27(4):302-310.

[5] Eisenkraft A,Falk A.Possible role for anisodamine in organophosphate poisoning[J].British Journal of Pharmacology,2016,173(11):1719-1727.

[6] Yang L M,Xie Y F,Chen H Z,et al.Diastereomeric and enantiomeric high-performance liquid chromatographic separation of synthetic anisodamine[J].Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis,2007,43(3):905-909.

(本文文獻格式：郭小倩，沈靜茹，沙 濤，等.高效液相色譜手性固定相法拆分山莨菪堿[J].山東化工,2017,46(7):110-111,114.)

Separate Anisodamine Enantiomers by the Chial High Performance Liquid Chromatography Stationary Phase

GuoXiaoqian，ShenJingru*，ShaTao，ZhangBingna，ShuYaling，LeiXinyou

(Key Laboratory of Analytical Chemisty of the State Ethnic Affair Commission, College of Chemistry and Materials Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

Anisodamine enantiomers have been separated by a chiral chromatographic column with bis-[6-oxygen-(3-deoxycitric acid monoester-4)]-β-cyclodextrin. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to explore the optimum resolution conditions of anisodamine racemic mixture. The optimum conditions: detection wavelength 235nm, pH4.1, trifluoroacetic acid concentration is 2.0mmol/L, Vmethanol∶ Vbufferis 50%∶50%, the flow rate is 0.5mL/min, and the temperature of column is 20℃. Under this condition, the anisodamine racemic mixtures have been separated andRsis 4.20，and a HPLC method for four enantiomorphism isomers separation results has been developed.

anisodamine;enantioseparation;bis-[6-oxygen-(3-deoxycitric acid monoester-4)]-β-cyclodextrin; HPLC chiral stationary phase

2017-01-08

中央高校基金資助項目(CZW14053)

郭小倩(1990—)，女，湖北荊州人，碩士研究生，主要從事手性藥物拆分研究。

O657.7+2

A

1008-021X(2017)07-0110-02