食神鞘氨醇桿菌（Sphingo spiritivorum）肝素酶的制備和性質研究

尹思遠 白佳珂 李鋰 馬小來

（深圳市海普瑞藥業集團股份有限公司，深圳 518057）

食神鞘氨醇桿菌（Sphingo spiritivorum）肝素酶的制備和性質研究

尹思遠 白佳珂 李鋰 馬小來

（深圳市海普瑞藥業集團股份有限公司，深圳 518057）

篩選新型肝素酶產生菌，制備新型肝素酶并對其降解肝素能力進行測試。采用定向富集方法對土壤中的菌群進行培養，篩選分離產肝素酶的新種菌株，利用微生物發酵和蛋白純化技術制備肝素酶，考察新型肝素酶的理化性質和酶切位點，之后使用新型肝素酶降解肝素并測試產物特征。篩選分離得到1株新的肝素酶產生菌，屬食神鞘氨醇桿菌（Sphingo spiritivorum）。發酵后得到的粗酶，經多步柱層析純化后得到的新型肝素酶SShepI和SShepII，用得到的酶降解肝素得到兩種新型酶制低分子肝素。利用食神鞘氨醇桿菌中分離純化得到的兩種新型肝素酶SShepI和SShepII制備的新型酶制低分子肝素，有望開發成抗凝血效果更佳或具有新臨床功能的低分子肝素藥物。

食神鞘氨醇桿菌；肝素酶；制備；性質

肝素和低分子肝素是一大類復雜的黏多糖天然藥物，廣泛用于臨床抗凝血治療，低分子肝素因其副作用低而應用更為廣泛［1-2］。目前，化學裂解法和酶降解法是國內外制備低分子肝素的兩種主要方法［3］。化學裂解法的成本較低，目前的大品牌低分子肝素如依諾肝素、達肝素、那曲肝素及帕肝素等都是經化學降解而來。但化學裂解的工藝過程較復雜，往往會產生環保問題，而且低分子肝素生產過程中使用的有毒有害溶劑會對生產人員的健康造成損害。酶降解法反應條件溫和、易操作，對環境友好，丹麥利奧公司的汀肝素即由肝素酶裂解肝素而來［4］，但這種低分子肝素因為酶切位點不理想而存在收率偏低的問題。

肝素酶是一種肝素類多糖裂解酶，能夠將肝素降解為低分子肝素或肝素寡糖，在低分子肝素生產和肝素質量檢測等方面具有重要的應用。現階段，已發現許多種微生物中均存在肝素酶，包括肝素黃桿菌（Flavobacterium heparinum）［5］、解肝素擬桿菌（Prevotella heparinolytica）［6］、棒桿菌（Corynebacterium sp.）［7］、環狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）［8］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［9］、鞘胺醇桿菌（Sphingo bacterium sp.）［10］和糞便擬桿菌（Bacteroides stercoris）HJ-15［11］，其中，只有肝素黃桿菌中的肝素酶得到商業化應用。

本研究從土壤中篩選分離得到新型產肝素酶菌種食神鞘氨醇桿菌（Sphingo spiritivorum），對其進行微生物發酵和肝素酶分離純化，得到新型肝素酶SShepI與SShepII，并對兩種新型肝素酶進行了一些性質研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 食神鞘氨醇桿菌（Sphingo. spiritivorum），分離自成都市杜甫草堂遺址附近土壤。1.1.2 試劑 肝素（海普瑞公司自產高純度原料藥）、酵母抽提物、蛋白胨（Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshinre，England），SP Sepharose Fast Flow（GE Healthy）、Q Sepharose Fast Flow（GE Healthy）、Cellufine Sulfate（GE Healthy）、丙烯酰胺（Fluka產品）、甲叉雙丙烯酰胺（Fluka產品）、Tris（Amresco進口分裝）、低分子量標準蛋白（上海源聚生物科技有限公司）、其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器 F6H120717B超凈工作臺（深圳寶源凈化有限公司）、RC12BP低速冷凍離心機（賽默飛世爾科技公司）、AUY220電子天平（日本島津公司）、AYC-2102C恒溫培養振蕩器（上海新苗醫療器械制造有限公司）、YXO-LS-75SII高壓蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司）、層析柱、BS-160A自動收集器（上海金鵬分析儀器有限公司）、e2695高效液相色譜儀（美國沃特斯（Waters）公司）、色譜柱、紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）、BCD-208K/A冰箱（海爾集團）。

1.2 方法

1.2.1 菌種篩選 成都杜甫草堂遺址附近地表以下10-15 cm處土壤約20 g，與1 g肝素粉末拌勻，室溫放置1個月。取少量土樣加入無菌水中，30℃搖床震蕩（150 r/min）2-3 h。取10 mL上清加入100 mL種子培養基中，如前震蕩大約16 h。移取20 mL菌液至200 mL發酵培養基中，再如前震蕩培養24 h。離心（4℃，5 000×g，5 min）獲得上清液，用天青A法檢測肝素濃度，取肝素明顯有消耗的菌液繼續實驗。將菌液稀釋涂布于平板培養基上，挑選出單菌落。單菌落在斜面或平板上增殖后接入種子培養基中，培養16 h后，轉接發酵培養基中培養約24 h。離心收集細胞，懸浮于25 mmol/L Tris-HCl（含10 mmol/L CaCl2，pH 7.0）緩沖液，超聲破碎，測定肝素酶活性，確認得到的菌株為產肝素酶菌株。

種子培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，加水H2O 1 L攪拌溶解后用1 mol/L NaOH調pH至7.0。1×105Pa高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

發酵培養基：肝素8 g，蛋白胨2 g，NaCl 5 g，K2HPO42.5 g，（NH4）2SO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，加水H2O 1 L攪拌溶解后用1 mol/L NaOH調pH至7.0。1×105Pa高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

固體培養基：技術瓊脂粉20 g，肝素8 g，蛋白胨2 g，NaCl 5 g，K2HPO42.5 g，（NH4）2SO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，加水H2O 1 L攪拌溶解后用1 mol/L NaOH調pH至7.0。1×105Pa高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.2.2 菌種鑒定 由廣東省微生物分析檢測中心進行菌種鑒定，通過菌株的鏡檢觀察、理化性質分析和16S rDNA與已知菌株進行基因序列比對確定未知菌株所屬的種。

1.2.3 肝素酶的制備和純化 將菌體從平板或斜面上刮取兩環接種到種子培養基中，培養16 h后，按15%接種量接入二級液體種子培養基中，培養24 h，再按20%接種量接入2 L發酵培養基中，培養24 h。收集菌液，3 800 r/min、4℃離心45 min，將沉淀懸浮在25 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含10 mmol/L CaCl2，pH 7.0）中，用高壓均質機4℃，800 bar，破碎3-4個循環，并離心30 min（12 000 r/min，4℃）。得粗酶液。

將粗酶液在冰浴條件下做硫酸銨沉淀，收取硫酸銨飽和度60%-80%的沉淀并溶解于100 mL的前述Tris-HCl緩沖液中，用4 L同樣緩沖液8-10℃過夜透析。將硫酸銨沉淀后的酶上樣于SP Sepharose Fast Flow層析柱，用200 mL 前述Tris-HCl緩沖液平衡，再用同樣緩沖液中0-0.3 mol/L NaCl（各100 mL）梯度洗脫。在上樣液和洗脫液中均分布有肝素酶活性的組分，分開收集。

將上述與SP柱結合后被洗脫下來的有酶活性的組分，用2 L前述Tris-HCl緩沖液8-10℃過夜透析，然后上CS（Cellufine Sulfate）柱。用200 mL 0.1 mol/L NaCl（溶于同樣緩沖液）平衡，再用同樣緩沖液中0.1-1 mol/L NaCl（各100 mL）梯度洗脫，收集洗脫液中有活性的組分。

將上述CS柱后收集到的有酶活性的組分，用2 L前述Tris-HCl緩沖液8-10℃過夜透析，然后再次上SP柱，用200 mL 0.09 mol/L NaCl（溶于同樣緩沖液）平衡，再用500 mL 0.105 mol/L NaCl等度洗脫，收集有酶活性組分的洗脫液。

將再次過SP柱后收集到的有酶活性的組分，用等體積的前述Tris-HCl緩沖液混合稀釋，再上CS柱。用200 mL 0.1 mol/L NaCl（溶于同樣緩沖液）平衡，再用同樣緩沖液中0.1-1 mol/L NaCl（各100 mL）梯度洗脫，收集洗脫液中有活性的組分，得到純的肝素酶，定名SShepI。

將前述SP柱上樣流出液有酶活性的組分上樣于Q Sepharose Fast Flow層析柱，用200 mL 前述Tris-HCl緩沖液平衡，再用同樣緩沖液中0-0.5 mol/L NaCl（各100 mL）梯度洗脫，收集有酶活性組分。

將Q柱后收集到的有酶活性組分，用2 L前述Tris-HCl緩沖液8-10℃過夜透析，然后過CS柱。用200 mL的0.1 mol/L NaCl（溶于同樣緩沖液）平衡，然后用同樣緩沖液中0.1-0.6 mol/L NaCl（各100 mL）梯度洗脫，收集洗脫液中有活性的組分，得到純的肝素酶，定名SShepII。

1.2.4 肝素酶理化性質考察

1.2.4.1 肝素酶最適pH 將肝素底物溶于25 mmol/L Tris-HCl（含10 mmol/L CaCl2）緩沖液中，配制成濃度為1 mg/mL的肝素溶液，分別調至pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0。

1.2.4.2 肝素酶最適溫度 將1 mg/mL的肝素溶液置于恒溫水浴鍋中，分別將溫度依次調至25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃、45℃和47℃，在各條件下分別測定肝素酶的活性。

1.2.4.3 金屬離子種類對肝素酶活性的影響 在肝素底物中分別加入10 mmol/L的CaCl2、NaCl、KCl、MgCl2、CuCl2，以考察金屬離子對肝素酶活性的影響。

1.2.4.4 金屬離子濃度對肝素酶活性的影響 將對酶活有促進作用的幾種金屬離子分別設置為0、1 mmol/L、10 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、500 mmol/L和1 mol/L，測定酶在各種條件下的酶活，考察金屬離子濃度對肝素酶活性的影響。

1.2.5 肝素酶酶切位點分析 分別用足量肝素黃桿菌肝素酶I、II、III和兩種新型肝素酶酶解肝素樣品（50 mg/500 μL/3.0 IU），之后經P10層析柱分離得到二糖組分，對二糖的組分進行分析。

1.2.6 檢測方法 蛋白濃度測定：Folin-酚試劑法（Lowry法）［12］，以牛血清白蛋白作標準。酶活力的測定：采用Ma等［5］的方法。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳參照文獻［13］。低分子肝素分子量分布測定參照文獻［14］。低分子肝素效價測定參照文獻［15］。

2 結果

2.1 菌種的篩選

經多輪篩選后，得到1株經驗證產肝素酶的細菌，編號為CDF1-2，為白色不透明菌落，發酵后產肝素酶量大約為80 IU/L。經廣東省微生物分析檢測中心鑒定，為革蘭氏陰性、短桿菌，通過16S rDNA與已知菌株進行基因序列比對，確定該菌種屬食神鞘氨醇桿菌（Sphingo. spiritivorum）。經檢索目前該菌種的相關報道較少，無產肝素酶的報道。

2.2 肝素酶的制備和純化

按照1.2.3中的各純化步驟實施后，所得酶活、蛋白含量、（比活）純化倍數、（總活力）產率分別見表1、表2所示。純化后得到了比較純的酶蛋白，經SDS-PAGE測定，SShepI和SShepII分子量分別約為71 kD和92 kD（圖1）。

2.3 肝素酶理化性質分析

2.3.1 肝素酶最適pH 如圖2所示，兩種肝素酶以HEP為底物時，兩種肝素酶SShepI和SShepII在pH為8.5時酶活達到最高值。

2.3.2 肝素酶最適溫度 如圖3所示，兩種酶以HEP為底物時，在溫度較低的情況下，酶活比較低，隨著溫度上升，肝素酶的活性呈現增高的趨勢，溫度過高兩個酶的活性迅速下降。肝素酶SShepI和SShepII的最適溫度分別為48℃和46℃。

表1 SShepI肝素酶純化表

表2 SShepII肝素酶純化表

圖1 肝素酶SShepI（泳道3）和SShepII（泳道2）SDSPAGE電泳圖

圖2 肝素酶SShepI和SShepII的最適pH

2.3.3 離子種類對肝素酶活性的影響 分別考察了CaCl2、NaCl、KCl、MgCl2和CuCl2等金屬離子對SShepI和SShepII兩種肝素酶HEP活性的影響，由圖4可知，在空白對照組，上述各酶的活性均較低，而在添加金屬離子的情況下，K+、Mg2+、Na+和Ca2+均顯示了促進酶活的作用，其中Ca2+的促進作用最強，酶活大幅度提高，其次是Mg2+也具有明顯的促進作用，而Cu2+具有抑制酶活的作用，使酶失活。2.3.4 離子濃度對肝素酶活性的影響 鑒于Ca2+、Mg2+對兩種肝素酶均有明顯的促進作用，進一步考察這兩種離子的濃度對肝素酶活性的影響。由圖5可知，不添加Mg2+的情況下，兩種酶的活性均較低，而隨著Mg2+濃度的升高，兩種酶均出現酶活增大的趨勢，SShepI和SShepII在100 mmol/L的Mg2+濃度下活性達到最高，而當Mg2+濃度過高時（大于500 mmol/L），酶的活性又降低甚至失活。說明在一定范圍的Mg2+濃度下，Mg2+對肝素酶的催化具有促進或者激活作用，使得酶的活性大幅度提高。

圖3 肝素酶SShepI和SShepII的最適溫度

圖4 不同離子種類對肝素酶SShepI和SShepII活性的影響

圖5 Mg2+濃度對肝素酶SShepI 和SShepII活性的影響

圖6 Ca2+濃度對肝素酶SShepI和SShepII活性的影響

由圖6可知，從10 mmol/L的Ca2+開始，SShepI和SShepII的酶活呈現出明顯的提高，兩種酶均在100 mmol/L的Ca2+濃度下酶活達到最大，而當Ca2+濃度過高時（大于500 mmol/L），酶的活性又迅速降低，甚至失活。

2.4 肝素酶酶切位點分析

由表3可知，新型肝素酶SShepI酶解肝素得到的二糖組分中，IVA、IVS、IIA和IIS的含量顯著高于構成肝素二糖中原始相應二糖的百分含量，IIIS、IS的含量顯著低于構成肝素二糖中原始相應二糖的百分含量；這說明新型肝素酶SShepI對含IVA、IVS、IIA和IIS糖鏈的酶切能力較強，對含IIIS、IS的糖鏈不酶切。與已知的3種肝素黃桿菌肝素酶的酶解二糖組分比較發現，新型肝素酶SShepI與肝素黃桿菌肝素酶III酶切情況相似，由此可推出，肝素酶SShepI的酶切位點可能為：→4）-α-D- GlcNp2S（or2-Ac）6S（or 6-OH）（1→4）-α-LIdoAp，→4）-α-D-GlcNp2S（or2-Ac）6S（or 6-OH）（1→4）-β-D-GlcAp。新型肝素酶SShepII酶解肝素得到的二糖組分中，IIIS、IS的含量顯著高于構成肝素二糖中原始相應二糖的百分含量，IVA、IVS、IIA和IIS的含量顯著低于構成肝素二糖中原始相應二糖的百分含量；這說明新型肝素酶SShepII對含IIIS、IS的糖鏈酶切能力較強，對含IIS的糖鏈酶切能力較弱，對含IVA、IVS、IIA的糖鏈不酶切。與已知的3種肝素黃桿菌肝素酶的酶解二糖組分比較發現，SShepII與肝素黃桿菌肝素酶I酶切情況相似，由此可推出，SShepII的酶切位點可能為：→4）-α-D-GlcNp2S6S（or 6-OH）（1→4）-α-LIdoAp2S，→4）-α-D-GlcNp2S6S（1→4）-α-L-IdoAp，→4）-α-D-GlcNp2S6S（1→4）-β-D-GlcAp。

2.5 兩種新型肝素酶與已知肝素酶的性質比較

由表4可以看出，SShepI肝素酶的分子量為71 kD，文獻報道的肝素酶分子量大多與之相差較大，較接近的有Heparin lyase III、Heparinase in Ref. 17和Heparinase in Ref. 19，但SShepI對肝素和HS的底物特異性與后三者差別明顯，因此可認為SShepI與這3種酶不同。SShepII肝素酶的分子量為92 kD，與之接近的有Heparin lyase II和Heparinase in Ref. 22，但SShepII對肝素和HS的底物特異性與Heparinase in Ref. 22相差極大，與Heparin lyase II也有較大差別。從酶切位點看不具有可比性。因此認為SShepII與已發現的肝素酶均不同。

表3 肝素酶SShepI和SShepII酶解肝素二糖組分分析

綜上，SShepI和SShepII兩種酶的來源、分子量、對肝素和HS降解的特異性以及酶切位點與文獻中已報道的肝素酶均有不同。因此，新型肝素酶SShepI和SShepII為兩種前未報道過的肝素酶。

2.6 肝素酶降解肝素試驗

2.6.1 SShepI和SShepII酶解肝素 酶解過程：將1 g肝素用20 mL 50 mmol/L Tris-HCl（含10 mmol/L CaCl2，pH7.4）緩沖液溶解后加入4 IU純化后的SShepI或SShepII酶，45℃水浴酶解48 h，水浴100℃煮沸使酶滅活后離心得上清，上清加入氯化鈉至終濃度為2.5%，加入1.4倍乙醇（W/W），8-10℃靜置24 h后離心，烘干沉淀。分別得到產物0.71 g（SShepI酶解）和0.45 g（SShepII酶解）。

2.6.2 酶解肝素產物分析 分析了酶解產物的分子量分布、抗FXa效價和抗FIIa效價。從分子量分布（圖7）可以看出，兩種酶降解肝素均可得到低分子肝素，其中前者的分子量主要分布在2-8 kD，后者分布在0.6-4 kD。經測定效價，SShepI酶解肝素產物抗FXa效價為126 IU/mg，抗FIIa效價為29 IU/ mg；SShepII酶解肝素產物抗FXa效價為135 IU/mg，抗FIIa效價為8 IU/mg。

表4 肝素酶SShepI和SShepII與已知肝素酶的性質比較表

圖7 新型肝素酶降解肝素分子量分布圖

3 討論

隨著對低分子肝素的研究不斷深入，人們發現，低分子肝素除了具有抗凝活性外，還對腫瘤、炎癥、產科妊娠等疾病具有廣泛作用［25-27］，針對低分子肝素存在多種的藥理活性進行新藥開發具有廣闊的前景。但肝素的結構高度復雜，其糖鏈上相對于某種藥理作用的活性位點在整個混合物中較少，而且容易受其他近似結構干擾，由此對藥物開發帶來干擾。而肝素酶對肝素的酶切位點比較專一，由此可得到較大量結構相同的片段，有利于藥物開發。因此，尋找裂解位點獨特的新型肝素酶，具有重要意義。

本研究從土壤中培養分離純化得到一株食神鞘氨醇桿菌（Sphingo. spiritivorum），發酵后得到粗酶，經多步柱層析純化后得到新型肝素酶SShepI和SShepII。之后，我們對兩種新型肝素酶的理化性質包括最適pH、最適溫度、緩沖液離子種類、離子濃度等進行考察，并通過酶解酶解肝素樣品，分析二糖組分對兩種新型肝素酶的酶切位點進行初步研究。通過相關數據庫的檢索，未發現利用食神鞘氨醇桿菌生產肝素酶的相關報道和專利，目前，研究人員主要利用食神鞘氨醇桿菌生產酒精脫氫酶，與解淀粉芽孢桿菌、腸系膜明串珠菌混合使用用于處理難降解廢水，與熒光假單胞菌形成組合菌處理種子以保護植物免收病原體感染等。另外，通過與文獻中已經報道的肝素酶在來源、分子量、對肝素和HS降解的特異性以及酶切位點等方面進行比較后發現，SShepI和SShepII與其他肝素酶不同。證實了肝素酶SShepI和SShepII為兩種前未報道過的新型肝素酶。

最后，用得到的新肝素酶試制低分子肝素，顯示SShepI酶解產物的分子量分布在2-8 kD，抗FXa效價126 IU/mg，抗FIIa效價29 IU/mg；SShepII酶解產物的分子量分布在0.6-4 kD，抗FXa效價為135 IU/mg，抗FIIa效價為8 IU/mg。這兩種新型酶制低分子肝素與目前已有的藥品低分子肝素如依諾肝素、達肝素、亭扎肝素等性能都有所區別，有望開發成抗凝血效果更好，或具有新臨床功能的低分子肝素藥物。此外，在后續的研究工作中，我們還需對兩種新型肝素酶酶切位點進行深入研究，分析其酶切肝素產物的結構特點，明確其酶切位點。

4 結論

本研究采用定向富集方法從土壤中篩選分離得到產肝素酶的新種菌株CDF1-2，屬食神鞘氨醇桿菌（Sphingo spiritivorum）。之后利用微生物發酵和蛋白純化技術制備得到新型肝素酶SShepI和SShepII，并對其理化性質和酶切位點進行了初步研究，最后，用得到的兩種新型肝素酶降解肝素得到兩種新型酶制低分子肝素。

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（責任編輯 狄艷紅）

Preparation and Characterization of Novel Heparinase from Sphingo spiritivorum

YIN Si-yuan BAI Jia-ke LI Li MA Xiao-lai
（Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Co.，Ltd，Shenzhen 518057）

This work aims to screen new type of strain producing novel heparinase，and to prepare novel heparinase and test its ability of degrading heparin. The bacteria in soil were cultured using the directional enrichment method，and strains producing heparinase were isolated. Microbial fermentation and purification technology were adopted to prepare novel heparinase，and to study the physical and chemical properties and the cleavage site of novel heparinase. Then，the heparinase were applied to degrade heparin，and the obtained low molecular weight heparins（LMWHs）were characterized. A new heparinase-producing strain belonging to the genus of Sphingo spiritivorum was isolated. The crude enzyme after fermentation was purified with multi-step column chromatography and novel heparinase SShepI and SShepII were obtained，with which two kinds of novel low molecular weight heparins were generated by the degradation of heparin. Conclusively，novel heparinase SShepI and SShepII isolated and purified from a strain of S. spiritivorum are adopted to degrade heparin for preparing low molecular weight heparins，which are expected to be developed into LMWH drugs with better anticoagulant effect or new clinical function.

Sphingo spiritivorum；heparinase；preparation；characterization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1162

2016-12-23

深圳市科技計劃項目（CXZZ20150330141732458）

尹思遠，男，博士，研究方向：臨床前藥理藥效；E-mail：siyuan.yin@hepalink.com

馬小來，男，博士，研究方向：酶工程；E-mail：maxl@hepalink.com