環(huán)境因素對(duì)哈密瓜細(xì)菌性果斑病病菌生物膜形成的影響

趙亞男+王曉東

摘要：為研究哈密瓜細(xì)菌性果斑病病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli，簡(jiǎn)稱Aac）在不同培養(yǎng)條件下形成生物膜的能力，選用微孔板體外培養(yǎng)、結(jié)晶紫染色、分光光度測(cè)定法檢測(cè)哈密瓜細(xì)菌性果斑病病菌在不同載體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、葡萄糖濃度、初始pH值條件下生物膜的形成能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在11種供試載體中，Aac在聚苯乙烯表面易形成穩(wěn)定、明顯的生物膜；在供試的6種培養(yǎng)基中，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB）形成生物膜能力最強(qiáng)；以LB為培養(yǎng)基、聚苯乙烯孔板為載體、初始pH值為7、培養(yǎng)溫度28 ℃、培養(yǎng)24 h、葡萄糖濃度為30.0 mmol/L時(shí)，Aac形成生物膜能力最強(qiáng)。結(jié)果表明，不同載體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、葡萄糖濃度、初始培養(yǎng)pH值均對(duì)Aac生物膜形成能力有明顯影響。研究結(jié)果能為有效阻止Aac生物膜形成、有效防治哈密瓜細(xì)菌性果斑病病菌提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：哈密瓜細(xì)菌性果斑病病菌；生物膜形成能力；培養(yǎng)條件

中圖分類號(hào)： S436.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）12-0073-04

瓜類細(xì)菌性果斑病由燕麥種西瓜亞種（Acidovora avenae subsp. citrulli，簡(jiǎn)稱Aac）引起，是一種嚴(yán)重的檢疫性病害[1]。它具有發(fā)病快、危害重、防治難等特點(diǎn)，給哈密瓜的安全生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅，目前尚未發(fā)現(xiàn)免疫的哈密瓜品種[2-3]。在生產(chǎn)中長(zhǎng)期和大量使用銅制劑、抗生素會(huì)導(dǎo)致環(huán)境安全、病原菌耐藥性問題的產(chǎn)生[4]。在自然或人工條件下，許多細(xì)菌主要以生物膜形式存在[5]。植物生境相關(guān)細(xì)菌生物膜的形成不僅對(duì)植物健康造成嚴(yán)重影響，同時(shí)也是植物-病原物互作中具有毒性作用的致病因子[6]。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在紫花羅勒根部形成生物膜而引起病害，使受感染植物7 d內(nèi)死亡，根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）在寄主根部形成生物膜，有利于其將毒性質(zhì)粒注入寄主體內(nèi)引起根癌病[7]。植物病原細(xì)菌柑橘潰瘍病病菌生物膜在其定殖和病害循環(huán)中起重要作用[8]。細(xì)菌生物膜（biofilm，簡(jiǎn)稱BF）是由細(xì)菌群體感應(yīng)（quorum sensing，簡(jiǎn)稱QS）調(diào)控產(chǎn)生的生理效應(yīng)（如生物膜、分泌毒性因子、群集運(yùn)動(dòng)等）之一，是通過胞外基質(zhì)（蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等）聚集附著于生物或非生物表面形成的具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的群落[9-10]。處在成熟生物膜中的細(xì)菌對(duì)抗生素的耐受性是浮游細(xì)菌的100～1 000倍，細(xì)菌形成生物膜后，可通過限制藥物滲透使藥物在生物膜內(nèi)無法達(dá)到有效抑菌濃度或影響生物膜內(nèi)pH值而影響藥物的解離度等機(jī)制，從而降低抗生素的抑菌效能，明顯增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性[11-13]。因此，抑制或影響細(xì)菌生物膜的形成，降低細(xì)菌的耐藥性，減少細(xì)菌分泌毒性因子，提升抗生素的抑菌效能，將大大提高細(xì)菌病害防治效果，同時(shí)也可緩解因?yàn)E用抗生素等農(nóng)藥引起的環(huán)境安全問題。本試驗(yàn)通過測(cè)定哈密瓜細(xì)菌性果斑病病菌在體外不同培養(yǎng)條件下形成生物膜的能力，以期了解哈密瓜細(xì)菌性果斑病病菌生物膜形成的干擾因素，為有效防治哈密瓜細(xì)菌性果斑病提供新思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB）、酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基（YPD）、金氏培養(yǎng)液（KB）、M210培養(yǎng)基。

1.1.2供試菌株供試菌株瓜類細(xì)菌性果斑病病菌菌株XJ05-1（Aac）由石河子大學(xué)植物保護(hù)系王曉東提供。Aac接種于KB培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)36 h后備用。

1.1.3主要儀器及試劑Multiskan酶標(biāo)儀（FC）、FE20 pH計(jì)、UV-1800紫外可見分光光度計(jì)、DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱、96孔板、12孔板、葡萄糖（分析純）。

1.2方法

1.2.1Aac菌懸液的制備挑取少量Aac劃線于KB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)36 h后，用無菌水清洗培養(yǎng)物，制備3×108 CFU/mL（D600 nm=1.0）Aac菌懸液。

1.2.2Aac成膜的檢測(cè)對(duì)生物膜的測(cè)定參照文獻(xiàn)[14-15]描述的方法并略有改動(dòng)。將濃度為3×108 CFU/mL（D600 nm=10）的Aac菌懸液35 μL接種于裝有100 μL培養(yǎng)基的96孔板中，每個(gè)測(cè)試樣品6次重復(fù)。28 ℃靜置培養(yǎng) 24 h 后用超純水潤(rùn)洗孔板3次，加入200 μL 0.4%結(jié)晶紫染色30 min，去掉染液，潤(rùn)洗直至流出液澄清，最后用200 μL純乙醇溶解，振蕩，測(cè)定D570 nm。

1.2.3Aac在不同培養(yǎng)條件下生物膜形成的測(cè)定試驗(yàn)載體：取700 μL濃度為3×108 CFU/mL菌液加入含有2 mL KB培養(yǎng)液的12孔板中，分別將無菌處理后表面光滑的不銹鋼片（網(wǎng)狀不銹鋼片）、表面粗糙的不銹鋼片、玻璃片、聚苯乙烯片、鋁片、鐵片、銅片、木條、錫紙、乳膠片、陶瓷片斜插入12孔板中，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測(cè)試生物膜形成能力。

培養(yǎng)基：向96孔聚苯乙烯微量孔板中分別加入100 μL TSB、KB、YPD、M210、NB、LB培養(yǎng)基，再加入35 μL濃度為 3×108 CFU/mL菌液。28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測(cè)試生物膜形成能力。

培養(yǎng)時(shí)間：向裝有100 μL LB培養(yǎng)基的96孔聚苯乙烯微量孔板中加入35 μL濃度為3×108 CFU/mL菌懸液。在 28 ℃ 條件下靜置培養(yǎng)6、8、10、12、24、36、48、60 h后，測(cè)試生物膜的形成能力。培養(yǎng)溫度：向裝有100 μL LB培養(yǎng)基的96孔聚苯乙烯微量孔板中加入35 μL濃度為3×108 CFU/mL菌懸液。分別在18、23、28、33 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，測(cè)試生物膜的形成能力。endprint

葡萄糖濃度：取35 μL濃度為3×108 CFU/mL菌液加入到含有100 μL不同濃度葡萄糖（0.0、5.6、7.0、11.1、16.7、200、30.0 mmol/L）LB培養(yǎng)基的96孔聚苯乙烯微量孔板中，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測(cè)試生物膜的形成能力。

初始pH值：取35 μL濃度為3×108 CFU/mL菌液加入含有100 μL pH值分別為9、8、7、6、5、4、3、2的LB培養(yǎng)基中，在96孔聚苯乙烯微量孔板中28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測(cè)試生物膜的形成能力。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SAS 8.0軟件中的方差分析程序（ANOVA）分析上述各試驗(yàn)處理間的差異顯著性。比較各處理間的差異采用Duncans新復(fù)極差法。

2結(jié)果與分析

2.1不同附著材質(zhì)對(duì)Aac形成生物膜的影響

由圖1可見，Aac在表面光滑的不銹鋼片（E）、表面粗糙的不銹鋼片（G）、玻璃片（K）、聚苯乙烯片（C）、鋁片（D）、鐵片（A）、銅片（H）、錫紙（B）、陶瓷片（J）表面可以形成生物膜，在乳膠片（F）、木條（I）上無法形成生物膜，在聚苯乙烯片上形成的生物膜明顯、厚、穩(wěn)定。

2.2培養(yǎng)基對(duì)Aac形成生物膜的影響

由圖2可得，Aac在6種培養(yǎng)基中均可形成生物膜，其中Aac在LB培養(yǎng)基中形成生物膜能力最強(qiáng)，D570 nm最高，顯著高于除YPD培養(yǎng)基外的其他試驗(yàn)組，在NB培養(yǎng)基中形成生物膜的能力最弱。

2.3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Aac形成生物膜的影響

由圖3可得，Aac生物膜在形成初期，D570 nm隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸提高，在24 h時(shí)D570 nm達(dá)到最高值，這時(shí)生物膜形成能力最強(qiáng)，而后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，D570 nm逐漸下降，生物膜的形成能力逐漸減弱。

2.4培養(yǎng)溫度對(duì)Aac生物膜形成的影響

由圖4可得，Aac在18、23、28、33 ℃條件下均可形成生物膜，形成生物膜能力隨著溫度的升高而增強(qiáng)，在28 ℃時(shí)，D570 nm達(dá)到最大值，隨后溫度升高，D570 nm下降，即生物膜形成能力減弱。

2.5初始pH值對(duì)Aac生物膜形成的影響

由圖5可得，Aac在初始pH值為5、4、3、2時(shí)幾乎無法形成生物膜，D570 nm接近0；當(dāng)初始pH值為7時(shí)，檢測(cè)的D570 nm最高，生物膜形成能力最強(qiáng)；在初始pH值為8～9時(shí)，D570 nm逐漸降低，生物膜形成能力減弱。

2.6葡萄糖濃度對(duì)Aac形成生物膜的影響

由圖6可得，Aac在葡萄糖濃度為0時(shí)形成生物膜的能力最弱，隨著葡萄糖濃度的增加，形成生物膜的能力逐漸增強(qiáng)，在葡萄糖濃度為30.0 mmol/L時(shí)，D570 nm最大，形成生物膜能力最強(qiáng)。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究了環(huán)境因素對(duì)哈密瓜細(xì)菌性果斑病病菌生物膜形成能力的影響發(fā)現(xiàn)，成膜載體、培養(yǎng)基、時(shí)間、溫度、葡萄糖濃度、初始pH值對(duì)其成膜能力均有影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在11種供試載體中，Aac在聚苯乙烯片上易形成明顯、穩(wěn)定的生物膜；6種供試培養(yǎng)基中，Aac在LB培養(yǎng)基中形成生物膜的能力最強(qiáng)，D570 nm=2.05；以LB為培養(yǎng)基、聚苯乙烯孔板為培養(yǎng)載體，初始培養(yǎng)pH值為7、葡糖糖濃度為 30.0 mmol/L、培養(yǎng)24 h時(shí)成膜能力達(dá)到最強(qiáng)，所檢測(cè)的D570 nm分別為134、1.98、1.30。

不同溫度下，Aac形成生物膜的能力是不同的。18～28 ℃ 時(shí)，D570 nm隨溫度升高逐漸提高，Aac生物膜形成能力逐漸增強(qiáng)。彭曉云等在不同培養(yǎng)條件下對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜生長(zhǎng)影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，溫度與生物膜呈依賴關(guān)系，隨著溫度的升高，BF表面積增大[16]。但本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Aac培養(yǎng)溫度達(dá)到 33 ℃ 時(shí)，D570 nm減小，反而抑制了成膜能力。溫度過高，可能使細(xì)胞組分（蛋白質(zhì)、核酸等）產(chǎn)生不可逆的失活，喪失細(xì)胞功能，對(duì)生物膜的形成有一定的影響[17]。

國(guó)外學(xué)者Sutherland發(fā)現(xiàn)，只要存在能合成胞外多糖的微生物菌屬，就能形成成熟、穩(wěn)定的生物膜[18]。并且研究表明，菌體黏附后生成的水不溶性多糖也有利于促進(jìn)菌體間的聚集和維持生物膜的三維結(jié)構(gòu)[19]。本試驗(yàn)在檢測(cè)不同葡萄糖濃度對(duì)哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌生物膜形成的影響中發(fā)現(xiàn)，在不含有葡萄糖的培養(yǎng)基中，Aac形成生物膜的能力最低；隨著葡萄糖濃度的增加，Aac形成生物膜的能力逐漸增強(qiáng)。葡萄糖濃度的增加促進(jìn)了菌體間的相互黏附、聚集，增強(qiáng)了成膜能力。同時(shí)，楊虹等發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖對(duì)鮑氏不動(dòng)桿菌生物膜的形成能力、厚度有很強(qiáng)的促進(jìn)作用[20]。

在進(jìn)行不同初始pH值對(duì)Aac生物膜形成的影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Aac在初始pH值低于6的環(huán)境里靜置培養(yǎng)，成膜能力幾乎喪失。初始pH值為7時(shí)，形成生物膜的能力最強(qiáng)，初始pH值為8～9時(shí)，Aac具有成膜能力，但逐漸減弱。劉文竹等研究發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌在pH值低于6的環(huán)境里，幾乎無法形成生物膜，成膜能力受到明顯抑制[21]。同時(shí)姜穎等研究也說明，低pH值條件下，培養(yǎng)的變形鏈球菌黏附力較弱，影響生物膜的形成[22]。細(xì)菌的群體感應(yīng)是細(xì)菌通過分泌可溶性信號(hào)分子來檢測(cè)群體密度并協(xié)調(diào)細(xì)菌生物功能的信息交流機(jī)制，為功能性生物膜的形成提供了保證。革蘭氏陰性菌的QS系統(tǒng)主要由信號(hào)分子N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactones，簡(jiǎn)稱AHLs）、AHLs合成酶LuxⅠ族蛋白、AHLs受體LuxR族蛋白組成[23]。作為QS系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子，AHLs可以調(diào)控細(xì)菌的生物膜形成、群游現(xiàn)象、抗生素的合成等多種生理生化功能[24]。關(guān)于偏酸性的環(huán)境是否對(duì)Aac的群體感應(yīng)系統(tǒng)存在影響，這將是后續(xù)試驗(yàn)的重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]趙廷昌，孫福在，王兵萬，等. 哈密瓜細(xì)菌性果斑病病原菌鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2001，31（4）：357-364.endprint

[2]林德佩. 瓜類作物細(xì)菌性果實(shí)腐斑病（BFB）防治研究概述[J]. 中國(guó)瓜菜，2005 （4）：35-37.

[3]李威，任毓忠，丁建軍，等. 新疆瓜類細(xì)菌性果斑病品種抗病性鑒定[J]. 北方園藝，2007，2007（3）：186-188.

[4]王曉東. 防治哈密瓜細(xì)菌性果斑病拮抗酵母菌的篩選及其生防機(jī)理研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[5]Web J S，Givskov M，Kjelleberg S. Bacterial biofilms：prokaryotic adventures in multicellularity[J]. Curr Opin Microbiol，2003，6（6）：578-585.

[6]Yang L，Aagensen J A，Jelsbak L，et al. In situ growth rates and biofilm development of Pseudomonas ageruginosa population in chronic lung infections[J]. J Bacteriol，2008，190（8）：2767-2776.

[7]陳云. 枯草芽孢桿菌生物膜在青枯病生防中的功能研究及 Cyclic-di-GMP信號(hào)通路初探[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[8]Rigano L A，Siciliano F，Enrique R，et al. Biofilm formation，epiphytic fitness，and canker development in Xanthomonas axonopodis pv. citri[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2007，20（10）：1222-1230.

[9]劉國(guó)勇，王泳珊，程超，等. 細(xì)菌生物膜抑制劑 3，4-二氯呋喃-2 （5H）-酮聯(lián)合慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用[J]. 中國(guó)新藥雜志，2010（4）：327-331.

[10]Vu B，Chen M，Crawford R J，et al. Bacterial extracellular polysaccharides involved in biofilm formation[J]. Molecules，2009，14（7）：2535-2554.

[11]Potera C. Forging a link between biofilms and disease[J]. Science，1999，283（5409）：1837-1839.

[12]Costerton J W，Stewart P S，Greenbery E P. Bacterial biofilms：a common cause of persistent infections[J]. Science，1999，284（5418）：1318-1322.

[13]Olson M E，Ceri H，Morck D W，et al. Biofilm bacteria：formation and comparative susceptibility to antibiotics[J]. Canadian Journal of Veterinary Research，2002，66（2）：86-92.

[14]Christensen G D，Simpson W A，Younger J J，et al. Adherence of coagulase-negative Staphylococci to plastic tissue culture plates：a quantitative model for the adherence of Staphylococci to medical device[J]. J Clin Microbiol，1985，22（6）：996-1006.

[15]Li X Z，Hauer B，Rosche B. Single species microbial-biofilm screening for industrial applications[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2007，76（6）：1255-1262.

[16]彭曉云，黃曉敏，鄭秋樺，等. 不同培養(yǎng)條件對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜生長(zhǎng)影響實(shí)驗(yàn)研究[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志，2009，38（7）：780-782.

[17]陳建貞. 溫度、CO2濃度變化對(duì)自然生物膜的影響[D]. 南京：南京林業(yè)大學(xué)，2013.

[18]Sutherland I W. The biofilm matrixan immobilized but dynamic microbial environment[J]. Trends in Microbiology，2001，9（5）：222-227.

[19]Burgemeister S，Decker E M，Weiger R，et al. Bacteria cidal effect of delmopinol on attached and planktonic Streptococcus sanguinis cells[J]. European Journal of Oral Sciences，2001，109（6）：425-427.

[20]楊虹，藥飛，李曉霞，等. 不同濃度葡萄糖對(duì)多藥耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌生物膜形成能力的影響[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，26（3）：498-501.

[21]劉文竹，李紅月，范學(xué)亭，等. 環(huán)境因素對(duì)溶藻弧菌HN08155生物膜形成的影響[J]. 海南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，33（4）：365-371.

[22]姜穎，張鐵柱，楊錦波，等. 酸性環(huán)境對(duì)變形鏈球菌黏附力的影響[J]. 廣東牙病防治，2008，16（9）：398-399.

[23]陳靜，劉顯軍，邊連全，等. 細(xì)菌生物膜及細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（5）：32-33.

[24]Ansaldi M，Marolt D，Stebe T，et al. Specific activation of the Bacillus quorum-sensing systems by isoprenylated pheromone variants[J]. Molecular Microbiology，2002，44（6）：1561-1573.endprint