解淀粉芽孢桿菌B1619對設施蔬菜根結線蟲病的防治效果

蔣盼盼+陳志誼+甘穎+劉永鋒+陸凡

摘要：通過設施大棚藥效試驗，探究解淀粉芽孢桿菌B1619對設施蔬菜根結線蟲病的防治效果；通過室內毒力試驗，測定解淀粉芽孢桿菌B1619對蔬菜根結線蟲的毒殺效果。設施大棚藥效試驗結果表明，一般情況下，溝施的田間防效高于穴施；當施用菌粉量較少時，穴施田間防效高于溝施；設施番茄、黃瓜溝施解淀粉芽孢桿菌B1619量為 16 g/株時，其防效分別為69.12%、87.77%。室內毒力測定試驗結果表明，40%甲基異柳磷乳油對2齡線蟲的EC50（24 h）為85.252 1 mg/L，EC50（48 h）為77.704 7 mg/L；解淀粉芽孢桿菌B1619發酵液對2齡線蟲的EC50（24 h）為12.056 0 CFU/mL，EC50（48 h）為12.906 6 CFU/mL；解淀粉芽孢桿菌B1619粗提物對2齡線蟲的EC50（24h） 為稀釋 9.324 6倍，EC50（48 h）為稀釋9.960 4倍。室內外試驗結果均表明，解淀粉芽孢桿菌B1619對設施蔬菜根結線蟲病有明顯的防治效果。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌B1619；設施蔬菜；根結線蟲；毒力測定；防治效果

中圖分類號： S432.4+5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0081-04

近年來，設施蔬菜發展迅速，特別是番茄、辣椒、黃瓜，已成為高效農業發展的新產業。然而，因設施大棚的密閉性和單一作物連作引起的茄果類蔬菜土傳病害（根結線蟲病）頻繁暴發，嚴重制約著該產業的可持續發展[1-2]。2011年宋志強對江蘇省9個地區進行調查發現，根結線蟲平均發生率為73.6%[3]。據河南、山東、云南等地區報道，因該病危害，溫室大棚一般減產20%～30%，重者可達60%～70%，甚至絕收[4]。利用生防菌防治設施蔬菜土傳病害的研究備受關注，這些微生物通過分泌抗菌物質、營養競爭、誘導植株產生抗病性等方式，調節根圍微生態結構、抑制病害發生、促進植物生長，在防治植物病害中發揮著重要作用[5-7]。江蘇省農業科學院植物保護研究所自2006年起，開展生物防治設施蔬菜土傳病害研究，針對番茄枯萎病菌、青枯病菌進行拮抗微生物的篩選，從2萬多個菌株中分離出具有較強拮抗能力的生防菌——解淀粉芽孢桿菌B1619[8]。該菌株可以誘導植物產生抗病性，并對番茄有促生作用，能有效控制設施蕃茄枯萎病、青枯病、根腐病、立枯病等重要土傳病害引起的連作障礙[9-11]。在推廣應用中發現，生防菌B1619能夠有效地防治設施蔬菜根結線蟲病。

本研究通過室內毒力測定、日光大棚試驗，明確生防菌B1619對根結線蟲的抑制作用，對設施蔬菜（番茄、黃瓜）根結線蟲病的防治效果，為今后大面積推廣應用B1619防控設施蔬菜根結線蟲病提供科學依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試蔬菜品種番茄品種為天妃七號，購自沈陽谷雨種業有限公司；黃瓜品種為德瑞特201，購自天津德瑞特種業有限公司。

1.1.2供試菌株解淀粉芽孢桿菌B1619，由江蘇省農業科學院植物保護研究所生物防治研究室提供。

1.1.3培養基液體培養基為YPG（胰蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，酵母膏5.0 g，水1.0 L，pH值為7.0）；固體培養基為YPGA（在YPG培養基中加入20 g瓊脂）。

1.1.4供試藥劑40%甲基異柳磷乳油（青島雙飛農化生物科技有限公司）。

1.1.5供試生物殺菌劑1.2億活芽孢/mL解淀粉芽孢桿菌B1619水分散粒劑（江蘇省蘇科農化有限責任公司）。

1.2試驗方法

1.2.1生防菌B1619發酵液的制備從保存菌株B1619的試管中挑取2環菌種在YPGA斜面上，于28 ℃培養箱中培養24 h活化，即得到新鮮活化的B1619菌株；挑取2環轉接到含有330 mL YPG培養基的三角瓶中，28 ℃、150 r/min培養 48 h，即為B1619發酵液原液。

1.2.2B1619發酵液含菌量的測定采用平板菌落計數法。取上述B1619發酵液進行梯度稀釋，吸取1 mL稀釋菌液涂布于已凝固的YPGA平板上，28 ℃恒溫箱中培養24 h后統計平板上的菌落數，檢測B1619發酵液含菌量為4.8×109 CFU/mL。

1.2.3B1619發酵液粗提物的制備將B1619發酵原液于10 000 r/min、4 ℃冷凍離心15 min，得上清液即粗提物原液。

1.3生防菌B1619防治設施蔬菜根結線蟲病田間試驗

1.3.1B1619防治設施番茄根結線蟲病田間試驗設計田間試驗于2014年8月在江蘇省徐州市銅山區棠張鎮前進村日光大棚中進行。田間小區試驗共有7個處理，處理1：穴施，定植時施用8 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次4 g/株；處理2：穴施，定植時施用4 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次2 g/株；處理3：溝施，定植時施用 8 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次4 g/株；處理4：溝施，定植時施用4 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次2 g/株；處理5為空白對照，不施用生防菌B1619。每個小區種植128株苗，每個處理重復2次，試驗小區隨機排列。

1.3.2B1619防治設施黃瓜根結線蟲病田間試驗設計田間試驗于2015年2月在江蘇省徐州市銅山區棠張鎮前進村日光大棚中進行。田間小區試驗共有4個處理，處理1：溝施，定植時施用8 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次 4 g/株；處理2：溝施，定植時施用4 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次2 g/株；處理3：穴施，定植時施用 8 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次4 g/株；處理4為空白對照，不施用生防菌B1619。每個小區種植352株苗，每個處理重復2次，試驗小區隨機排列。endprint

1.3.3田間管理穴盤法育苗，苗齡30 d時移栽定植，定植時施用菌粉后立即澆足活棵水，定植后進行常規田間管理，按照各個處理的方法施撒1.2億活芽孢/mL解淀粉芽孢桿菌B1619水分散粒劑，然后立即灌溉。

1.3.4田間試驗調查番茄、黃瓜均在收獲后拔秧時，調查每個小區各處理植株根部的發病情況，參考Barker等分級方法[12-13]，計算病情指數及防效。

1.3.5田間試驗結果統計方法病情指數=（各級發病數×各級代表值）/（調查總葉片數×最高級代表值）×100；

防效=（對照病情指數-處理病情指數）/（對照病情指數）×100%。

1.4生防菌B1619防治設施蔬菜根結線蟲病室內毒力測定

1.4.1根結線蟲的分離試驗所用根結線蟲采自江蘇省徐州市銅山區棠張鎮前進村，經形態學鑒定為南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）。取發病番茄植株根系，用水輕輕沖洗，挑取根部新鮮卵塊，置于貝曼漏斗中孵化，24 h后開始收集2齡幼蟲（J2），每天收集1次，共收集1周，2齡線蟲懸浮液稀釋為100頭/mL，4 ℃保存待用。

1.4.2B1619對根結線蟲室內毒力的測定

1.4.2.1各種濃度菌液和藥劑的制備試驗組為解淀粉芽孢桿菌B1619發酵原液、B1619發酵液粗提物原液與稀釋5、10、15、20、25倍；陽性對照為40%甲基異柳磷乳油，依次配制成10、25、50、100、200 mg/L；以無菌水和YPG培養基處理為空白對照。每個處理重復6次。

1.4.2.2根結線蟲毒力測定方法吸取1 mL分離所得的2齡根結線蟲懸浮液于已滅菌的直徑6 cm的培養皿中，分別加入1 mL不同稀釋倍數的B1619發酵液、粗提物、甲基異柳磷等，放入25 ℃恒溫培養箱中培養，分別于24、48 h后進行觀察計數，采用針觸法判斷并記錄線蟲死亡情況[14]，統計死亡率。

1.5數據分析

利用DPS 7.05軟件對試驗數據進行統計分析。

2結果與分析

2.1生防菌B1619防治設施蔬菜根結線蟲病的田間試驗結果

2014年8月開展的B1619水分散粒劑防治番茄根結線蟲病田間小區試驗結果見表1。其中溝施處理下，定植時施用 8 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次4 g/株，田間防效為6912%，防效高于相同條件下穴施，穴施田間防效為2861%；溝施處理下，定植時施用4 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次2 g/株，田間防效為7.84%，防效低于相同條件下穴施，穴施田間防效為24.79%。

表示差異顯著（P<0.05）。表2同。

2015年2月開展的B1619水分散粒劑防治黃瓜根結線蟲病田間小區試驗結果見表2。其中溝施處理下，定植時施用 8 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次4 g/株防效最高，為8777%；穴施處理下，定植時施用8 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次4 g/株防效次之，防效為7193%；溝施處理下，定植時施用 4 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次2 g/株防效為6402%。本田間試驗結果表明，相同條件下，一般溝施的田間防效高于穴施；當施用菌粉量較少時，穴施田間防效高于溝施。

2.2生防菌B1619防治設施蔬菜根結線蟲病室內毒力測定結果

由表3可以看出毒力回歸方程B1619發酵液濃度與線蟲死亡率的關系，處理24 h時毒力回歸方程為y=-3.253 9x+89.229，r2=0.951 9，EC50=12.056 0倍；處理48 h時，毒力回歸方程為y=-3.382x+93.65，r2=0.950 7，EC50=12.906 6 CFU/mL。隨著B1619發酵液稀釋倍數的增大，根結線蟲的死亡率逐漸降低，根結線蟲死亡率與B1619發酵液稀釋倍數呈負相關關系。另外，隨著B1619發酵液處理時間的增加，根結線蟲的死亡率增高。表3B1619發酵液對2齡線蟲的毒力測定結果

由表4毒力回歸方程可以看出B1619發酵液粗提物濃度與線蟲死亡率的關系，處理24 h時毒力回歸方程為y=-3.007 3x+78.042 0，r2=0.978 1，EC50為稀釋9.324 6倍；處理48 h時，y=-3.105 0x+80.927 0，r2=0.971 7，EC50為稀釋9.960 4倍。隨著B1619發酵液粗提物稀釋倍數的增大，根結線蟲的死亡率逐漸降低，根結線蟲死亡率與B1619發酵粗提物稀釋倍數呈負相關關系；另外，隨著B1619發酵粗提物處理時間的增加，根結線蟲的死亡率增高。表4B1619粗提物對2齡線蟲的毒力測定結果

3結論與討論

目前設施蔬菜根結線蟲病的防治通常采用農業、化學、物理等方法。農業防治中常采用清除病殘體、嫁接栽培、合理輪作等方法；化學防治中常采用有機磷類如甲基異柳磷等化學殺線蟲劑處理土壤，雖然室內毒力測定試驗時線蟲死亡率很高，但許多化學農藥因對非靶標生物具有潛在毒性，在蔬菜中殘留量高，對環境污染嚴重，已被陸續禁用；物理防治主要采用太陽能高溫悶棚的方法。這些措施對設施蔬菜根結線蟲病的防控效果不理想，根結線蟲病在許多蔬菜種植區依然十分嚴重。植物保護專家們力圖通過利用生防菌等微生物及生物農藥代替化學農藥防治線蟲病害[15]，如李頌等研究表明，黑曲霉菌株Snf009發酵液對南方根結線蟲具有較強的活性，它對溫室番茄線蟲的防效達到50%[16]。馬金慧等發現哈茨木霉菌株TRI2對黃瓜根結線蟲有較好的防治作用[17]。唐佳頻等對1 432株海洋和極地來源的細菌進行抗南方根結線蟲的離體篩選試驗，明確惡臭假單胞菌1A00316菌體具有誘導番茄對線蟲的抗性作用[18]。張艷杰等報道玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63 菌株發酵物對設施蔬菜根結線蟲病具有較好的防治效果[19]。本研究從土壤中分離篩選獲得解淀粉芽孢桿菌生防菌株B1619，研發成“1.2億活芽孢/mL解淀粉芽孢桿菌B1619水分散粒劑”，對設施番茄、黃瓜的防效分別可達到69.12%、87.77%。實踐證明，設施條件下，在土壤中大量引進有益微生物（生防菌劑）能夠有效地防治蔬菜根結線蟲病，并且無毒、無致病性、無殘留，對設施蔬菜的生長有一定的促生作用，生態和經濟效益均十分顯著，具有廣闊的應用前景。endprint

芽孢桿菌是一類廣泛存在于土壤、湖泊、海洋、動植物表體的生防菌，多數菌株無致病性、生長速度快、營養需求簡單，在植物的表面易于存活、定殖、繁殖，對多種植物病害尤其是土傳病害有較好的防控效果；同時生產芽孢桿菌制劑的產業化生產工藝簡單，制劑穩定，儲存期長，施用方便，對人畜安全，對環境友好，是一種理想的防控植物病害流行的生防因子[20]。成飛雪等在田間施用對線蟲有毒殺作用的芽孢桿菌 YC-10 菌株，發現它能降低黃瓜根際根結線蟲J2的蟲口密度，減少根結的形成，促進植株生長[21]。余子全等研究表明，堅強芽孢桿菌YBf-10在穩定期能大量合成對線蟲具有毒殺活性的小分子化合物，對根結線蟲表現出極高毒力[22]。Tong等報道蠟樣芽孢桿菌X5有一定的殺線蟲活性[23]。本研究分離篩選獲得的解淀粉芽孢桿菌B1619是1株對設施蔬菜土傳病害多種病原菌（根結線蟲）具有較強拮抗能力的生防菌，能有效控制設施蕃茄枯萎病、青枯病、根腐病、立枯病等重要土傳病害引起的連作障礙，同時該菌株可以誘導植物產生抗病性，并對番茄有促生作用。本試驗獲得的解淀粉芽孢桿菌生防菌株B1619對設施蔬菜根結線蟲有較好的田間防控效果，進一步驗證了芽孢桿菌在植病生防領域中具有較大的研究和應用價值。

目前國內外已報道多種生防菌中含有殺線蟲活性物質，如Huang等發現1株具有殺根結線蟲的根際細菌巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）YMF3.25，該菌產生的揮發性物質對根結線蟲具有很強的抑制作用，經固相微萃取（SPME-GCMS）分析和鑒定表明，其主要的活性揮發物質為苯乙醛（benzeneacetaldehyde）、2-壬酮（2-nonanone）、癸醛（decanal）、2-十一酮（2-undecanone）和二甲基二硫（dimethyl disulphide）[24]。曾慶飛等從白淺灰鏈霉菌的發酵液中分離獲得2個對南方根結線蟲J2具有活性的化合物，其中1個活性組分經結構鑒定為諾卡胺素（nocardamine）[25]。本試驗使用的解淀粉芽孢桿菌B1619發酵液粗提物對2齡根結線蟲有明顯的毒殺作用，用粗提物原液處理后線蟲的死亡率分別為78.85%、82.49%；解淀粉芽孢桿菌B1619發酵液原液處理后線蟲的死亡率分別為8055%、84.99%；B1619發酵液粗提物和發酵液對線蟲的室內毒力測定結果表明，B1619的發酵液粗提物對線蟲起主要毒殺作用。至于B1619菌株發酵液粗提物中對線蟲有毒殺作用的主要生物活性物質以及活性物質的分離、結構鑒定、作用機制還有待于進一步研究。

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