歐洲冬青種皮特性與種子休眠的關系

賈有偉+魏馳宇+田如男

摘要：通過歐洲冬青種子的形態解剖、種皮構造的電鏡掃描、種皮透水性等試驗，對歐洲冬青種皮結構及其對透水性的影響進行研究，以探討歐洲冬青種皮特性與種子休眠的關系。電鏡掃描結果顯示，歐洲冬青種子種皮分為外種皮、中種皮、內種皮3層，其中外種皮表面角質化且結構復雜，外種皮中的厚壁細胞及柵欄組織存在阻礙胚與外界進行水分與氣體交換的可能，進而影響種子萌發。種子透水性試驗及各部分含水量測定結果表明，完整種子與酸蝕種子均能很快吸脹，且完整種子的胚能吸收到部分水分。因此，種子的透水性不是引起歐洲冬青種子休眠的最主要因素。但是，歐洲冬青種子種皮結構存在影響種子透氣性的可能，并對胚的萌發產生機械阻力。

關鍵詞：歐洲冬青；種皮結構；透水性；種子休眠

中圖分類號： S684.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0096-03

別稱英國冬青，是冬青科冬青屬的常綠闊葉喬木或灌木，為園林綠化中的優良觀賞樹種，原產于歐洲的西北部、南部、中部[1]，通常生長在溫帶森林，為北極第三紀孑遺物種[2]。歐洲冬青樹冠形態優美，葉色濃綠，秋季紅果懸掛枝頭經冬不落，可以給冬季增添暖色，具有極高的觀賞價值；可孤植、作綠籬或盆栽，也常被布置在橡樹及其他高大樹木下[3]，是西歐、南歐、西北非洲等地常用的優良觀賞樹種[4]。歐洲冬青在北美國家園林綠化中應用較為廣泛，而在我國應用較少[5]，冬青屬只有少數幾個種和品種在我國園林中有所應用。有學者認為，歐洲冬青種子具有綜合性休眠的特性，種胚分化尚未完成，屬于隔年發芽的種子。歐洲冬青種子這種綜合性休眠的特性為其有性繁殖等工作帶來了很多困難，目前歐洲冬青主要采用扦插和嫁接等無性繁殖方法進行繁殖。前人對歐洲冬青的研究多集中在植物抗性及種群分布等方面[6]，對其種子休眠機理及解除方法的研究少見報道。本研究通過對歐洲冬青種子形態解剖及種皮構造的電鏡掃描、種皮透水性等試驗，分析歐洲冬青種皮特性與種子休眠的關系，旨在為探討歐洲冬青種子休眠機理提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

材料來自2015年由荷蘭引進的歐洲冬青種子（凈度 96.2%，含水量14.08%）。將風干的歐洲冬青種子放入清水中，立即攪拌，將下沉種子撈出，重復3次，將最后1次下沉的種子撈出置于陰涼干燥處風干，所得種子即為供試種子。

1.2方法

1.2.1種子的基本形態及結構觀察采用四分法隨機選取4×100粒歐洲冬青種子，用游標卡尺測定種子的長度、寬度、高度（定義為種子腹線與背線的最大距離），用1/10 000電子分析天平測定種子千粒質量。100粒為1組，8個重復。取歐洲冬青風干種子，用清水浸泡3 h，待其膨脹軟化后，分離出完整的胚乳和種胚，并將種子進行縱剖，對種子結構進行觀察、記錄、拍照。取經98%濃硫酸處理30 min的歐洲冬青種子10粒，將其置于2.5%戊二醛中固定，經過系列丙酮脫水，最后轉入乙酸異戊酯后進行臨界點干燥、噴金。在FEI Quanta 200環境掃描電子顯微鏡下觀察種子橫斷面及表面等結構，選擇近胚端觀察種子表面的結構[7]。以未進行任何處理的種子作為對照。用Image J測量種皮背部及腹部厚度。

1.2.2種皮透水性測定取風干種子2份，每份50粒，其中1份為未進行處理的完整種子，1份為酸蝕種子（用98%濃H2SO4腐蝕30 min，再用流水沖洗1 d），每份種子設3次重復。將2種不同處理的種子分別進行稱質量，各添加25 mL蒸餾水于燒杯中進行浸泡，將種子置于人工智能培養箱于 25 ℃ 下進行吸脹。定期將種子撈出（第1天日間每隔2 h測定1次，夜晚隔12 h測定1次，第2天日間每隔6 h測定1次），用濾紙吸干種子表面水分，在1/10 000電子分析天平上稱質量并記錄，直至種子質量不再變化，計算吸水率。吸水完畢后繪制歐洲冬青種子的吸水曲線，測定其透水性。

吸水率=吸水后質量-吸水前質量吸水前質量×100%。（1）

參照國家標準林木種子檢驗規程（GB 2772—1999），采用恒高溫烘干法測定歐洲冬青種子種皮和胚乳（含胚）2部分的含水量，將未進行任何處理的種子作為對照。將歐洲冬青種子種皮和胚乳2部分分別放入鋁盒中，在130℃恒溫烘箱中烘干，種子烘至恒質量后分別計算2部分的含水量。

含水量=m2-m3m2-m1×100%。（2）

式中：m1為樣品盒和蓋的質量（g）；m2為樣品盒和蓋及樣品的烘前質量（g）；m3為樣品盒和蓋及樣品的烘后質量（g）。1.3數據處理

用Excel 2003和SPSS 18.0統計分析軟件進行方差分析和多重比較，采用Duncans法進行多重比較。

2結果與分析

2.1歐洲冬青種子基本形態特征

歐洲冬青種子外部輪廓呈半月形，種皮革質，較硬，呈黃褐色，種皮表面具縱向分布深淺不一的溝壑，內凹，種子背部及腹部厚度不均勻。歐洲冬青種子外部形態統一，長度 6.99 mm，寬度3.90 mm，高度3.08 mm，千粒質量為38.82 g。歐洲冬青種子去除外種皮和中種皮的種仁呈長橢圓形；胚乳及胚呈乳白色，種仁被胚乳充滿，屬于典型的胚乳型種子，種胚較小，尚處于胚原基階段，長度為0.51～0.67 mm；歐洲冬青的種胚位于種子的角隅處（珠孔端），約占胚乳長度的 1/10。整個胚浸在胚乳細胞形成的囊腔中（圖1）。

2.2歐洲冬青種皮構造

為了更為清晰地觀察種皮構造，將歐洲冬青種子置于環境掃描電子顯微鏡下觀察。電鏡觀察結果顯示，其種皮結構清晰，種皮腹部厚度為0.28～0.46 mm，背部厚度為0.32～0.58 mm，2部位厚度差異明顯。種皮分為3層，即外種皮、中種皮、內種皮。電鏡下顯示，歐洲冬青種子外種皮表面角質化，凹凸不平，紋飾清晰可見（圖2-b）；種皮表面種脊明顯，有少量裂痕（圖2-a）。如圖2-c所示，將種皮橫斷面結構放大200倍進行觀察，可見外種皮結構復雜，種脊處有平行于種皮表面的維管束，由螺紋導管構成，其細胞端壁由穿孔相互連接，維管束厚度約為264.95 μm（圖2-i）；環繞于維管束周endprint

圍的是排列緊密的實心纖維細胞，其兩側是細胞壁強烈增厚的柵欄細胞，厚度約為144.67 μm（圖2-j）；靠近內種皮的1層結構為垂直于柵欄層排列的纖維細胞，橫向纖維細胞層的厚度為45.03 μm，縱橫纖維細胞間存在間隙。如圖2-k所示，歐洲冬青種子的中種皮橫切面呈“U”形排列，由柵欄細胞構成，厚度約為29.45 μm，中種皮結構如圖2-l所示；內種皮較薄，細胞排列疏松，厚度約為21.02 μm。圖2-d所示為歐洲冬青的種臍結構，種臍直徑約為275.57 μm，種臍處細胞

排列疏松，且維管束由種臍處開始貫穿于整個種皮。

經98%濃硫酸處理后，歐洲冬青種子表面出現了許多腐蝕裂痕，角質層腐蝕嚴重，且紋飾不清晰，如圖2-e、圖2-f所示；種子酸蝕后，外種皮明顯變薄，種子腹部厚度為0.11～0.20 mm，背部厚度為0.19～0.38 mm，與酸蝕前的種子差異明顯，且中種皮和內種皮結構明顯分離，種臍處腐蝕較嚴重，如圖2-g、圖2-h所示。

2.3歐洲冬青種子的透水性

由圖3可以看出，完整種子與酸蝕種子吸水曲線變化趨勢相似，吸水率均隨著時間的延長而增加。歐洲冬青種子的吸水過程大致分為3個時期，即快速吸水期（0～9 h）、緩慢吸水期（10～20 h）、近飽和期（21～48 h）。吸水1 h后，酸蝕種子的吸水率達15.7%，完整種子的吸水率達12.1%，二者吸水率在透水性測試初期差異明顯；在快速吸水期，完整種子與酸蝕種子均能夠迅速吸水，吸水9 h后，完整種子的吸水率為20.2%，酸蝕種子的吸水率為23.5%，二者吸水差異較為顯著；2種處理的種子在緩慢吸水期吸水率均隨著時間的延長而緩慢增加，吸水20 h兩者吸水率分別達23.5%、25.2%；近飽和期，二者吸水率差異不顯著，吸水48 h后，完整種子的吸水率為24.3%，酸蝕種子的吸水率為25.9%。

試驗結果表明，歐洲冬青的種皮具有一定的透水性。近飽和期完整種子與酸蝕種子吸水率幾乎不再變化，種子吸水接近飽和，至48 h時完整種子吸水率達24.3%，酸蝕種子吸水率達25.9%。方差分析表明，歐洲冬青完整種子與酸蝕種子的吸水率差異顯著（F=86.13，P<0.05），不同處理與時間無交互效應（F=3.01，P=0.087）。

將進行種皮透水性測定的完整種子和酸蝕種子進行解剖，分離成種皮和胚乳（含胚）2部分，測定含水量，以未經吸水性測定的種子作為對照，測定結果如圖4所示。結果表明，吸水達到飽和后，完整種子種皮的含水量為17.16%，比對照種子種皮的含水量高；酸蝕種子種皮的含水量為19.23%，比對照種子的種皮含水量高；酸蝕種子種皮的含水量比完整種子種皮的含水量高，原因可能是種子經過濃硫酸處理后角質層被腐蝕，種皮結構變疏松，因此種皮能吸附部分水分。歐洲冬青完整種子的胚乳（含胚）含水量為10.89%，比對照種子胚乳（含胚）的含水量高，說明歐洲冬青的種胚可以吸收部分水分。方差分析表明，完整種子和酸蝕種子胚乳含水量差異不顯著，表明酸蝕處理不能加強種子的透水性。

3結論與討論

種皮的紋理特征能夠穩定遺傳，是植物長期系統進化的

結果[8]，可以為分析不同物種的親緣關系以及進化提供依據和可行性方法[9]，并具有保護種胚的功能[10]。電鏡掃描結果顯示，歐洲冬青種子表面角質化，角質層與外界環境直接接觸。角質層是植物中廣泛存在的一種蠟狀高度復雜的脂肪性物質[11]，這種細胞排列緊密的角質層結構在一定程度上具有保護種胚的功能，是植物應對不良環境的屏障，但角質層致密的蠟質和角質結構使得歐洲冬青種皮透性較差，阻礙水汽等進入胚乳細胞，使種胚的代謝活動無法正常進行[12]，影響種子的吸脹，因此歐洲冬青種子表面的角質層可能對胚的萌發尤其是胚根的生長產生阻礙作用。歐洲冬青外種皮結構緊密，種脊處由柱狀細胞組成的維管束結構能夠為種子的萌發提供水分及無機鹽；但外種皮中存在大量厚壁細胞及柵欄層，細胞排列緊密的柵欄層不僅是水分進入種子的主要障礙層[13]，而且增加了種皮硬度，歐洲冬青外種皮中的柵欄層存在阻礙種胚萌發的可能，尤其對于胚根的生長伸長具有抑制作用，因此柵欄層的存在可能是導致種胚萌發時無法突破種皮的一個重要原因。外種皮存在大量纖維細胞，無論是縱向還是橫向排列的纖維細胞都在一定程度上阻礙了水分與氣體的擴散，同時大量纖維細胞增加了種皮機械強度，但纖維細胞的阻礙作用遠小于柵欄層。歐洲冬青的種皮結構也在一定程度上影響種子的透水性。內種皮細胞排列疏松，可使水分迅速穿過，對種子萌發并無顯著影響。歐洲冬青表面的種臍結構能在種子萌發過程中為胚乳及胚輸送水分和養料，有利于種子萌發。

對比未處理的歐洲冬青種皮結構可以看出，酸蝕處理能夠腐蝕種皮表面的角質層，種子表面的酸蝕裂痕以及種皮的變薄增強了種子的透水性和透氣性，種皮對種子萌發的機械阻礙作用明顯降低。

歐洲冬青種子的透水性試驗表明，完整種子與酸蝕種子吸水趨勢相似，二者吸水至飽和所需時間差異較小；種皮對種子吸水有所影響，這種影響在吸水初期表現突出，隨著吸水繼續進行，種皮對于透水性的阻礙作用逐漸減小直至消失，說明歐洲冬青的種皮具有一定的透水性，但與一般種子相比吸水速率較慢，吸水達到飽和時所需時間較長[14-15]，這可能是由于其外種皮致密的結構造成的。同時，當吸水至飽和時，酸蝕種子吸水率比完整種子高，造成這一現象的原因可能是種子經濃硫酸處理后種子表面的角質層被腐蝕且外種皮變薄，且酸蝕后使種子致密的柵欄層及纖維細胞結構得到改善，因此增加了種子的透性。但完整種子與酸蝕種子均能很快吸水膨脹，方差分析表明，完整種子和酸蝕種子胚乳含水量差異不顯

著。因此筆者推測，歐洲冬青種子堅硬的外種皮可能會在一定程度上阻礙種胚吸水，從而影響種子的透水性；但其完整種子的胚乳（含胚）仍能吸收5.62%的水分。歐洲冬青種子的種皮結構對透水性的影響可能不是引起歐洲冬青種子休眠的主要因素，但這種致密的種皮結構可能存在影響種子透氣性的因素，并且可能對胚的萌發產生一定的機械阻力，進而使種子難以打破休眠狀態。endprint

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