丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞損傷的保護作用

邵煒軍，卜艷玲，佟勝舉，李 強*

（1．河北省秦皇島市中醫醫院，河北 秦皇島 066000；2．黑龍江省齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞損傷的保護作用

邵煒軍1，卜艷玲2，佟勝舉2，李 強*2

（1．河北省秦皇島市中醫醫院，河北 秦皇島 066000；2．黑龍江省齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

研究丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞損傷的保護作用及機制。方法 利用培養的新生大鼠心肌細胞造成缺血再灌注損傷模型，CCK-8檢測細胞增殖，BD流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。結果：在不同劑量的丹參酮ⅡA干預缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞模型后，細胞活性明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。細胞凋亡結果顯示，與Control 組相比，I/R組心肌細胞凋亡顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），丹參酮ⅡA高低中劑量組心肌細胞凋亡顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 丹參酮ⅡA可以有效保護缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞的損傷。

丹參酮ⅡA、缺血再灌注損傷、心肌細胞

心肌缺血：再灌注損傷是缺血性心臟病臨床治療中最常見的一種病理損害，最近基礎研究和臨床研究顯示，心肌細胞凋亡與心肌缺血/再灌注損傷（I/R）的聯系十分密切，可能是心肌缺血/再灌注損傷發病機制中的重要環節之一。伴隨缺血性心臟病的高發，如何預防或減輕心肌缺血/再灌注損傷已成為研究熱點。丹參酮ⅡA來源于唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，是一種脂溶性物質，桔紅色針狀結晶，具有藥理作用廣泛、副作用小和價格低等優點。本實驗從細胞水平進一步研究丹參酮ⅡA對心肌缺血再灌注損傷的作用機制，為治療心肌缺血再灌注損傷的提供新的依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

SD乳鼠（由齊齊哈爾醫學院動物實驗中心提供），DMEM 培養基、胎牛血清FBS（hyclone公司）；胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗溶液（碧云天）；Ⅱ型膠原酶、牛血清白蛋白BSA（Invirtogen 公司）；cck-8檢測試劑盒（日本同仁化學）；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基）；丹參酮ⅡA（南京景竹醫藥）

1.2 方法

（1）心肌細胞缺血再灌注損傷模型

無菌條件下取SD 乳鼠取心臟，去心包膜及心房，取心室肌，Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶反復消化，差速貼壁法獲得大鼠原代心肌細胞，接種于含10% FBS 和100 mg/L青鏈霉素雙抗的DMEM 培養基，37℃、5% CO2培養約48 h，待增殖良好，進行I/R模型建立。缺血液使用不含胎牛血清、不含糖的DMEM培養基。首先將缺血液用混合氣體（5%CO2和95%N2）平衡2 h以上飽和缺血液，換掉心肌細胞的正常培養液，將飽和過的缺血液迅加入細胞培養，然后將處理完的心肌細胞放置在37C°低氧培養箱（5%CO2和95%N2）中缺氧培養12 h。心肌細胞缺血12 h后，用移液器將缺氧液吸掉，置換上DMEM培養基（含糖、含10% FBS），將用正常培養液的心肌細胞放置在37C°的培養箱（95%空氣和5%CO2）中，繼續培養2 h，建立I/R心肌細胞模型。實驗分為正常心肌細胞組，I/R模型組，丹參酮ⅡA高中低劑量組（2.5 μM，10 μM，40 μM）；

（2）胰蛋白酶消化心肌細胞，制備細胞懸液接種到96孔板中，每孔約100ul細胞懸液，按照各組培養方法進行培養，I/R心肌細胞模型建立后24小時丹參酮ⅡA高中低劑量組分別加入丹參酮ⅡA2.5 μM，10 μM，40 μM，細胞接種后貼壁大約需要培養4小時，加入10 ul CCK8。培養2 h。測定450 nm吸光度。

（3）I/R心肌細胞模型建立后24 h，丹參酮ⅡA高中低劑量組分別加入丹參酮ⅡA2.5 μM，10 μM，40 μM。胰蛋白酶消化各組心肌細胞，離心收集后經冷PBS洗滌細胞2次，加入1×結合緩沖液（binding buffer），制成終濃度約為1×109/L的細胞懸液500 μl．向細胞懸液中先加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC，溫和混勻，4℃避光反應15 min，再加入5 μl PI，溫和混勻，4℃避光孵育5 min，1 h內流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件對研究結果進行分析，計數資料采用百分數（%）表示，例（n）表示，采用x2檢驗，計量數據以“±s”表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

（1）丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞細胞增殖的影響，見表1。CCK-8結果顯示與模型組比較，丹參酮ⅡA組細胞存活率增加，10 μM，40 μM丹參酮ⅡA組細胞存活率明顯增加（P＜0.05）。

表1 丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞細胞增殖的影響（±s）

表1 丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞細胞增殖的影響（±s）

注：與模型組比較（*P＜0.05）

組別 A值I/R模型組 0.32±0.01丹參酮ⅡA（低） 0.36±0.03丹參酮ⅡA（中） 0.46±0.02*丹參酮ⅡA（高） 0.49±0.01*

（2）丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞細胞凋亡的影響，見圖1。細胞經I/R 處理后，與Control 組相比，I/R組心肌細胞凋亡顯著增加（P＜0.05）。I/R細胞模型經過丹參酮ⅡA高中低劑量干預后，進一步探討丹參酮ⅡA對心肌細胞凋亡的影響。結果顯示，與I/R 組相比，丹參酮ⅡA高低中劑量組心肌細胞凋亡顯著減少（P＜0.05），并且呈現一定的量效關系。

圖1丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞細胞凋亡的影響

3 討 論

研究表明，缺血性心臟病已成為現如今嚴重威脅人類身體健康和生命安全的重大疾病之一，最直接有效的治療方法之一是迅速恢復缺血部位的血流灌注[1].心肌缺血再灌注損傷是常用治療如冠狀動脈內溶栓、動脈搭橋以及導管介入治療頻發的嚴重并發癥，缺乏有效的防治途徑。阻礙缺血心肌從再灌注治療中最大難題為心肌缺血再灌注損傷，從而無法取得最好療效，怎樣降低心肌缺血再灌注損傷已經成為缺血再灌注研究的一大熱點[2]。

心肌缺血/ 再灌注損傷是一種多途徑，多因素的病理生理進程，心肌細胞的壞死、凋亡以及自噬伴隨整個過程[3]。研究表明，細胞凋亡參與心肌I /R損傷的病理生理過程，在由于心肌缺血早期而導致死亡的心肌細胞中，心肌細胞發生凋亡的數量甚至多于直接壞死細胞[4]。既往研究顯示丹參酮ⅡA 對大鼠缺血性腦損傷具有保護作用，本實驗研究通過大鼠心肌細胞體外培養并建立缺血再灌注模型，通過cck-8和流式細胞術探討丹參酮ⅡA對缺血再灌注后心肌細胞的保護作用。實驗結果顯示，在不同劑量的丹參酮ⅡA干預缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞模型后，細胞活性明顯增加（P＜0.05）。細胞凋亡結果顯示，與Control 組相比，I/R組心肌細胞凋亡顯著增加（P＜0.05），丹參酮ⅡA高低中劑量組心肌細胞凋亡顯著減少（P＜0.05）。丹參酮ⅡA 對心肌的保護作用隨著其在心血系統的作用機制研究的不斷深入，丹參酮ⅡA可能成為治療缺血性心肌病的重要選擇。

[1] 楊小利,張 駿,周 平,等.胃泌素通過STAT3 途徑對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷發揮保護作用.第三軍醫大學學報,2015,37(9):896-901.

[2] 翟昌林,黎 莉,張 運,等.丹皮酚對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護中HMGB1表達的影響[J].中華中醫藥學刊,2012,10(30):2284-2286.

[3] Xu J,Qin X,Cai X,et al.Mitochondrial JNK activation triggers autophagy and apoptosis and aggravates myocardial injury following ischemia/reperfusion.Biochim Biophys Acta,2015,1852(2):262-270.

[4] 田學峰,王曉云,梁 明,等.丹參酮IIA磺酸鈉聯合腦鈉肽對急性缺血再灌注兔心肌細胞凋亡的影響[J].中國中醫藥科技,2013,20(6):605-606.

本文編輯：李 豆

R542.2

B

ISSN.2095-6681.2017.20.65.02

李強