血府逐瘀膠囊對大鼠急性心肌缺血及心肌線粒體超微結構的影響?

王 梓，楊欣瑩，呂 楠，趙 亮，王 宏，王 蕾△(.天津市醫藥科學研究所，天津 30000； .天津宏仁堂藥業有限公司，天津 300000)

【實驗研究】

血府逐瘀膠囊對大鼠急性心肌缺血及心肌線粒體超微結構的影響?

王 梓1，楊欣瑩2，呂 楠1，趙 亮2，王 宏1，王 蕾1△
(1.天津市醫藥科學研究所，天津 300020； 2.天津宏仁堂藥業有限公司，天津 300000)

目的：觀察血府逐瘀膠囊對大鼠急性心肌缺血及心肌線粒體超微結構的影響。方法：采用冠狀動脈左前降支結扎制備大鼠急性心梗模型，給藥5 d，通過死亡率、心電圖、心臟超聲心動、血漿cTn-T、心肌梗死質量、心肌間質及血管周圍膠原I、III型膠原分布，電鏡觀察心肌線粒體超微結構闡明血府逐瘀膠囊對急性心梗的治療作用及機制。結果：血府逐瘀各劑量組術后即刻死亡率均較模型組降低， cTn-T、LDH、CK降低明顯，高、低劑量組可明顯降低ST段并改善心功能。各劑量組心肌膠原表達顯著降低，對心肌線粒體結構有明顯改善作用。結論：血府逐瘀膠囊對大鼠急性心肌梗死有明確的治療作用，可降低死亡率，降低血漿cTn-T、LDH、CK，改善心電圖ST段，增加射血分數，減小左室內徑，降低心肌膠原表達，改善心肌線粒體超微結構。

血府逐瘀膠囊；急性心肌缺血；線粒體超微結構；透射電鏡

血府逐瘀膠囊臨床用于胸痹心痛突然發作(西醫學中的心絞痛急性發作)的治療。本實驗通過大鼠結扎做冠狀動脈前降支制備急性心肌缺血模型，觀察血府逐瘀膠囊對缺血心肌及心功能的影響，進而觀察對缺血心肌線粒體超微結構及心肌膠原含量的影響，探討血府逐瘀膠囊對心肌缺血的保護作用。

1 材料

1.1 試驗藥物

血府逐瘀膠囊藥粉由天津宏仁堂藥業有限公司提供，磚紅色粉末，2.5 kg/袋(批號E03023)。復方丹參片由廣州白云山制藥有限公司生產，紅色片狀(批號20140807)。

1.2 試驗動物

SD雄性大鼠80只，購于北京大學醫學部實驗動物科學部(許可證號SCXK(京)2012-0001)，體質量(230～250) g，動物飼養(許可證號SYXK(津)2011-0003)于實驗環境內，每天供給北京科澳協力飼料有限公司生產的普通鼠全價顆粒飼料(產品許可證號SCXK(京)2014-0010)。

1.3 實驗儀器

小動物人工呼吸機(Rodent ventilator DH-150)，多道生物信號分析儀(MA2000)，小動物超聲成像系統(富士Visual Sonics Vevo 2100)，多功能酶標儀(Infinite200),HITACHI-7500透射電子顯微鏡, LEICA ULTRACUT-R超薄切片機。

2 方法

2.1 動物分組方法

將大鼠按體質量隨機分成假手術對照組、心梗手術組，將心梗手術組大鼠按體質量隨機分為模型對照組、血府逐瘀1.6、0.8、0.4 g藥粉·kg-1(分別相當于人用劑量的24、12、6倍)、丹參片對照組(人用劑量12倍)5組各12只。

2.2 給藥方法

預防性給藥2 d，術前30 min前給藥1次，術后給藥3 d，灌胃給藥每天1次。

2.3 造模方法

大鼠灌胃給藥3 d，第3天末次給藥30 min后，大鼠用4.5%戊巴比妥鈉溶液按1 ml·kg-1注射體積腹腔注射麻醉固定于鼠板上，手術器械消毒后，無菌環境下沿大鼠左腋下和胸骨劍突連線處切開皮膚，小心逐層鈍性分離大鼠肌肉，小動物呼吸機連接大鼠口鼻(呼吸比1∶3，潮氣量32，頻率60)，第四、五肋間開胸，快速撕破心包膜后擠出暴露心臟，3-0型號縫合線永久性結扎左冠狀動脈前降支，心臟復位后閉胸擠出空氣，3-0縫合線縫合大鼠肌肉皮膚。假手術對照組在相同情況下只穿線不結扎心臟。手術前后測量大鼠四肢Ⅱ導聯心電圖，若術后心電圖ST段抬高或QRS波群有明顯變化，則視為手術造模成功[1-3]。

2.4 觀察指標

2.4.1 大鼠死亡率 記錄各組死亡數(手術失敗造成大出血、窒息等不列入統計中)，計算存活百分比。

2.4.2 大鼠心電圖 多道生物信號分析儀記錄大鼠術前后II導聯心電圖。

2.4.3 大鼠心臟超聲心動圖 大鼠戊巴腹腔麻醉后，富士Visual Sonics Vevo 2100系統測量大鼠左室后壁(LVPW)、左心室射血分數(LVEF)、心臟室間隔(IVS)，取3個周期的平均值作為實驗數據。

2.4.4 大鼠血生化指標 生化儀測定手術后3 h的大鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的含量，化學發光法測定結扎31 h后的血漿肌鈣蛋白T(cTn-T)。

2.4.5 大鼠心梗面積及質量百分數 器材消毒后將心臟取出，并用生理鹽水沖洗干凈，手術刀將心肌切成3 mm待染色用，所取心肌片浸泡在1% NBT染液中染色，白色為心梗部位，紅色為非梗死部位。稱量全心濕重并剪下梗死部位稱量期濕重，計算梗死百分數。

2.4.6 大鼠心肌纖維化及膠原分析 大鼠左心室心肌經脫蠟-蘇木素染核-分色-0.1%天狼星紅飽和苦味酸溶液染色-酒精，二甲苯透明-中性樹膠封片。封片后，400倍顯微鏡下觀察采集圖片，采用mage Pro plus6.3圖像分析系統，測量血管周圍膠原容積分數(PCVF)與心肌膠原容積分數(ICVF)。計算公式為：PCVF=小動脈管腔周圍膠原面積/動脈管腔面積，ICVF=膠原面積/總面積，每一標本采集3個視野取均值數據入組。偏振光顯微鏡觀察膠原著色，著色的膠原呈現明亮狀態，著色的 I型膠原纖維呈紅或黃，排列緊密，具有強雙折光性；III型膠原纖維呈綠色，疏網狀細纖維，呈弱雙折光性。

2.4.7 心肌線粒體超微結構 將處死的大鼠心臟組織迅速切取缺血位置心室肌，每只3塊，黃豆粒大小。放入事先4 ℃低溫保存的1%四氧化鋨+2.5%戊二醛溶液中固定，乙醇升梯度脫水，環氧丙烷過渡、包埋， 50 nm切片行醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，日立牌透射電鏡觀察并采集圖像。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 血府逐瘀膠囊對術后大鼠死亡率的影響

表1顯示，結扎即刻模型對照組死亡率為41.7%，血府逐瘀各劑量組中1.6 g藥粉·kg-1達到100%存活，明顯低于模型對照組(P<0.05)。

表1 血府逐瘀膠囊對大鼠心梗手術死亡率的影響

注：與假手術對照組比較：▲P<0.05；與模型對照組比較：★P<0.05

3.2 血府逐瘀膠囊對血漿cTn-T及血清LDH、CK的影響

表2顯示，與模型對照組比較血府逐瘀膠囊各劑量組對cTn-T、LDH、CK有明顯降低作用。

3.3 血府逐瘀膠囊對心電圖、超聲心動和心肌梗死質量[4]的影響

表3顯示，血府逐瘀膠囊各劑量組較模型對照組比較抬高幅度明顯降低，降低IVS、升高LVPW，降低EF，改善心功能(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。

3.4 血府逐瘀膠囊對急性心肌梗死后心肌膠原分布及左室心肌I、III型膠原含量影響

表4顯示，與假手術組比較，模型對照組大鼠左心室肌間隙有大量膠原纖維堆積，血府逐瘀膠囊各劑量組較模型組膠原纖維堆積情況有所減輕，ICVF、PCVF顯著降低(P<0.01)。與模型對照組比較，丹參片組、血府逐瘀膠囊各劑量組心肌I型膠原纖維含量顯著降低(P<0.01)，III型膠原纖維含量較模型對照組為輕。

表2 血府逐瘀膠囊對心梗大鼠血漿cTn-T、血清LDH、CK的影響

注：與假手術對照組t檢驗：▲P<0.05，▲▲P<0.01，與模型對照組方差分析：★P<0.05，★★P<0.01

表3 血府逐瘀膠囊對心梗大鼠心電圖ST段及超聲心動的影響

注：與假手術對照組t檢驗：▲▲P<0.01，與模型對照組方差分析：★P<0.05，★★P<0.01

表4 血府逐瘀膠囊對急性心肌梗死后心肌膠原纖維及I、III型膠原含量的影響

注：與假手術對照組t檢驗：▲▲P<0.01，與模型對照組方差分析：★★P<0.01

3.5 血府逐瘀膠囊對大鼠左室心肌線粒體超微結構的影響

模型對照組大鼠心肌細胞排列不規整，多處心肌細胞間存在大量炎細胞、成纖維細胞及小血管(圖1B×2000)。有的心肌細胞結構松散(圖1B×10000)，有的心肌細胞內肌絲大部分降解只留殘影(圖1B×20000)。心肌細胞內肌節長度不均一。有的肌絲斷裂，斷端呈毛刷狀(圖1B×10000)。線粒體失去規則排列狀態，聚集成堆，許多線粒體變形。線粒體腫脹，部分外膜破裂(圖1B×30000)，腫脹的線粒體體積增大，基質電子密度下降。線粒體嵴排列紊亂甚至斷裂，可見線狀致密變嵴，尚有線粒體基質內出現云絮狀結構(圖1B×30000)。血府逐瘀膠囊3個劑量組對心肌線粒體結構均有明顯改善作用，可見心肌細胞排列恢復規整，間質內有少量炎細胞及成纖維細胞存在(圖1C×2000)。心肌肌絲排列整齊，連續無斷裂(圖1C×5000)，心肌肌節排列整齊。橫管系統輕到中度擴張(圖1E×20000)。心肌細胞內線粒體與肌絲相間排列整齊(圖1C×20000)。心肌線粒體大小、形態正常，線粒體嵴結構清晰，少量嵴稍模糊。線粒體基質電子密度中等(圖1C×30000)。

圖1 左心室心肌線粒體超微結構圖(×2000，×5000，×10000，×20000，×30000)注：A.假手術對照組；B.模型對照組；C.血府逐瘀高劑量組；D.血府逐瘀中劑量組；E.血府逐瘀低劑量組

4 討論

血府逐瘀湯為中醫方劑中的理血劑，具有活血化瘀、行氣止痛之功效，是清代名醫王清任所創，主治胸中血瘀證，藥方始收于《醫林改錯·上卷》。全方由當歸、生地黃等11味中藥組成，臨床常用于治療冠心病心絞痛、風濕性心臟病、心肌梗死的治療，取得了較滿意的效果[5-6]。有文獻報道，血府逐瘀膠囊具有抗心肌細胞損傷、保護心肌的作用[7-8]。本實驗旨在研究血府逐瘀膠囊對大鼠急性心肌缺血的作用機制，闡明其保護心肌的作用機理。

cTn-T為急性心肌缺血早期診斷指標，由于其出現時間早、特異性高、敏感度高等特點，因而成為臨床早期判斷心梗的重要依據之一。cTn-T具有特異性和敏感性，在心肌壞死時釋放入血[9-10]。本課題組對大鼠急性心梗模型進行了摸索并得出結論，cTn-T在31 h最接近達峰時間，具有早期診斷心肌梗死的價值，可作為判斷AMI時心肌梗死程度和預后的參考指標[11]。本實驗中，血府逐瘀膠囊各劑量組可以顯著降低急性心肌缺血大鼠cTn-T水平，從而達到保護心肌的目的。在急性心梗、心室重構中存在心肌纖維化，心肌間質中存在異常膠原增生，目前發現，心肌膠原至少有I、III、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型5種，其中I、III型膠原最多，主要構成間質膠原，以纖維形式存在，I型約占80%，III型約占10%。I型屬于成熟型膠原，抗張強度大但回彈性小； III型屬于胚胎性膠原，回彈性大但抗張性較差。III型膠原增加可引起心室的順應性增加，I型膠原可以增加心肌僵硬程度，2種膠原的比例可反映心肌纖維化程度，當二者比例失調時易誘發室性心律失常。膠原是保持心臟結構完整和舒縮期幾何形態、傳遞心肌收縮力、維持心室功能的必要成分，現在證明膠原過度沉淀會使心肌僵硬度增加，而膠原降解過度則使心臟發生破裂的可能性增加[12-13]。人體中膠原正常含量在4%左右，當含量增加至10%左右時，便出現心臟舒張順應性下降，心室充盈速率降低，含量繼續增加至20%以上，多余的膠原會封閉地包圍正常的心肌細胞，從而導致心臟收縮發生困難誘發心衰[14]。急性心肌缺血大鼠經血府逐瘀膠囊治療后，I、III型膠原含量與模型組對照組比較顯著減少，且二者比例明顯降低，趨近于正常含量水平，表明血府逐瘀膠囊能通過改善心肌膠原含量水平，達到保護心肌細胞的目的。人體細胞中，線粒體是一種存在于大多數真核細胞中的由兩層膜包被的細胞器，直徑在0.5～10 μm左右，是細胞的發電廠，具有產生能量和自由基等作用。線粒體結構的完整性與否可以最直觀地反映心肌缺血的程度。線粒體內膜通透性極低，幾乎所有的離子甚至質子都不能通過，基質成分和代謝物必須在載體蛋白或高選擇性通道的協助下才能實現跨膜運輸[15-16]。正常情況下，線粒體外膜對膜間隙蛋白是不通透的，但當發生心肌缺血等情況及線粒體外模通透性增加時，關鍵性蛋白被釋放到細胞質并轉移到核內或與內質網上的受體相互作用，打破了線粒體上各種物質的“穩態”，因而線粒體的完整性對心肌細胞的存活至關重要。血府逐瘀膠囊可以使急性心肌缺血大鼠較模型對照組最大程度地保留心肌線粒體的結構，維持心肌線粒體超微結構及線粒體內膜基本功能，盡可能地保護心肌細胞的完整性。

通過以上實驗數據我們證實，血府逐瘀膠囊對缺血心室肌線粒體超微結構及心肌中膠原含量具有明顯的改善作用，明示了其對保護心肌缺血損傷的作用機制。

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Effects of Xuefu Zhuyu Capsule on acute Myocardial Ischemia and Ultrastructure of Myocardial Mitochondria in Rats

WANG Zi1, YANG Xin-ying2, LV Nan1, ZHAO Liang2, WANG Hong1, WANG Lei1△
(1.TianjinInstituteofMedicalandPharmaceuticalSciences，Tianjin300020,China; 2.TianjinHongrentangPharmaceuticalCo.,Ltd,Tianjin,Tianjin300020,China)

Objective:To observe the effect of Xuefu Zhuyu capsule on rats‘ acute myocardial ischemia and myocardial mitochondria’s ultra structure. Methods: The acute myocardial infarction model was made by the ligation of left anterior descending coronary artery in rats. Administration of 5d.Mortality, electrocardiogram, cardiac echocardiography, cTn-T, myocardial infarction weight, myocardial interstitial and perivascular collagen type I、 III collagen distribution, myocardial mitochondrial ultrastructural, clarify the Xuefu Zhuyu Capsule on the acute myocardial infarction treatment effect and mechanism. Results：Mortality，cTn-T，LDH，CK, ECG ST reduced. Myocardial collagen expression was significantly reduced, and the structure of myocardial mitochondria was significantly improved. Conclusion：Xuefu Zhuyu capsule has a definite therapeutic effect on the acute myocardial infarction in rats, which can reduce the mortality rate, reduce plasma cTn-T, LDH, CK, improve the ECG ST segment, increase ejection fraction, decreased left ventricular diameter, reducing myocardial collagen expression, improve myocardial mitochondrial ultra structure.

Xuefu Zhuyu capsules; Acute myocardial ischemia; Mitochondrial ultrastructure; Transmission electron microscope

天津市“殺手锏”產品研發項目(14ZXSSSY01330)

王 梓(1987-)，男，天津人，助理研究員，醫學學士，從事心腦血管病的藥理機制研究。

△通訊作者：王 蕾，副研究員，醫學碩士，從事心腦血管病的藥理機制研究，Tel：022-27236137，E-mail：zws9905@sina.com。

R542.2

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1006-3250(2017)08-1067-04

2017-01-14