腎絡通對高糖培養足細胞VEGF和Flt-1的影響?

婁菲菲，方 超，潘利敏，王月華△，丁英鈞，郭 帥，李 英(. 河北醫科大學第三醫院，石家莊 05008； . 河北省滄州市中西結合醫院，滄州 0600； . 河北省中醫院，石家莊 0500； . 河北中醫學院，石家莊 05000)

【實驗研究】

腎絡通對高糖培養足細胞VEGF和Flt-1的影響?

婁菲菲1，方 超2，潘利敏3，王月華1△，丁英鈞4，郭 帥1，李 英1
(1. 河北醫科大學第三醫院，石家莊 050081； 2. 河北省滄州市中西結合醫院，滄州 061001； 3. 河北省中醫院，石家莊 050011； 4. 河北中醫學院，石家莊 050200)

目的:探討腎絡通對高糖培養足細胞血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體(vascular endothelial growth factor receptor-1,VEGFR1/Flt-1)的影響。方法:將12只SPF級雄性SD大鼠按隨機數字表法分為對照組和低、中、高劑量中藥組。對照組給予生理鹽水，處理組給予不同劑量的腎絡通中藥灌胃，各組均在灌胃3 d后心臟無菌取血制備中藥血清，小鼠足細胞的培養分為空白對照組、高糖組、正常鼠血清對照組和低、中、高劑量中藥血清組，刺激24 h后采用免疫細胞化學(immunocytochemistry)、免疫印跡(western blot)、熒光實時定量PCR(Real-time PCR)法觀察VEGF、Flt-1表達的變化。結果：VEGF、Flt-1在高糖組和正常鼠血清組小鼠足細胞均可見陽性表達，中藥血清組的足細胞VEGF、Flt-1蛋白和mRNA均較高糖組和正常鼠血清組降低，差異有統計學意義。結論：腎絡通可抑制高糖環境下足細胞VEGF、Flt-1的表達，減輕足細胞的損傷，保護腎功能。

糖尿病腎病；中藥；足細胞；血管內皮生長因子

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病患者重要的并發癥之一，以糖尿病為原發病的慢性腎臟病患者罹患更高的死亡率、心血管事件和腎衰竭的風險[1]，DN現已成為導致終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的重要病因。

前期研究中，我們以益氣養陰消癥通絡為DN的治療大法，研究證實該法通過對DN大鼠TGF-β/Smads、氧化應激、腎素-血管緊張素-醛固酮(RASS)系統、足細胞裂孔隔膜蛋白[2]的影響發揮對DN的治療作用。本研究繼以高糖環境下培養的足細胞為研究對象并進行體外實驗，從細胞水平觀察腎絡通對高糖刺激足細胞VEGF及Flt-1表達的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠12只，體質量200～220 g(動物合格證編號1404079)，購自河北醫科大學實驗動物中心。

1.2 藥物及細胞

腎絡通組成：地龍12 g，鱉甲15 g，丹參15 g，大黃6 g，僵蠶10 g，烏梢蛇10 g，水蛭3 g，黃芪20 g，玄參15 g，熟地15 g，山萸肉10 g，均為免煎顆粒(廣東一方制藥有限公司)。中劑量中藥組為臨床劑量，低、高劑量分別為臨床的半量和2倍用量，按Meeh-Rubner公式[3-4]折算。永生化小鼠足細胞購自北京協和醫學院基礎學院基礎醫學細胞中心。

1.3 主要試劑與儀器

兔抗小鼠VEGF多克隆抗體，Affitiny AF5131(英國EterLife公司)；兔抗小鼠Flt-1多克隆抗體，Affinity AF6204(武漢三鷹生物技術有限公司)； HRP標記的山羊抗兔二抗，Maibio HSA0003(上海麥約爾生物技術有限公司)。表1顯示，VEGF、Flt-1、GAPDH引物由廣州復能基因有限公司合成；Real-time PCR試劑盒，Takara公司；轉移電泳儀，北京六一儀器廠；PCR擴增儀，西安天隆科技有限公司；Real-time PCR儀，美國Stratagene Mp3005p。

2 方法

2.1 分組與血清制備

按隨機數字表法將12只SD大鼠分為正常對照組和低、中、高劑量中藥血清組，適應性飼養24 h后，每只大鼠每12 h灌胃1次，連續給藥3 d后心臟無菌取血制備藥物血清。

2.2 小鼠足細胞培養

2.2.1 細胞復蘇 將凍存管取出后迅速放入37 ℃水浴箱中，勿使水面沒過凍存管口以免造成細胞污染，待凍存液溶解后進行細胞培養。

2.2.2 細胞培養及分組 小鼠足細胞在底面積75 cm2的培養瓶中進行培養，加入完全培養基，包括10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、10U/ml小鼠重組γ-IFN、雙抗100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素(P/S)。將細胞接種均勻后置于33 ℃、5%CO2培養箱中增殖，細胞密度約80%時傳代，在無γ-IFN的培養基、37 ℃、5%CO2培養箱中培養10～14 d，待細胞分化成熟后血清饑餓24 h。將細胞分為正常對照組(Normal Control，NC)、高糖組(High Glucose，HG)、正常鼠血清組(Normal Rat，NR)、低劑量中藥血清組(Low dose of drug，LD)、中劑量中藥血清組(Normal dose of drug，ND)、高劑量中藥血清組(High dose of drug，HD)。NC組細胞培養基為D-glucose 5.5 mmol/L+5%FBS，HG組培養基為D-glucose 30 mmol/L+5%FBS，NR組培養基為D-glucose 30mmol/L+5%FBS+5%正常鼠血清，LD組培養基為D-glucose 30 mmol/L+5%FBS+5%低劑量中藥血清，ND組培養基為D-glucose 30 mmol/L+5%FBS+5%中劑量中藥血清，HD組培養基為D-glucose 30 mmol/L+5%FBS+5%高劑量中藥血清。刺激24 h后進行免疫細胞化學、免疫印跡、熒光實時定量PCR檢測。

2.3 指標檢測

2.3.1 免疫細胞化學 將細胞接種于鋪有載玻片的24孔板，待細胞貼壁后棄培養液，4 ℃預冷的PBS洗滌后空氣干燥，于玻片上滴加預冷的4%多聚甲醛200～300 μL，4℃過夜。次日用蒸餾水洗滌玻片后用PBS浸泡5 min，再將玻片放入3% H2O2去離子水中，室溫30 min，0.3%Triton X-100通透30 min，10%BSA封閉，室溫10 min。將兔抗鼠VEGF多克隆抗體(Affitiny AF5131 1∶100)、兔抗鼠Flt-1多克隆抗體(Affinity AF6204 1∶100)分別滴加于玻片上， 4 ℃過夜。次日取出玻片用PBS洗滌，隨后將HRP標記的山羊抗兔二抗(Maibio HSA0003)滴加于載玻片細胞面，室溫避光30 min。加入顯色液反應后蒸餾水沖洗，蘇木素染1 min，充分沖洗后置于不同濃度的乙醇中梯度脫水，中性樹膠封片后光鏡下觀察VEGF、Flt-1的表達情況。

2.3.2 免疫印跡 取出足細胞棄去培養液，用4 ℃預冷的PBS洗滌，吸干PBS加入RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min后將細胞混懸液收集， 4 ℃、12000 rpm/min離心10 min，吸取上清即為細胞總蛋白。BCA法測定總蛋白濃度，蛋白上樣量40 μg，濃縮膠40V，分離膠60V恒壓進行電泳，隨后進行電轉印2 h，結束后用 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。滴加兔抗鼠VEGF多克隆抗體(Affitiny AF5131 1∶100),兔抗鼠Flt-1多克隆抗體(Affinity AF6204 1∶100)，4 ℃過夜。次日洗膜后用山羊抗兔二抗室溫孵育60 min。TBST洗膜后放入Image Quant Las mini成像系統， Image J進行灰度分析，以對照組為l，計算余組表達量。

2.3.3 熒光實時定量PCR 提取細胞總RNA在培養瓶中加入Trizol 1ml，15 min后將細胞收集至EP管中，每管加入200 μL三氯甲烷混勻，隨后4℃12000 rpm/min離心20 min，取上層水相移至新的EP管后，加入等體積異丙醇混勻后冰上靜置15 min。4℃12000 rpm/min離心20 min，棄上清后干燥，75%無水乙醇lml充分洗滌RNA沉淀再次離心，棄上清后室溫干燥，加入適量1‰ DEPC水溶解RNA，并用槍輕柔吹打混勻，對RNA樣品進行品質鑒定。混勻PCR Mix并將室溫孵育1 h。表1顯示，95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，40個循環后記錄CT值。以GAPDH作為內參，用2-△△CT法進行分析，以對照組為1，計算其他各組的相對表達量。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 免疫細胞化學檢測VEGF、Flt-1

圖1、2顯示，顯微鏡下觀察VEGF、Flt-1主要在足細胞的胞漿內表達，在正常組的細胞漿內少量表達；高糖組、正常鼠血清組在細胞漿、核周均可見陽性表達，2組表達量相近。中藥組胞漿中的表達均較高糖組、正常鼠血清組低，且中劑量中藥組VEGF、Flt-1的表達較弱。

圖1 免疫細胞化學檢測VEGF的表達(×200)

圖2 免疫細胞化學檢測 Flt-1 的表達(×200)

3.2 免疫印跡法檢測VEGF、Flt-1蛋白表達量

圖3、4顯示，高糖組、正常鼠血清組VEGF表達明顯升高，2組與空白對照組和中劑量中藥組比較差異有統計學意義(P<0.05)。中藥組較高糖組、正常鼠血清組VEGF表達量降低，且用藥劑量與VEGF表達量呈負相關。Flt-1與VEGF趨勢一致，高糖和正常鼠血清組均出現高表達，中藥組表達量降低。

圖4 免疫印跡檢測VEGF和 Flt-1蛋白表達量

3.3 熒光實時定量PCR法檢測VEGF、Flt-1的mRNA表達量

圖5顯示，高糖組和正常鼠血清組VEGF mRNA表達量均較空白對照組和中藥組高(P<0.05)。中藥組較高糖組和正常鼠血清組VEGF表達下調，且藥物劑量與VEGF呈負相關，差異有統計學意義(P<0.05)。Flt-1 mRNA表達趨勢與VEGF大致一致，中藥組較高糖組和正常鼠血清組顯著降低，說明劑量越大表達量越低。

表1 VEGF FLT-1 GAPDH基因序列

4 討論

圖5 實時熒光定量PCR檢測VEGF 和 Flt-1的mRNA表達量

足細胞是腎小球血管壁的主要成分之一，對于維持血管壁的完整性至關重要。足細胞的損傷會導致腎小球高壓力、高濾過，加速蛋白尿的產生和腎臟病的進展。微血管病變是DN發病及病情進展的重要因素，VEGF是體內最具活力的血管生長因子，在DN微血管病變中的意義重大，其在腎臟內主要由足細胞分泌，并且在腎小球內皮細胞、腎小管上皮細胞和系膜細胞中均有一定表達。Flt-1、Flk為VEGF的特異性受體，其中Flt-1參與細胞的增殖和分化過程，全長7680 bp位于13q12號染色體上，分子量約180KD，由7個免疫球蛋白樣環的胞外區、跨膜區和酪氨酸激酶區構成，可結合于VEGF121、VEGF165[5]。VEGF過表達并通過旁分泌途徑對酪氨酸激酶受體Flt-1發揮正向調控作用，二者結合后才能激活一系列信號通路進而發揮生物學效應[6]，最主要的是可以增加內皮細胞通透性，并可能會使足細胞骨架結構發生改變、足突融合，使腎小球濾過屏障受損，導致蛋白尿的產生，加速DN的進展[9]。另有研究發現，VEGF在血管生成過程中可激活Notch信號通路。John C. Chappell等[10]發現，Flt-1作為Notch信號通路的上游，通過調節VEGF信號可以在血管形成的過程中介導重要的VEGF-Notch通路反饋環，Flt-1調節VEGF信號功能的缺失會使Notch信號過高表達。Flt-1在此信號通路中發揮重要作用，其缺失會使信號通路出現紊亂，且Flt-1基因敲除后會導致靜脈出現畸形。

由于DN發病率的升高，越來越多的患者因長期血糖控制欠佳進展至終末期腎臟病，遠期預后不良。中醫藥對于DN治療有一定的優勢，臨床常能取得較好療效。我們認為，DN的基本病機是氣虛無力運血而致血瘀，陰虛火旺、煎熬津液、津虧液少則血液黏稠不暢而致“陰虛血瘀”，病久不愈深伏于腎絡漸成微小癥積，致使腎體受損、腎用失司導致DN的發生。結合“病久必瘀、病久入絡”的中醫學理論，提出該病位在絡，“瘀血癥積阻于腎絡”可能是病機之關鍵，同時結合DN氣陰兩虛的基本病機，經過臨證的反復篩選確定了一個相對固定治療DN的基本方腎絡通，以消癥通絡為主兼以益氣養陰。其中黃芪、玄參益氣養陰，地龍、僵蠶、烏梢蛇、鱉甲等消癥通絡。前期動物實驗和臨床實驗[2、11-13]中，我們運用腎絡通治療早期DN患者，發現其化驗指標、臨床癥狀、體征和生存質量都得到顯著改善。本研究在前期的基礎上，采用細胞培養技術，模擬DN患者體內的高糖環境，觀察腎絡通對足細胞VEGF和Flt-1表達的影響。發現其對于早期DN足細胞有一定的保護作用，高糖組和正常鼠血清組VEGF、Flt-1高水平表達，而在中藥組中顯著降低，預期進一步可降低血管通透性，改善腎小球高濾過，從而減輕足細胞的損傷和蛋白尿的產生，起到保護腎功能、改善預后的作用。

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Effects of Shentongluo on VEGF and Flt-1 in Podocytes Cultured with High Glucose

LOU Fei-fei1, FANG Chao2, PAN Li-ming3, WNAG Yue-huang1△,DING Ying-jun4, GOU Shuai1, LI Ying1
(1.No.3HospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050081，China; 2.CangzhouHospitalofIntergratedTraditionalChineseandWesterMedicine,Hebei,Congzhou061001,China; 3.TraditionalChineseHospitalofHebeiProvince,Shijiazhang050011,China; 4.CollegeofTraditionalChineseMedicine,Shijiazhuang050200,China)

Objective: To observe the effect of Shen Luo Tong on diabetic nephropathy VEGF and FLT-1. Method: 12 healthy SPF male rats were randomly divided into the control group and experimental groups with six rats in each group. The control group was given normal saline through gavage while the experimental groups were given different doses of the traditional Chinese medicine through gavage for 3 days. Then the rats were sacrificed to collect blood samples from heart. The culture podocytes of rats were divided into the control group, high glucose group, normal rat serum group and another three serum groups were treated by different doses of Chinese medicine. After stimulated for 24hours, the expression of VEGF and Flt-1 were observed by the method of immunocytochemistry、 western blot and real-time PCR.Results: The protein and mRNA expression of VEGF and Flt-1 in normal rat serum group and high glucose group can be clearly observed as positive. The expression in Chinese medicine serum stimulated group was lower compared to high glucose group and normal rat serum group (the difference has statistical significance). Conclusion: The expression of VEGF and Flt-1 of podocyte can be suppressed by Shen Luo tong which can contribute to protect podocytes from injury and renal dysfunction.

Diabetic nephropathy; Traditional Chinese medicine; Podocyte; Vascular endothelial growth factor

國家自然科學基金資助項目(81202829)

婁菲菲(1988-)，女，河北滄州人，醫師，醫學碩士，從事中西醫結合腎臟病的臨床與基礎研究。

△通訊作者：王月華(1973-)，女，主任醫師，醫學博士，碩士研究生導師，從事慢性腎臟病的臨床與基礎研究， E-mail:wangyuehua@medmail.com.cn。

R587.1

B

1006-3250(2017)08-1074-04

2017-01-10