消疹止癢噴劑治療EGFRI相關性皮疹的細胞學機制研究?

程宗琦，陳 琳，姚 鑫，金 奕(1. 南京中醫藥大學，南京 1003； . 蘇州大學附屬第一醫院，蘇州 15006)

【實驗研究】

消疹止癢噴劑治療EGFRI相關性皮疹的細胞學機制研究?

程宗琦1,2，陳 琳2，姚 鑫2，金 奕2
(1. 南京中醫藥大學，南京 210023； 2. 蘇州大學附屬第一醫院，蘇州 215006)

目的：探究消疹止癢噴劑對皮膚角質細胞增殖分化及巨噬細胞浸潤的影響及其作用機制。方法： MTT法觀察不同濃度消疹止癢噴劑對皮膚角質細胞HaCaT生長能力的影響；劃痕實驗(Wound healing)及Transwell實驗考查消疹止癢噴劑對HaCaT及巨噬細胞RAW264.7運動能力的影響，采用western blotting實驗考察消疹止癢噴劑對HaCaT細胞的PI3K、AKT、tPA、CD147及RAW264.7細胞中基質金屬蛋白酶MMP-2(Matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、MMP-9 蛋白表達的影響，采用RT-PCR考察消疹止癢噴劑對RAW264.7細胞的MMP-2、MMP-9 mRNA水平的影響。結果：消疹止癢噴劑可以劑量依賴性地促進HaCaT細胞的增殖，抑制其分化；Wound healing實驗和Transwell小室遷移實驗中，隨著消疹止癢噴劑濃度提高，HaCaT及巨噬細胞RAW264.7遷移數目呈遞減趨勢；隨著消疹止癢噴劑濃度的提高，HaCaT及巨噬細胞RAW264.7侵襲能力呈遞減趨勢；消疹止癢噴劑可以劑量依賴性抑制HaCaT細胞PI3K和AKT增殖蛋白表達，同時降低分化蛋白tPA和CD147的表達；此外消疹止癢噴劑可以顯著抑制RAW264.7 MMP2和MMP9的mRNA和蛋白水平表達。結論：消疹止癢噴劑促進皮膚角質細胞增殖并抑制巨噬細胞浸潤是其治療EGFRI相關性皮疹的重要機制之一。

消疹止癢噴劑；HaCaT；RAW264.7；增殖分化；遷移侵襲

表皮生長因子受體抑制劑(EGFRI)包括小分子酪氨酸激酶抑制劑(TKI)和單克隆抗體[1]。EGFRI可改善晚期NSCLC患者的生活質量及總生存率已成為不爭的事實。這類藥物基本無傳統細胞毒性藥物的骨髓抑制、心臟毒性和神經毒性等，其主要副作用為皮膚不良反應，發生率大于50%，但大部分為輕中度，嚴重者約占10%[2]。一方面皮疹的出現可能是治療獲益的信號，多項臨床研究發現，皮疹的嚴重程度與EGFRI治療療效呈正相關，皮疹患者的生存期顯著優于未出現皮疹的患者。另一方面EGFRI相關皮膚不良反應可能干擾正常治療，嚴重者甚至影響患者生活質量并導致治療中斷而影響療效[3]。因此在不改變EGFRI治療的前提下，有效控制皮膚不良反應具有重要意義。

EGFR在皮膚角質細胞增殖分化等方面起重要作用，即刺激表皮細胞生長、抑制其分化，保護細胞抵抗紫外線相關損傷，抑制炎癥并加速創面愈合，如該作用被阻斷便會導致EGFRI相關皮膚不良反應。EGF必須與EGFR結合形成二聚體，激活內源性酪氨酸蛋白激酶后，才能影響角質細胞的生長和維持[4]。酪氨酸蛋白激酶激活是細胞內信號反應的關鍵啟動因素，調節細胞的增生、分化、生存和遷移以及血管生成與轉移。EGF等配體也參與傷口愈合過程，如HB-EGF可加速角質細胞遷移，促進傷口愈合。皮膚EGFR缺失的基因工程小鼠，表現為干燥、指甲易碎和表皮變薄，且廣泛的頭發毛囊缺陷可導致頭發纖細易斷和毛囊混合性的炎癥浸潤、毛囊上皮破壞，以上反應與EGFRI引起的皮膚改變相似[2]。現代研究證實，EGFRI可抑制基底角化細胞EGFR的磷酸化，并減少Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK)的表達，從而導致皮膚正常角質細胞的生長抑制、提前分化及異常遷移，促使某些皮膚反應的發生。抑制EGFR介導的信號通路可引起生長抑制和凋亡、細胞遷移減少、細胞黏附和分化增加、炎癥反應激活，進而影響角質細胞，導致特異性的皮膚表現[5]。

目前針對EGFRI靶向藥物引發的皮膚不良反應，主要治療手段多為局部使用抗生素、類固醇激素等，但因其療效不理想、副作用大限制其臨床運用[6]，因此尋找一種合理的方法治療EGFRI相關性皮疹具有重要意義[7]。中藥是我國的瑰寶，嘗試從中藥中尋找出針對疾病靶標的創新藥物已成為當前的研究熱點。在中醫基礎理論中，分子靶向藥物所致皮膚毒性屬于“藥毒”范疇，表現為“肺熱血瘀”，用宣肺涼血祛瘀中藥可辨證論治?！跋钪拱W噴劑”為我院自制中藥制劑，由紫草、野菊花等5味中藥組成，其中紫草功能清熱涼血、解毒透疹，野菊花解毒消癰，地膚子清熱利濕止癢，側柏葉善清血熱，冰片清熱止痛，諸藥合用達清熱解毒、涼血止血、散瘀消腫之功效。前期開展的藥理實驗亦證實，其具有較好的抗炎消疹作用[8]。本研究利用皮膚角質細胞及免疫細胞在體外模擬EGFRI相關性皮疹發病機制，闡述“消疹止癢噴劑”治療EGFRI相關皮膚不良反應的分子機理，為開發“消疹止癢噴劑”成為一種安全、有效治療EGFRI相關性皮疹的復方制劑奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

DMEM(美國Gibco公司 Cat. 12101-062 Lot. 758136)，胎牛血清(Hyclone公司Cat：SH30396.02 Lot. KPF21391)，MTT(Promega公司，Lot.30502302)。消疹止癢噴劑(蘇州大學附屬第一醫院自制)，制劑原料藥購自蘇州市天靈中藥飲片有限公司，經南京中醫藥大學巢建國教授鑒定，紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.的干燥根，野菊花為菊科植物野菊ChrysanthemumindicumL.的干燥頭狀花序，側柏葉為柏科植物側柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉，側柏葉為藜科植物地膚Kochiascoparia(L.)Schrad.的干燥成熟果實，梅片為龍腦香科植物龍腦香Dryobalanops aromatica Gaertn. f.的樹干提取結晶。PI3K兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.4257)，AKT兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.4685)，MMP-2兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.87809)，MMP-9兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.13667)，tPA兔一 抗(Santa Cruz公司，Lot.sc-59721)，CD147兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.13287)及GAPDH兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.5174)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 正常肝細胞LO2、角質細胞HaCaT、巨噬細胞RAW264.7購自上海中科院，HaCaT及RAW264.7細胞于含10%胎牛血清以及1×105IU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養基中，于37 ℃、5% CO2培養箱中進行常規培養。LO2細胞于含10%胎牛血清以及1×105IU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的1640培養基中，于37 ℃、5% CO2培養箱中進行常規培養。

1.2.2 消疹止癢噴劑對LO2及HaCaT細胞增殖的檢測 LO2細胞生長至80%融合，0.25%胰蛋白酶消化，1640完全培養基重懸、計數，接種于96孔板中，5×103個細胞每孔。待細胞單層貼壁后加入消疹止癢噴劑，測試最高濃度為100 μL·mL-1, 3倍稀釋。對照組加入等體積的DMSO，每個藥物濃度設3個復孔。將培養板放回細胞培養箱，24 h后加入20 μL MTT溶液繼續在培養箱中孵育4 h。搖床避光震搖15 min，用全自動酶標儀在490 nm測定吸光度值(OD值)，結果以藥物對吸光度值表示[9-10]。抑制率=(正常組OD值-加藥組OD值)/正常組OD值。HaCaT細胞生長至80%融合，0.25%胰蛋白酶消化，DMEM完全培養基重懸、計數，接種于96孔板中，5×103個細胞每孔。待細胞單層貼壁后加入消疹止癢噴劑，使其終濃度為2 μL·mL-1、6 μL·mL-1、10 μL·mL-1。對照組加入等體積的DMSO，每個藥物濃度設3個復孔。將培養板放回細胞培養箱，分別于24、48、72 h后加入20 μL MTT溶液，繼續在培養箱中孵育4 h。搖床避光震搖15 min，用全自動酶標儀在490 nm測定吸光值(OD值)，結果以藥物的吸光度值表示。乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自碧云天公司(Lot.C0017)。新鮮配制10 mU/ml、5 mU/ml、2.5 mU/ml、1.25 mU/ml、0.65 mU/ml、0 mU/ml濃度的LDH標準品，在酶標儀上用490 nm檢測吸光度值并繪制標準曲線。對照組加入等體積的DMSO，設置2 μL·mL-1、6 μL·mL-1、8 μL·mL-1、12 μL·mL-1和16 μL·mL-1濃度孔(每組3個復孔)。將培養板放回細胞培養箱，24 h后收集每個樣本培養液離心后收集上清，用新鮮細胞培養液稀釋10倍，取50 μL加入到96孔板，加入試劑盒中LDH檢測液，在酶標儀上用490 nm檢測。通過標準曲線相應公式計算出測定樣品中LDH的酶活性，根據測定結果對不同樣品處理組的酶活性進行歸一化處理。

1.2.3 消疹止癢噴劑對HaCaT增殖相關蛋白表達的影響 取對數生長期的HaCaT細胞用0.25%胰蛋白酶消化制成1×109·mL-1細胞懸液，接種于培養皿中，每個培養皿各加入1ml細胞懸液，其余為含10%胎牛血清的DMEM培養液，共10 ml體系。細胞分組及給藥方式同上，37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h后提取蛋白，并采用BCA法測定蛋白濃度。變形后取50 μg上樣，用10%分離膠、5%濃縮膠電泳：0.02A每塊膠至溴酚藍消失，之后轉到PVDF膜上。一抗PI3K (稀釋比例1∶1000，購自Cell Signaling Technology，貨號4249)， AKT (稀釋比例1∶1000，購自Cell Signaling Technology，貨號4685)，tPA (稀釋比例1∶1000，購自Santa Cruz Biotechnology，貨號sc-59721)及CD147 (稀釋比例1∶1000，購自Cell Signaling Technology，貨號13287)，4 ℃孵育過夜后加1∶10000辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG，加入化學發光試劑，用Kodak膠卷曝光；以GAPDH (稀釋比例1∶1000，購自Cell Signaling Technology，貨號5174)作為內參作灰度分析，實驗重復3次。

1.2.4 消疹止癢噴劑對HaCaT分化相關蛋白表達的影響 用滅菌的蓋玻片，70%乙醇中浸泡后，用無菌的鑷子放置到6孔板內，然后用無菌的生理鹽水、PBS或培養液洗去殘留的乙醇。種入HaCaT細胞進行培養， 細胞分組及給藥方式同上。用碧云天免疫染色固定液(P0098)固定完畢，可以用免疫染色洗滌液(P0106)洗滌2次，每次5 min。 加入碧云天免疫染色封閉液(P0102)封閉60 min。 一抗tPA及CD147按照1∶500比例用免疫染色一抗稀釋液(P0103)稀釋一抗。按照1∶500比例用免疫熒光染色二抗稀釋液(P0108)稀釋熒光標記的二抗，室溫結合2 h。DAPI染細胞核，直接到熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 消疹止癢噴劑對HaCaT及RAW264.7細胞遷移能力的影響 準備直尺和Marker筆照射紫外線滅菌。將6孔板用封口膜封好倒置于超凈臺上，用Marker筆沿著6孔板直徑平行等距劃線用于定位。含10%FBS的DMEM培養液常規培養HaCaT或RAW264.7細胞。取對數生長期細胞、消化細胞，調整細胞密度至2×105·mL-1備用。將上述細胞懸液加入6孔板中，每孔體積2 mL，放入37 ℃、5%CO2培養箱繼續培養，觀察細胞待其呈融合狀態則可進行劃痕。按照與預先所定位橫線垂直方向，使用一個100 μL無菌槍頭進行劃痕，槍頭擺放要與六孔板垂直，保證劃痕的寬度一致。劃痕完畢后用槍緩慢吸出培養液，加入適量的PBS將細胞清洗3遍，除去細胞碎片。棄PBS，每孔加入不同濃度的消疹止癢噴劑(0 μL·mL-1、2 μL·mL-1、6 μL·mL-1、10 μL·mL-1)，每個濃度3個復孔，在劃痕的不同時間點(0 h，48 h)將6孔板置于倒置顯微鏡下拍照，觀察劃痕愈合的程度。

1.2.6 消疹止癢噴劑對HaCaT及RAW264.7細胞侵襲能力的影響 用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃風干。吸出培養板中殘余液體，每孔加入50 μl含10 g/LBSA的無血清培養液，37 ℃ 30 min,使基質膠水化再吸去剩余培養液。常規培養HaCaT及RAW264.7細胞，實驗前24 h撤血清饑餓。消化細胞用無血清的DMEM培養基重懸浮，調整細胞密度2×106·mL-1。在24孔板中加入DMEM培養基，每孔600 μL。取上述細胞懸液90 μL加入Transwell小室上室中，同時各孔加入濃度分別為20 μL·mL-1、60 μL·mL-1、100 μL·mL-1的消疹止癢噴劑藥液，體積10 μL，終濃度2 μL·mL-1、6 μL·mL-1和10 μL·mL-1，對照組加入等體積的DMSO，每個濃度3個復孔。將小室浸于24孔板的培養液中，37 ℃、5% CO2孵箱內孵育6 h，取出小室用鑷子輕輕取下濾膜，5%戊二醛4 ℃固定10 min，取出用0.1%結晶紫染液于水平搖床染色30 min，PBS漂洗3次，用棉簽擦掉膜上層未穿過的細胞置于載玻片上，200倍鏡下觀察細胞遷移情況并拍照。200倍鏡下隨機選取5個視野，計數穿膜細胞數目。

1.2.7 消疹止癢噴劑對RAW264.7細胞基質金屬蛋白酶表達的影響 取對數生長期的RAW264.7細胞用0.25%胰蛋白酶消化制成1×109·mL-1細胞懸液接種于培養皿中，每個培養皿各加入1ml細胞懸液，其余為含10%胎牛血清的DMEM培養液共10 ml體系。細胞分組及給藥方式同上，37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h后提取蛋白并采用BCA法測定蛋白濃度。變形后取50 μg上樣，用10%分離膠、5%濃縮膠電泳，即0.02A每塊膠，至溴酚藍消失，之后轉到PVDF膜上。一抗MMP-2 (1∶1000)及MMP-9 (1∶1000)，4 ℃孵育過夜后加1∶10000辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG，加入化學發光試劑。用Kodak膠卷曝光，以GAPDH為內參作灰度分析，實驗重復3次。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 消疹止癢噴劑對LO2細胞增殖的影響

MTT法檢測后統計結果顯示，消疹止癢噴劑作用24 h可以劑量依賴性地抑制LO2細胞的增殖，IC50值為10.95 μL·mL-1(結果見圖1A)。為排除消疹止癢噴劑對正常細胞毒性的作用，我們初步選用2 μL·mL-1、6 μL·mL-1和10 μL·mL-1下消疹止癢噴劑進一步開展后續研究。同時，顯微鏡下觀察濃度為2 μL·mL-1、 6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止癢噴劑對正常肝細胞LO2形態學的影響。圖1B顯示，2 μL·mL-1、6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止癢噴劑對正常肝細胞LO2的細胞形態無明顯改變。為進一步確證2 μL·mL-1、 6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止癢噴劑對LO2的細胞毒作用，選用LDH釋放實驗證實與空白對照組比較，在此3濃度下的消疹止癢噴劑無誘導LO2細胞LDH釋放增加(圖1C)。

圖1 消疹止癢噴劑對正常肺細胞LO2生長及形態的無明顯影響注：A. LO2細胞用消疹止癢噴劑干預24 h后測定其對LO2細胞的增殖抑制率；B. 不同濃度消疹止癢噴劑對LO2細胞形態學的作用(標尺100 μm)；C. 不同濃度消疹止癢噴劑對LO2細胞LDH釋放的影響

2.2 消疹止癢噴劑促進角質細胞HaCaT增殖

觀察不同濃度消疹止癢噴劑在不同時間點對HaCaT增殖的影響發現，2 μL·mL-1消疹止癢噴劑作用24 h對HaCaT細胞的細胞數目無明顯促進效應。但作用48 h及72 h h后，消疹止癢噴劑對HaCaT細胞數目有顯著促進作用。6 μL·mL-1和10 μL·mL-1的消疹止癢噴劑在24、 48 h及72 h培養條件下，能明顯誘導角質細胞HaCaT的增殖(圖2A)。PI3K-AKT信號通路作為細胞內重要信號傳導通路之一，通過影響下游多種效應分子的活化狀態, 在細胞內發揮抑制凋亡、促進增殖的關鍵作用。為初步探究消疹止癢噴劑對HaCaT的增殖核心信號通路的影響，采用免疫印跡法考察PI3K和AKT蛋白的表達情況。實驗發現，各組GAPDH的條帶亮度相近，而PI3K和AKT在消疹止癢噴劑處理細胞后，與對照組比較處理組亮度有明顯差異，可見有明顯的增強(圖2B)。

2.3 消疹止癢噴劑誘導HaCaT細胞分化

觀察不同濃度消疹止癢噴劑對HaCaT分化蛋白表達的影響，免疫印跡實驗發現2 μL·mL-1消疹止癢噴劑對HaCaT細胞分化調控蛋白tPA及CD147無明顯抑制作用。但6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止癢噴劑對HaCaT細胞分化調控蛋白tPA及CD147的表達有顯著抑制作用(圖3A)。CD147分子是一種新的低分化角質形成的細胞標志蛋白,可能抑制正常角質形成細胞和鱗狀細胞癌細胞的分化。運用細胞免疫熒光實驗進一步證實，6 μL·mL-1消疹止癢噴劑能顯著抑制HaCaT細胞CD147的表達(圖3B)。

2.4 消疹止癢噴劑抑制HaCaT細胞遷移侵襲

圖2 不同濃度消疹止癢噴劑對HaCaT細胞增殖的影響注：A. 2 μL/ml消疹止癢噴劑能輕微促進HcCaT細胞的增殖，10 μL/ml消疹止癢噴劑能明顯誘導HcCaT細胞的增殖；B. 考察消疹止癢噴劑對HcCaT細胞增殖核心蛋白PI3K及AKT蛋白表達有促進作用

圖3 不同濃度消疹止癢噴劑對HaCaT細胞分化指標蛋白的作用注：A. 免疫印跡法考察消疹止癢噴劑對HaCaT細胞分化相關蛋白tPA及CD147表達的影響(GAPDH為內參蛋白)；B. 免疫熒光實驗考察消疹止癢噴劑對HaCaT細胞分化指示蛋白tPA及CD147表達的作用(標尺50 μm)

圖4 消疹止癢噴劑對HaCaT細胞侵襲數目的影響注：A. 劃痕實驗考察消疹止癢噴劑對HaCaT細胞在體外遷移能力的影響(標尺100 μm)；B. 侵襲實驗測定消疹止癢噴劑對HaCaT細胞侵襲能力的抑制作用(標尺100 μm)

圖5 消疹止癢噴劑對RAW264.7細胞侵襲數目的影響注：A. 劃痕實驗考察消疹止癢噴劑對RAW264.7細胞在體外遷移能力的影響(標尺100 μm)；B. 侵襲實驗測定消疹止癢噴劑對RAW264.7細胞侵襲能力的抑制作用(標尺100 μm)

圖6 消疹止癢噴劑對RAW264.7細胞MMP-2和MMP-9蛋白及mRNA表達的影響注：A. 免疫印跡法評價消疹止癢噴劑對RAW264.7細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達的抑制作用；B. Realtime PCR實驗測定消疹止癢噴劑對RAW264.7細胞MMP-2和MMP-9 mRNA水平的抑制作用

觀察不同濃度消疹止癢噴劑作用于不同時間點對HaCaT細胞遷移的影響發現，隨著消疹止癢噴劑濃度的提高，細胞劃痕的愈合程度呈遞減趨勢，結果以0 h和48 h 2個時間點為例，呈現空白對照組和消疹止癢噴劑作用不同時間點HaCaT細胞的劃痕愈合情況，并在0 h和48 h測量每組HaCaT細胞顯微鏡圖像中空白間距測量間距(單位為CM)。如圖4A顯示，在消疹止癢噴劑0 μL·mL-1組0 h空白處研究發現，48 h時對照組劃痕區域的HaCaT細胞發生明顯遷移，而隨著消疹止癢噴劑濃度的增加，劃痕區域細胞愈合程度呈降低趨勢。觀察不同濃度消疹止癢噴劑對HaCaT細胞Transwell小室侵襲能力的影響發現，隨著消疹止癢噴劑濃度的提高，細胞侵襲能力呈遞減趨勢。圖4B顯示，100×顯微鏡觀察HaCaT細胞侵襲情況，對照組細胞侵襲數目較多，消疹止癢噴劑各濃度組處理24 h后，細胞侵襲數目與對照組比較呈降低趨勢，200×顯微鏡下隨機選取5個視野來計數細胞侵襲的數目，發現與對照組比較，2 μL·mL-1消疹止癢噴劑可以抑制MDA-M-231細胞侵襲(P<0.05)， 6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止癢噴劑可以顯著抑制MDA-MB-231細胞侵襲(P<0.01)。

2.5 消疹止癢噴劑抑制RAW264.7細胞遷移及侵襲

觀察不同濃度消疹止癢噴劑作用于不同時間點，對RAW264.7細胞遷移的影響發現，隨著消疹止癢噴劑濃度的提高，巨噬細胞RAW264.7細胞劃痕的愈合程度呈遞減趨勢。圖5A顯示，在劃痕后48 h時，對照組劃痕區域的RAW264.7細胞發生明顯遷移，而隨著消疹止癢噴劑濃度的增加，劃痕區域RAW264.7細胞的愈合程度呈降低趨勢。與遷移結果一致，消疹止癢噴劑對細胞的影響發現，隨著消疹止癢噴劑濃度的提高，RAW264.7細胞穿過Transwell小室的侵襲能力呈遞減趨勢。圖5B顯示，對照組細胞侵襲數目較多，消疹止癢噴劑在2 μL·mL-1時可以抑制RAW264.7細胞的侵襲(P<0.05)，在6 μL·mL-1和10 μL·mL-1時可以顯著抑制RAW264.7細胞侵襲(P<0.01)。

2.6 消疹止癢噴劑對RAW264.7細胞MMP-2/9蛋白表達及轉錄水平的影響

圖6A顯示，Western blotting結果顯示，消疹止癢噴劑作用24 h后可以在一定程度上劑量依賴性地抑制RAW264.7細胞中MMP-2/9的蛋白表達。與對照組比較，消疹止癢噴劑顯著抑制MMP-2、MMP-9 的mRNA表達。Realtime PCR的結果采用ddCT法進行計算后，圖6B顯示RAW264.7細胞培養24 h后，MMP-2、MMP-9在消疹止癢噴劑2 μL·mL-1時較對照組(消疹止癢噴劑0 μL·mL-1)的表達量有較弱降低，約為對照組表達量的3/4；MMP-2、MMP-9在消疹止癢噴劑6 μL·mL-1時，較對照組(消疹止癢噴劑0 μL·mL-1)其表達量顯著降低，約為對照組表達量的1/2；MMP-2、MMP-9在消疹止癢噴劑10 μL·mL-1時，較對照組其表達量顯著降低，約為對照組表達量的1/4。

3 討論

3.1 眾所周知，腫瘤已成為人類健康的最大殺手，人類一直不遺余力地尋找治療腫瘤的最佳方法。隨著腫瘤分子生物學研究的進展，對靶向藥物的研究逐漸成為腫瘤治療領域的主要突破點，受到醫學界的普遍重視。越來越多的抗腫瘤分子靶向藥物被應用于臨床而發揮良好的療效，在眾多的靶向藥物當中，表皮生長因子受體抑制劑(EGFRI)目前應用最為廣泛[9]。EGFRIs已經證明，可改善非小細胞肺癌、胰腺癌、大腸癌患者的總生存期，靶向藥物耐受性好，通常出現輕微或中度的毒副反應。盡管大多數不良反應是可以得到迅速處理的，但是嚴重甚至危及生命的不良反應仍能夠發生，其中最常見的是皮膚不良反應[10]。通過皮膚活檢的方法，研究吉非替尼治療前和治療過程中的皮膚變化，發現治療前和治療中表皮厚度比較差異無統計學意義，但治療后顆粒層變薄且部分中斷。另外，治療后患者的嗜酸性粒細胞角質層變薄，伴有散在的角化不全灶，且該層正常的網紋型特征消失。研究者還在某些標本中發現，苔蘚樣組織反應發生在毛囊和毛囊間的皮膚，中性粒細胞毛囊炎、角蛋白栓以及漏斗擴大微生物沉積也有報告[11]。組織活檢發現，真皮淺層周圍的混合性炎癥浸潤(特別是濾泡周圍)、濾泡破裂以及表皮皮膚棘層松解。顯微鏡下觀察痤瘡樣皮疹病灶發現，有中性粒細胞浸潤的毛囊炎和毛囊周圍炎，其他研究亦獲同樣的結論。同時發現角質細胞增殖標志物PI3K和AKT表達顯著減少。角質細胞是EGFRI介導皮膚毒性的作用靶點，實驗研究表明，EGFRI對皮膚黑色素細胞和成纖維細胞均無作用，而EGFRI作用于增殖的未分化角質細胞，促進終末分化標記如tPA、CD147的表達[12]。

為盡量排除和減少藥物導致細胞凋亡和增殖抑制作用對實驗結果的影響，選用濃度范圍在(2 μL·mL-1～10 μL·mL-1)的消疹止癢噴劑作為研究對象，主要的目的是觀察其對角質細胞的增殖、分化及遷移侵襲能力的影響。本研究通過MTT試驗發現，消疹止癢噴劑可以劑量依賴性地促進角質細胞的生長數目。通過劃痕愈合試驗和Transwell小室侵襲試驗發現，消疹止癢噴劑可以抑制角質細胞運動遷移以及侵襲能力，通過Western blot技術觀測消疹止癢噴劑對角質細胞增殖分化相關因子的蛋白表達水平。實驗結果表明，角質細胞中的PI3K和AKT在加入不同濃度的消疹止癢噴劑處理后，其蛋白表達顯著上調，同時消疹止癢噴劑可以抑制角質細胞中分化調控蛋白tPA及CD147的表達。

有研究證實，EGFRI通過增加在基底層的細胞周期依賴性激酶抑制劑P27、角蛋白-1、信號轉換和轉錄激活因子3的表達，引起基底角質細胞生長停滯和過早成熟分化，同時伴有炎性巨噬細胞的浸潤。為進一步探究消疹止癢噴劑在體外是否能抑制巨噬細胞RAW264.7細胞遷移侵襲過程，以及是否是通過降低MMP-2/9的表達進而抑制遷移侵襲，分別采用劃痕愈合實驗、Tranwell侵襲實驗及免疫印跡實驗開展相關研究。結果發現，消疹止癢噴劑能抑制RAW264.7細胞MMP-2/9蛋白的表達，同時對MMP-2/9的mRNA水平表達亦有顯著降低效應。但需要注意的是，本實驗所涉及的細胞模型均采用的是正常狀態下的細胞，為進一步真實還原病理狀態下的細胞模型，本課題組考慮今后選用被EGFRI類藥物刺激狀態下的角質細胞和巨噬細胞作為細胞模型。此外，EGFRI類藥物是針對EGFR基因突變研究出的分子靶向藥物，我們通過對相關基因的敲除建立裸鼠模型，比較研究“消疹止癢噴劑”對EGFRI相關性皮疹的作用機制。

3.2 隨著EGFRI類藥物的廣泛應用，其不良反應問題愈加突出，尤以皮疹發生率最高，對EGFRI相關性皮疹的治療也迫在眉睫。目前最常用的方法包括局部使用抗生素、類固醇激素或口服抗生素、免疫調節劑等。但由于抗生素存在耐藥性、類固醇激素易誘發潰瘍病等弊端，其臨床應用受到極大限制[13]。眾多研究者更有興趣從中醫藥中尋找安全、有效的藥物，以改善治療EGFRI相關性皮疹[14]。“消疹止癢噴劑”為我院自制外用中藥制劑，含紫草、野菊花等5味中藥，多年的臨床試驗證實該制劑可有效治療EGFRI相關性皮疹，且未見明顯不良反應。本文通過研究該制劑對角質細胞和炎性巨噬細胞的作用，從微觀角度闡明該制劑治療EGFRI相關性皮疹的作用機理。目前，在靶向藥物相關皮疹的預防和治療方面，中西醫尚無統一的治療標準。本課題組前期對消疹止癢噴劑進行了動物實驗和臨床試驗，結合本次細胞實驗，系統地研究了該制劑對此類藥疹的藥理作用及機制，顯示了中醫藥在治療靶向藥物相關皮疹方面具有的獨特優勢，值得臨床推廣使用并深入分析。此外，中西藥治療各有優缺點，對西藥治療引起的副作用輔以中藥治療，也為中西醫如何有機結合實現高效低毒提供了參考。

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?基金項目：國家自然科學基金資助項目(81460759)-蒙藥十三味紅花密訣丸治療過敏性鼻炎的實驗機制研究

Study on the Cytological Mechanism of the Treatment of EGFRI Associated Eruption with Xiao Zhen and Antipruritic Spray

CHENG Zong-qi1,2,CHEN Lin2, YAO Xin2, JIN Yi2
(1.NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023，China; 2.FirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215006，China)

Objective: To explore the effect of Xiaozhen Zhiyang Spray on keratinocyte proliferation and differentiation and the effect on macrophage infiltration.Methods:MTT method was used to observe the different concentrations of Xiaozhen Zhiyang spray on skin keratinocytes HaCaT growth effect; Wound healing and Transwell experiment was used to examine the effect of Xiaozhen Zhiyang Spray on HaCaT and macrophage RAW264.7 exercise ability; Western blotting experiment was used to investigate the effect of Xiaozhen Zhiyang Spray on the proteinic expression of PI3K, AKT, tPA and CD147 in HaCaT cells and MMP-2, MMP-9 in RAW264.7 cells. RT-PCR was used to investigate the effects of Xiaozhen Zhiyang spray on MMP-2 and MMP-9 mRNA levels in RAW264.7 cells. Results: Xiaozhen Zhiyang Spray can dose dependently promote the proliferation of HaCaT cells and inhibit its differentiation.In wound healing and transwell experiment, the migration number and invasive ability of HaCaT and macrophage RAW264.7 decreased with Xiaozhen Zhiyang Spray concentration increased. Xiaozhen Zhiyang Spray can also dose dependently inhibit the expression of proliferation protein PI3K and AKT, and decrease the expression of differentiation protein tPA and CD147. In addition, Xiaozhen Zhiyang spray can significantly inhibit the mRNA and protein expression of MMP2 and MMP9 in RAW264.7. Conclusion: Xiaozhen Zhiyang spray can promote keratinocyte proliferation and reduce the infiltration of macrophage,which is one of the important mechanisms for the treatment of EGFRI associated skin rashes.

Xiaozhen Zhiyang Spray; HaCaT; RAW264.7; Proliferation and differentiation; Migration and invasion

2015年度江蘇省中醫藥科技項目(YB2015175)-基于EGFR信號通路研究“消疹止癢噴劑”對EGFRI相關性皮疹的作用機制；蘇州市2014年度科技發展計劃(SYSD2014144)-消疹止癢噴劑治療腫瘤患者靶向藥物治療相關性皮疹的臨床療效及其機制研究

程宗琦，男，主任藥師，從事中藥藥劑學與藥事管理研究。

R751

B

1006-3250(2017)08-1078-07

2017-02-18