針刺對端粒酶敲除小鼠大腦海馬區、皮質區Trk-B信號調節激酶表達的影響?

林麗莉，莊婉玉，陳慧娥，吳 強，林 棟(福建中醫藥大學針灸學院， 福州 350122)

【針灸研究】

針刺對端粒酶敲除小鼠大腦海馬區、皮質區Trk-B信號調節激酶表達的影響?

林麗莉，莊婉玉，陳慧娥，吳 強，林 棟△
(福建中醫藥大學針灸學院， 福州 350122)

目的：探討臨床常用的不同針刺方法，手針、電針干預對端粒酶敲除小鼠大腦海馬區、皮質區Trk-B信號調節激酶表達的影響。方法：端粒酶敲除小鼠按隨機數字表法分為手針組、電針組、空白對照組各6只。電針組使用一對華佗牌不銹鋼針具(0.3 mm×0.25 mm)對雙側足三里進行針刺干預，交替頻率，強度0.5～1.2 mA，幅度2/100 HZ，每日30 min，連續干預7 d。 手針組使用華佗牌不銹鋼針具(0.3 mm×0.25 mm)對雙側足三里進行針刺干預，每5 min捻轉1次，每次30 min，空白對照組不做任何干預。采用Western blot 法檢測大腦海馬和皮質區域Trk-B的表達情況。結果：手針組小鼠在干預后自主活動程度較空白組均有所增加，海馬區電針組與空白組對照組比較Trk-B表達明顯增高；手針組與空白對照組比較Trk-B表達明顯增高；但在皮質區電針組與手針組比較Trk-B表達明顯降低；電針組與空白對照組比較表達明顯降低。結論：電針對不同腦區Trk-B表達的影響不同，電針可促進海馬區Trk-B的表達，相同的穴位刺激電針和手針的作用機制不同，可能與酪氨酸B(Trk-B)信號調節激酶表達有關。

電針；手針；酪氨酸B(Trk-B)；端粒酶敲除小鼠

近年來，對于端粒和端粒酶的研究表明，端粒酶在大腦神經前體細胞發育過程中存在著高表達，且在保護神經干細胞和神經祖細胞特性中發揮著至關重要的作用。端粒酶基因敲除小鼠正逐步成為目前人類研究衰老機制的一類重要模型。傳統醫學認為，衰老不是一種疾病，是每個人生命中必然發生且無法避免的正常生理現象。“老”是一個必然經歷的生命階段，“衰”是伴隨“老”而出現的各種虛損不足的生命狀態。“老而且衰”是必然經歷的生命狀態，而“老而不衰”則是中醫養生的目標和追求[1-2]。針灸是中醫用于防病治病、抗老防衰、延年益壽、養生保健的重要措施。現代臨床觀察也表明，針刺在延緩腦衰老、改善腦功能、減輕癡呆r癥狀方面的確有明顯的效果[3]。本研究通過探討不同針刺方式對端粒酶敲除小鼠大腦海馬區、皮質區酪氨酸蛋白激酶受體B(Tyrosine receptor kinase B，TrkB)表達的影響，探討針刺延緩神經系統衰老的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究使用的端粒酶基因敲除小鼠(telomerase-deficient，Terc-/-)由美國Jackson Laboratory引進(Stock#004132)，該模型動物是通過采用新霉素片段替換野生型C57BL/6J小鼠3號染色體的端粒酶基因，從而導致該類小鼠的端粒酶表達缺失(https:∥www.jax.org/strain/023535)。該動物由上海茂生衍生物科技有限公司代理引進(貨號MS13-127)，并于福建中醫藥大學動物實驗研究中心SPF級轉基因動物室進行保種、育種。本研究選用SPF級第4代端粒酶基因敲除(Generation 4 Terc-/-)小鼠，待第4代小鼠3～4周齡時采用PCR法進行基因型鑒定。

1.2 動物分組及干預

根據基因鑒定結果選用純合子Terc-/-小鼠共18只，按隨機數字表法分為手針組、電針組及空白對照組各6只。電針組使用一對華佗牌不銹鋼針(0.3 mm×0.25 mm)對雙側足三里進行針刺干預，交替頻率強度0.5～1.2 mA，頻率2/100 Hz，每日30 min，連續干預7 d。手針組使用華佗牌不銹鋼針(0.3 mm×0.25 mm)對雙側足三里進行針刺干預，每5 min捻轉1次，每次30 min。空白對照組不做任何干預。小鼠穴位定位參照《實驗針灸學》中“常用實驗動物針灸穴位圖”。在第7天干預結束后進行取材，在小鼠麻醉后將小鼠斷頭暴露腦組織，取左右皮質及海馬組織浸于無菌0.01 mol/L的PBS(預冷)中沖洗血漬，后將組織置于-80℃冰箱用于Western blot蛋白檢測。

1.3 自主活動實驗

采用小鼠自主活動測試儀(中國醫學科學院藥物研究所制造)分析受試小鼠的自主活動程度，由微電腦自動記錄小鼠在實驗過程中的活動次數，測試時間10 min，測試結束后記錄小鼠的活動次數，每天于固定時間測試1次，連續2 d。

1.4 Western blot檢測皮質區海馬區Trk-B含量

腦組織蛋白提取及測定：將腦組織從-80℃冰箱取出稱重,取100 mg 組織加500 μL 組織裂解液(普利萊基因有限公司提供)勻漿后，以12000 r/min 速度在4 ℃離心15 min，取上清液用于蛋白定量檢測(BCA 蛋白定量檢測試劑盒由普利萊基因有限公司提供);SDS-聚炳烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE): 從上述提取的樣品中取出20 μg總蛋白，用10% SDS-PAGE 在4 ℃、20 mA 條件下進行電泳。電泳結束后，在4 ℃、400 mA 條件下將蛋白質從SDS-PAGE 轉到硝酸纖維素膜上;抗體免疫反應: 按產品使用說明書使用一抗Trk-B、β-actin (購自美國Thermo Fisher Scientific)及二抗(購自美國Santa Cruz Biotechnology)，一抗按合適比例稀釋后加入硝酸纖維素膜中并覆蓋膜的全部，4 ℃放置12 h以上；PBS清洗后加入二抗平穩搖動，室溫2 h；化學發光顯影及凝膠圖像分析: 將顯影和定影好的膠片進行掃描,目的條帶采用Bio-Rad圖像分析軟件進行光密度積分值分析，以β-actin為內參，各蛋白與β-actin光密度積分值的比值作為蛋白表達含量。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠的自主活動實驗結果

圖1顯示，手針組及電針組的小鼠在干預后自主活動程度較空白組均有所增加，且手針組與空白組比較差異有統計學意義(P<0.05)，但手針組與電針之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 各組小鼠自主活動能力比較

2.2 各組小鼠皮質區Trk-B蛋白表達結果

圖2顯示，在皮質區手針組與電針組Trk-B表達存在差異，且差異有統計學意義(P<0.05)；電針組與空白對照組比較，Trk-B表達減少，差異有統計學意義(P<0.05)；手針組與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 各組小鼠海馬區Trk-B蛋白表達結果

圖3顯示，在海馬區手針組與空白對照組比較，Trk-B表達增加，且差異有統計學意義(P<0.05)；電針組與空白對照組比較，Trk-B表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)；手針組與電針組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖3 各組小鼠海馬區Trk-B蛋白表達結果

3 討論

3.1 端粒酶基因敲除小鼠神經系統衰老特點

隨著端粒和端粒酶與衰老的相關研究不斷深入，衰老的端粒相關學說逐漸成為研究熱點。近年來，Terc-/-小鼠在衰老研究領域的應用也逐漸增多。Terc-/-小鼠是通過采用新霉素片段替換野生型C57BL/6J小鼠3號染色體的端粒酶基因組分，從而導致該類小鼠的端粒酶表達缺失，其后代均表現出以約3～5 kb/代速率進行性端粒縮短和末端融合的增加，當端粒低于臨界長度會導致小鼠端粒功能紊亂[4-5]，進而表現出全身性多系統自然衰老征象，它們的皮膚、大腦、內臟和其他器官均發生老化，出現嗅覺衰退、不育、腸部和脾臟受損等疾病。 Terc-/-小鼠目前已廣泛應用于腫瘤學、血液學、免疫學、生殖醫學等各個領域的醫學研究，近年來陸續將Terc-/-小鼠應用于神經系統退行性病變的相關研究[6-7]。有研究發現[8-12]，Terc-/-小鼠在中樞神經系統的衰老主要表現為腦部縮小、大腦早衰，海馬區腦源性神經營養因子(BDNF, brain derived neurotrophic factor)表達低于正常，且易引起阿爾茨海默癥、帕金森病等腦部衰老性疾病。筆者所在團隊前期研究發現[13]，Terc-/-小鼠的行為學特點與正常小鼠比較，出現了增齡性的快速衰老現象。本研究結果表明，電針及手針均能改善端粒酶基因敲除小鼠的自主活動能力，但電針與手針比較差異無統計學意義。因此，Terc-/-小鼠的衰老特點與年齡密切相關，在外在體征、學習記憶能力及自主活動等行為學方面有增齡性的快速衰老現象。

3.2 電針與不同腦區Trk-B的表達

Trk-B即酪氨酸激酶B(Tyrosine kinase B，Trk-B)是由酪氨酸激酶原癌基因編碼的一種神經營養素家族(Neurotrophins，NTFs)高親和力受體。Trk-B作為BDNF高親和力的功能性受體，通過與BDNF結合而啟動細胞內信號傳導途徑，激活細胞內絲裂原激活蛋白激酶/細胞外信號調節激酶(mitogen-activitedporteinkinase/extraccllularsigna-lrelatedkinase，MAPK/ERK)、磷脂酶Cr(phospholipase-Cgamma，PLCr)和磷酷酞肌醇3激酶(phosphatidylinosito-l3-kinase，PI3k)等下游信號通路，發揮廣泛的神經營養和神經保護作用，在神經凋亡和分子調控、神經損傷和再生、神經元的可塑性及神經退行性疾病治療方面發揮了重要作用。國內外大量研究已證實，BDNF和Trk-B相互結合對阿爾茨海默癥、帕金森病及其他神經退行性疾病所致的神經損傷具有明確的神經修復和再生的治療作用，二者在神經疾病方面的治療有著廣闊的應用前景。Trk-B與BDNF是所有神經營養因子中惟一一對在時間和空間上協同表達的受體配體復合體，兩者廣泛分布于中樞神經系統，尤以大腦皮質及海馬區域含量最高。有研究表明，隨著機體的不斷衰老，BDNF及其受體Trk-B在中樞神經系統退行性病變中，其mRNA表達明顯下降[15]，且Trk-B的mRNA表達降低比BDNF含量降低更普遍，而中樞神經系統神經元Trk-B的mRNA表達量改變會影響其神經元的形態和功能改變，BDNF生物學功能的發揮，必須與其受體Trk-B結合才能實現，若阻斷其信號傳導通路，則BDNF不能發揮其生物學功能[16]。因此，Trk-B表達量對BDNF生物學功能的發揮，神經系統退行性疾病的治療至關重要。

近年來大量臨床實驗研究表明，針刺可調節腦循環，改善局部血流供應，調整神經細胞電生理活動、生化反應機制和基因表達來保護神經細胞免受細胞毒的損害，保護腦組織，減輕腦損傷，增強神經網絡的內部代償，從而改善神經功能、延緩腦衰老、改善腦功能、減輕癡呆癥狀等。筆者所在團隊前期研究已證實[6]，針刺可通過調節BDNF信號傳導通路相關蛋白起到神經保護，改善神經系統退行性疾病所致的神經損傷。本研究結果表明，電針對皮質區Trk-B的表達起抑制作用，而對海馬區Trk-B的表達起促進作用，提示電針在不同腦區對Trk-B表達的影響不同；海馬作為學習記憶的關鍵部位是最易受衰老影響的腦區[17]，是一系列以進行性記憶力和認知功能減退等為主癥的中樞神經系統退行性疾病的好發部位。本研究結果提示，電針可能是通過促進海馬區Trk-B的表達發揮神經保護的生物學效應。

3.3 不同針刺方式對Trk-B表達的影響

傳統針刺即手針是在刺入身體后施以提插、捻轉等手法達到治療效果的，是屬于機械性刺激。電針相比手針，被認為不僅有針刺作用還有電流刺激作用。近年來的研究表明[18]，傳統手針和電針對機體作用存在差異，在神經傳導通路、對神經遞質及免疫分子的影響等諸方面都存在差異。有研究發現[19-21]，手針和電針足三里穴對大腦產生不同效應，手針引起腦中大范圍的激活，而電針則引起腦中大范圍負激活，且手針和電針激活的腦區明顯不同，表明手針和電針可能有著不同的調節機制。在臨床研究中發現[26]，電針對痛癥及神經損傷的治療有優勢，而手針在對免疫分子的調節方面存在優勢。

本研究結果表明，手針和電針均可促進海馬區Trk-B的表達，但在皮質區電針對Trk-B的表達起抑制作用較之手針更為突出，二者間的作用差異提示，手針與電針對中樞神經系統可能存在不同的作用機制。

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Expression of Trk-b Signal Pathway in Hippocampus and Cortex of Telomerase Knockout Mice by Acupuncture

LIN Li-li, ZHUANG Wan-yu, CHEN Hui-e, WU Qiang, LIN Dong△
(CollegeofAcupuncture,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China)

Objective: To investigate the acupuncture and electric acupuncture intervention that the different acupuncture method in the clinical commonly used, have expression influence on B (Trk - B) signal conditioning tyrosine kinases of the hippocampus region and cortex region in telomerase-deficient (Terc-/-) mice brain. Methods: A total of twenty-four (Terc-/-) mice were randomly assigned to acupuncture group, electric acupuncture group and control group. In the electric acupuncture group, used a pair of hua tuo brand eletroacupunture apparatus (0.3 mm×0.25 mm) acupuncture at the stomach 36 (ST-36) position, the eletroacupunture apparatus were connected with alternation of frequency and intensity of 0.5～1.2 mA, 2/100 HZ, for 30 min/d for 7d. in the acupuncture group, used a pair of hua tuo brand stainless steel needles (0.3 mm × 0.25 mm)acupuncture at the stomach 36 (ST-36) position, once every five minutes twisting for 30 min/d for 7d. the control group was used in reared under the same conditions without any intervention. Then for Western blot method on the Trk - B expression in the hippocampus region and cortex region. Results：In the hippocampus region, compared with the control group, the electric acupuncture group and the acupuncture group were increased significantly in the Trk - B expression; However, in the cortex region, compared with the electric acupuncture group, the acupuncture group and the control group were decreased significantly in the Trk - B expression. Conclusion: The electric acupuncture intervention has different influence on the expression of Trk - B in the different brain regions, and it can promote the expression of the hippocampus Trk - B; There are different mechanisms in the acupuncture and the electric acupuncture intervention when we acupuncture the same acupoint, it may be related to the expression of Trk - B signal conditioning tyrosine kinases.

Electric acupuncture; Acupuncture; Trk B; Telomerase deficient(Terc-/-) mice

福建省自然科學基金資助項目(2017J01540)-基于端粒酶活性相關的針刺抗衰老效應對Terc-/-小鼠海馬神經元保護作用研究；福建省資助省屬高校科研專項JK類(JK2016018/JAT160221)-自發熱溫灸針對慢性神經痛模型大鼠脊髓疼痛調控時效特征的研究

R245.9+7

B

1006-3250(2017)08-1129-03

2017-01-11

△通訊作者：林 棟(1977-)，男，副教授，E-mail：bluelike1@sina.com。