亞麻醉、鎮(zhèn)靜及麻醉劑量丙泊酚對高脂血癥大鼠空間記憶及海馬組織的影響

李繁，黎仕煥，黃奕弟

（1.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 麻醉科，海南 海口 571100；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院解剖教研室，海南 海口 570102）

亞麻醉、鎮(zhèn)靜及麻醉劑量丙泊酚對高脂血癥大鼠空間記憶及海馬組織的影響

李繁1，黎仕煥1，黃奕弟2

（1.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 麻醉科，海南 海口 571100；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院解剖教研室，海南 海口 570102）

目的探討亞麻醉、鎮(zhèn)靜及麻醉劑量丙泊酚對高脂血癥大鼠的空間記憶及海馬組織的影響。方法65只健康成年雄性SD大鼠隨機分為基礎(chǔ)性喂養(yǎng)組（15只）和高脂飼料喂養(yǎng)組（50只），喂養(yǎng)6周后隨即抽取10只測定血脂。將復(fù)制模型成功的40只大鼠隨機分為4組：A組腹腔注射生理鹽水75 mg/kg；B、C、D組分別腹腔注射亞麻醉（10 mg/kg）、鎮(zhèn)靜（30 mg/kg）及麻醉劑量（375 mg/kg）丙泊酚（濃度為1%），連續(xù)給藥 5 d，給藥后20 min以及第6～7天均進行Morris水迷宮訓(xùn)練，測定空間記憶能力；給藥后第8天，斷頭取腦，獲得海馬組織，測定其中Tau蛋白磷酸化水平、Caspase-3表達水平和γ氨基丁酸（GABA）水平。結(jié)果隨著給藥和訓(xùn)練天數(shù)增加，4組大鼠的逃避潛伏期縮短（P＜0.05）；C組和D組大鼠不同時間點的逃避潛伏期高于A組和B組（P＜0.05），且D組高于C組（P＜0.05）；第7天空間搜索實驗時，C組和D組大鼠穿越平臺次數(shù)低于A組和B組（P＜0.05），且D組低于C組（P＜0.05）；C組和D組大鼠海馬組織中GABA含量、陽性細胞平均光密度值高于A組和B組（P＜0.05），且D組高于C組（P＜0.05）。結(jié)論鎮(zhèn)靜和麻醉劑量的丙泊酚會降低高脂血癥大鼠的空間記憶能力，可能與海馬組織中GABA的高水平和Tau蛋白過度磷酸化有關(guān)。

丙泊酚；高脂血癥；空間記憶；海馬組織

麻醉是減輕高脂血癥患者手術(shù)疼痛重要手段[1]。然而，30%～50%的患者麻醉蘇醒后出現(xiàn)認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD），臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能減退（13.6%）、執(zhí)行能力下降（8.4%）以及兩者皆有（2.9%）[2]，因此，研究麻醉藥物的作用機制，闡明其對高脂血癥患者空間記憶能力和海馬組織的影響，對于高脂血癥手術(shù)患者臨床麻醉具有重要意義。丙泊酚[3]是常用的麻醉藥物，起效快、作用時間短，副作用少。鎮(zhèn)靜和麻醉劑量的丙泊酚均會損傷高脂血癥大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，但其機制研究報道較少[4]。本研究分別給高脂血癥大鼠腹腔注射亞麻醉、鎮(zhèn)靜和麻醉劑量的丙泊酚，觀察其對高脂血癥大鼠的空間記憶及海馬組織的影響，以期為丙泊酚臨床應(yīng)用劑量選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型復(fù)制

65只健康成年雄性SD大鼠（南京江寧青龍山動物繁殖廠提供），體重（208±18.4）g。所有大鼠復(fù)制模型前適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，隨后依據(jù)隨機數(shù)字表法分為2組：基礎(chǔ)性喂養(yǎng)組（15只）和高脂飼料喂養(yǎng)組（50只），前者喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，后者喂養(yǎng)高脂飼料，喂養(yǎng)6周。高脂飼料配方如下：基礎(chǔ)飼料78.3%，豬油10%，蛋黃粉5%，蔗糖5%，膽固醇（上海如吉有限公司）1%，脫氧膽酸鈉0.5%，丙基硫氧嘧啶0.2%。待喂養(yǎng)6周后，分別隨機抽取10只大鼠，尾靜脈采血，全自動生化儀（日本Olympus公司）測定血脂，以高脂飼料喂養(yǎng)組血清膽固醇量高于基礎(chǔ)性喂養(yǎng)組（P＜0.05）視為復(fù)制模型成功[5]。測定結(jié)果表明，高脂飼料喂養(yǎng)組血清膽固醇量（4.72±0.41）mmol/L高于基礎(chǔ)性喂養(yǎng)組（2.70±0.24）mmol/L（P ＜0.05），復(fù)制模型成功。

1.2 分組方法及給藥方案

將剩余高脂飼料喂養(yǎng)組40只大鼠隨機分為4組，每組10只：A組為對照組，腹腔注射生理鹽水75 mg/kg；B組為亞麻醉劑量組，腹腔注射10 mg/kg丙泊酚（1%，阿斯利康）；C組為鎮(zhèn)靜劑量組，腹腔注射30 mg/kg丙泊酚；D組為麻醉劑量組，腹腔注射75 mg/kg丙泊酚。所有大鼠在1～5 d的Morris水迷宮（上海移數(shù)有限公司）訓(xùn)練前20 min注射，6～7 d不注射。D組大鼠翻正反射恢復(fù)后20 min開始訓(xùn)練。

1.3 觀察指標

1.3.1 空間記憶能力測試 采用Morris水迷宮檢測[6]，主要包括航行定位能力和空間搜索能力。1～5 d進行定位航行實驗，即從離平臺最遠的第一象限，將大鼠背對著平臺置于水中，記錄大鼠找到平臺的時間，若超過120 s，則記為120 s；第6天進行定位航行附加實驗，即將入水點改為平臺毗鄰的左側(cè)象限，其余操作同定位航行實驗，記錄時間；第7天進行空間搜索實驗，撤掉平臺，記錄大鼠在120 s內(nèi)穿過平臺的次數(shù)。

1.3.2 海馬組織 在第8天時，大鼠心臟灌注，斷頭取腦，取出海馬組織，制備成標本，部分采用尼氏染色，觀察海馬組織神經(jīng)元和椎體細胞狀況；同時，取剩余組織，采用免疫組織化學(xué)染色的方法測定海馬神經(jīng)元Tau蛋白磷酸化水平和Caspase-3表達水平，并測定其中γ氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）水平。GABA測定方法為：取海馬組織置于5 ml容量瓶中，加入2 ml水，渦旋，超聲25 min，加入1 ml磺基水楊酸（4%），加水定容，離心5000r/min，5 min，取上清液，0.45μm濾膜過濾，L-8800型氨基酸自動分析儀測定（日本Hitachi有限公司）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間計量資料比較及重復(fù)測定計量資料比較采用方差分析，在方差分析的基礎(chǔ)上采用SNK-q檢驗進行兩兩比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量丙泊酚對大鼠航行能力的影響

隨著給藥和訓(xùn)練天數(shù)增加，4組大鼠的逃避潛伏期經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（見表1）；C組和D組大鼠同一時間點的逃避潛伏期與A組和B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（C組和A組比較，C組和B組比較，D組和A組比較，D組和B組比較，均P=0.000），且D組大鼠同一時間點的逃避潛伏期與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P=0.000）。見圖1。

2.2 不同劑量丙泊酚對大鼠空間搜索能力的影響

第7天空間搜索實驗時，C組和D組大鼠穿越平臺次數(shù)與A組和B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（C組和 A組比較，q=9.730，P=0.000；C組和 B組比較，q=6.325，P=0.000；D 組和 A 組比較，q=17.028，P=0.000；D 組和 B 組比較，q=13.622，P=0.000），D組大鼠穿越平臺次數(shù)與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q=7.298，P=0.000）。見圖 2。

表1 不同劑量丙泊酚對大鼠航行能力的影響 （n=10，±s）

表1 不同劑量丙泊酚對大鼠航行能力的影響 （n=10，±s）

組別P值A(chǔ) 組 78.3±5.1 69.4±7.1 45.1±3.9 26.0±2.8 20.9±2.6 15.9±1.9 377.821 0.000 B 組 79.1±6.0 71.0±6.2 45.9±4.0 25.8±3.2 23.1±2.0 20.1±2.9 350.558 0.000 C 組 91.6±4.0 81.0±4.3 65.9±5.1 43.7±7.1 33.8±2.5 28.1±3.2 325.107 0.000 D 組 103.5±10.6 91.7±6.7 83.1±4.3 63.2±10.7 54.3±5.3 48.9±5.0 83.922 0.000第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天F值

2.3 海馬組織尼氏染色結(jié)果比較

4組大鼠CA1區(qū)海馬錐體細胞層和顆粒細胞層均為帶狀分布，尼氏小體體積大，數(shù)量多，排列緊湊，無細胞缺失，顏色較深。見圖3。

2.4 海馬組織中C aspase-3表達和G ABA含量比較

C組和D組大鼠海馬組織中GABA含量與A組和B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（C組和A組比較，q=8.744，P=0.000；C 組和 B 組比較，q=7.693，P=0.000；D 組和 A 組比較，q=14.411，P=0.000；D組和 B 組比較，q=13.360，P=0.000），D 組大鼠海馬組織中GABA含量與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q=5.667，P=0.000）。見圖 4。

2.5 海馬組織中Tau磷酸化比較

C 組（32.4±3.8）和 D 組（40.5±2.4）大鼠海馬CA3區(qū)陽性細胞平均光密度值與A組（18.0±2.3）和B組（20.3±2.1）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（C組與A組比較，q=16.665，P=0.000；C組與B組比較，q=13.995，P=0.000；D 組與 A 組比較，q=26.024，P=0.000；D 組與 B 組比較，q=23.364，P=0.000），且 D組大鼠平均光密度值與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q=9.369，P=0.000）。見圖 5、6。

圖1 不同劑量丙泊酚對大鼠航行能力的影響

圖2 不同劑量丙泊酚對大鼠空間搜索能力的影響

圖3 4組大鼠海馬組織尼氏染色結(jié)果 （100μm）

圖4 海馬組織中G ABA含量（A）和C aspase-3表達（B）

圖5 不同劑量丙泊酚對大鼠Tau磷酸化的影響 （×300）

圖6 不同劑量丙泊酚對大鼠Tau磷酸化的影響

3 討論

隨著醫(yī)療水平的提高，外科手術(shù)的焦點已從降低死亡率轉(zhuǎn)變?yōu)闇p少心腦血管系統(tǒng)的并發(fā)癥發(fā)生率[7]。研究表明[8]，麻醉和高血脂是引起術(shù)后大腦并發(fā)癥的高危因素，患者多表現(xiàn)為譫妄、中風(fēng)和認知功能障礙。丙泊酚是臨床常用的麻醉藥物之一，有研究表明[9]，丙泊酚麻醉患者術(shù)后常伴有不同程度的認知功能障礙，患者學(xué)習(xí)和記憶能力下降，可能與丙泊酚抑制海馬乙酰膽堿的釋放有關(guān)，但目前對于丙泊酚對認知功能影響的機制仍存爭議。

海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，而Morris水迷宮是學(xué)習(xí)和記憶研究的最佳模型，動物的逃避潛伏期與其空間信息獲取能力呈正相關(guān)；在空間搜索實驗時，穿越平臺次數(shù)越多，記憶越強。本研究中，高血脂癥大鼠丙泊酚給藥后，1～5 d進行定位航行實驗時，大鼠逃避潛伏期逐漸縮短，符合學(xué)習(xí)記憶圖的趨勢，但組間比較時，C組和D組大鼠不同時間點的逃避潛伏期高于A組和B組，D組大鼠不同時間點的逃避潛伏期高于C組，表明鎮(zhèn)靜和麻醉劑量的丙泊酚干擾了大鼠定位和尋找平臺的能力，且隨著劑量增加，這種干擾作用越強。在第6天時，C組和D組大鼠不同時間點的逃避潛伏期高于A組和B組，D組大鼠不同時間點的逃避潛伏期高于C組，表明停藥1 d時，大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力仍未恢復(fù)；第7天空間搜索實驗時，C組和D組大鼠穿越平臺次數(shù)低于A組和B組，且D組低于C組，說明C、D組大鼠空間記憶能力下降，且D組下降更為嚴重。而在整個空間記憶實驗時，A組和B組的逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異，說明單次或多次的腹腔注射亞麻醉劑量的丙泊酚均不會影響高脂血癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，與VESELIS等[10]研究一致。

目前，丙泊酚對學(xué)習(xí)記憶功能影響及其機制研究報道均以海馬研究最多。丙泊酚主要作用于突觸，通過調(diào)節(jié)突觸前膜遞質(zhì)釋放和前后膜受體的功能起到麻醉作用。在麻醉過程中，丙泊酚可改變突觸形態(tài)，從而抑制神經(jīng)沖動傳遞，使得海馬突觸致密物變薄、活性區(qū)域減少，進而降低大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力[11]。丙泊酚降低大鼠學(xué)習(xí)記憶能力可從3個方面分析：①中樞神經(jīng)系統(tǒng)Glu/GABA是調(diào)控學(xué)習(xí)記憶的重要組分，其中Glu起正性調(diào)節(jié)作用，GABA起負性調(diào)節(jié)作用，同時也是丙泊酚麻醉的作用點。對靈長類動物研究顯示[12]，GABA的作用減弱或增強均會損傷記憶功能。本研究中，C組和D組大鼠海馬組織中GABA含量高于A組和B組，且D組大鼠海馬組織中GABA含量高于C組，表明丙泊酚可通過升高GABA含量而影響大鼠認知功能，并呈劑量依賴性。②研究表明[13]，全身麻醉藥物可能引起大鼠神經(jīng)元凋亡或退行性改變，引起神經(jīng)后遺癥，如DMITRIEV等[14]發(fā)現(xiàn)60 mg/kg的丙泊酚會引起10 d幼鼠腦神經(jīng)細胞退行性改變。本研中，4組大鼠海馬組織中表達Caspase的細胞數(shù)目無統(tǒng)計學(xué)差異，HE染色顯示神經(jīng)細胞正常，可能是由于本實驗采用的成年大鼠所致。③老年斑和Tau蛋白過度磷酸化是阿爾茨海默病（AD）發(fā)病的關(guān)鍵步驟，而AD患者主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降，LUAN等[15]證實了老年斑和Tau蛋白過度磷酸化與麻醉術(shù)后認知功能障礙相關(guān)。Tau蛋白過度磷酸化會導(dǎo)致微管崩解，軸突變性，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)的合成、運輸釋放以及攝取等受到影響，導(dǎo)致神經(jīng)細胞間物質(zhì)運輸障礙從而引起神經(jīng)退行性變。張亮等[16]推測丙泊酚損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力與老年斑和Tau蛋白過度磷酸化有關(guān)。本研究中，C組和D組大鼠海馬CA3區(qū)陽性細胞平均光密度值高于A組和B組，且D組大鼠平均光密度值高于C組，說明學(xué)習(xí)記憶能力于Tau蛋白過度磷酸化密切相關(guān)，但這種相關(guān)性還有待于進一步研究。

總之，單次或多次的腹腔注射亞麻醉劑量的丙泊酚均不會影響高脂血癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，而鎮(zhèn)靜和麻醉劑量的丙泊酚會降低高脂血癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能力，劑量越高，損傷越為嚴重，其機制可能與GABA的高水平及Tau蛋白過度磷酸化有關(guān)。

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（張蕾 編輯）

Influence of subanesthesia,sedation and anesthesia doses of Propofol on spatial memory and hippocampal tissues in rats with hyperlipidemia

Fan Li1,Shi-huan Li1,Yi-di Huang2
(1.Department of Anesthesiology,the Second Affiliated Hospital,Hainan Medical University,Haikou,Hainan 571100,China;2.Department of Anatomy,the First Affiliated Hospital,Hainan Medical University,Haikou,Hainan 570102,China)

ObjectiveTo discuss the influence of subanesthesia,sedation and anesthesia doses of Propofol on learning and memory functions,hippocampal tissues in rats with hyperlipidemia.MethodsTotally 65 healthy adult male SD rats were randomly divided into basic diet group(15 rats)and high-fat diet group(50 rats).After 6 weeks of feeding,10 rats were used for measurement of blood lipids.The 40 rats of successful model were randomly divided into 4 groups.Group A had intraperitoneal injection of saline 75 mg/kg;groups B,C and D were anesthetized by intraperitoneal injection of subanesthetic(10 mg/kg),sedation(30 mg/kg)and anesthetic(375 mg/kg)doses of 1%Propofol for 5 consecutive days.Morris water maze training was carried out and spatial memory was measured 20 min and 6-7 days after drug administration.On the 8th day after the first administration,the hippocampal tissues were obtained to measure the level of Tau protein phosphorylation,caspase-3 expression level and γ-amino butyric acid(GABA)level.ResultsWith the increase of the days of drug administration and training,the escape latency was significantly shortened in the 4 groups(P＜0.05).The escape latency in the groups C and Dat different time points was significantly longer than that in the groups A and B(P＜0.05),and the escape latency in the group D was significantly longer than that in the group C(P＜0.05).In the search space experiments on the 7th day,the platform-crossing times of the groups C and D were significantly fewer than those of the group A and B(P＜0.05),and the platform-crossing times of the group D were significantly fewer than those of the group C(P＜0.05);the GABA content of the hippocampal tissues and the average optical density of positive cells were significantly higher in the groups C and D than in the groups A and B(P＜0.05),and significantly higher in the group D than in the group C(P＜0.05).ConclusionsSedation and anesthesia doses of Propofol can reduce the spatial memory in hyperlipidemia rats,which may be associated with high levels of GABA in hippocampus and Tau protein hyperphosphorylation.

Propofol;hyperlipidemia;spatial memory;hippocampal tissue

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.006

1005-8982（2017）13-0028-05

2016-12-20

黎仕煥，E-mail：lsh1982924@163.com；Tel：13876346001