血清高遷移率族蛋白1在乙型肝炎病毒相關(guān)肝衰竭患者中的表達及其臨床意義

董瑞強，張丹鳳，孫廣榮

（鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院 1.肝膽胰腺及疝外科，2.眼科，3.腫瘤二科，河南 洛陽 471000）

血清高遷移率族蛋白1在乙型肝炎病毒相關(guān)肝衰竭患者中的表達及其臨床意義

董瑞強1，張丹鳳2，孫廣榮3

（鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院 1.肝膽胰腺及疝外科，2.眼科，3.腫瘤二科，河南 洛陽 471000）

目的探討血清高遷移率族蛋白1（HMGB1）在乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)肝衰竭患者中的表達及其臨床意義。方法選取乙型肝炎病毒相關(guān)肝衰竭患者90例，分為早期組（A組）、中期組（B組）和晚期組（C組），每組30例。30例健康查體者（D組）作為對照和30例慢性乙型肝炎患者（E組）。通過檢測各組血清肝功能相關(guān)的生物化學(xué)指標(biāo)和HMGB1水平，研究HMGB1表達水平及其臨床意義。采用獨立樣本的t檢驗和方差分析進行組間數(shù)據(jù)比較，并用多元線性回歸分析預(yù)測組間的相關(guān)性。結(jié)果血清HMGB1水平檢測結(jié)果表明：A 組、B 組、C 組和 E 組患者血清中 HMGBl均為陽性，分別為 （7.54±2.5）、（12.05±3.7）、（18.69±5.4）和（5.26±4.0）μg/L。D組血清中HMGB1均為陰性。HBV患者血清HMGBl水平高于慢性乙型肝炎患者（t=2.863，P=0.008）；晚期HBV患者血清HMGB1水平高于早期患者（t=2.178，P=0.030）；HBV患者血清HMGBl水平與AST水平呈正相關(guān)（t=0.695，P=0.005）。結(jié)論HBV相關(guān)肝衰竭患者血清HMGB1水平隨病情發(fā)展呈進行性升高，可部分預(yù)測HBV相關(guān)肝衰竭患者的預(yù)后。

血清高遷移率族蛋白；乙型肝炎病毒；肝衰竭；臨床意義

1999年，高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）首次報道，HMGB1 作為新的潛在的晚期炎癥介質(zhì)，參與了膿毒癥的發(fā)病過程，且HMGB1是內(nèi)毒素致死效應(yīng)的晚期重要炎癥介質(zhì)，此后HMGB1成為研究的熱點[1]。在我國，HBV引起的肝衰竭占所有肝衰竭的比例達75%以上，且病死率高[2-3]。但目前對于HMGB1在HBV相關(guān)肝衰竭患者中的作用機制尚未見報道，本實驗通過檢測血清肝功能相關(guān)的生物化學(xué)指標(biāo)和血清HMGB1水平，對此進行初步探究，以期為臨床做出可行性指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月-2016年1月鄭州大學(xué)附屬洛陽市中心醫(yī)院乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相關(guān)肝衰竭患者90例，分為早期組（A組）、中期組（B組）和晚期組（C組），每組各30例。30例健康體檢者（D組）和30例慢性乙肝患者（E組），作為本實驗的空白對照。本實驗診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《肝衰竭診治指南》[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除甲、丙、丁和戊肝炎病毒感染者，排除酒精性、自身免疫性、藥物性、和原發(fā)性肝癌患者。

1.2 研究方法

1.2.1 血清收集 取各組空腹靜脈血3 ml，加入肝素抗凝后保存于-20℃冰箱。

1.2.2 HMGB1檢測 采用ELISA試劑盒（美國Rapidbio公司）檢測血清HMGB1水平。操作步驟：37℃恒溫箱溫育30 min，洗板4次；每孔先加入顯色劑A液50μl，再加入顯色劑B液50μl，37℃避光顯色15 min；每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)。測定：反應(yīng)終止15 min后，以空白孔調(diào)零點。在450 nm波長下測定各組的吸光度值（OD值）。計算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算出對應(yīng)的樣品濃度，最終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)。

1.2.3 血清生物化學(xué)檢測 采用全自動生化分析儀測定各組血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （alanine transaminase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）和血清白蛋白（Albumin，ALB）含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)結(jié)果均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，并對所得數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的差異比較采用方差分析，有統(tǒng)計學(xué)意義后，做兩兩比較，兩兩比較用的是LSD-t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，采用獨立樣本的非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況比較

乙型肝炎病毒相關(guān)肝衰竭患者90例，分為A、B、C 3組，每組30例。D組和E組作為對照組。各組人群的生物化學(xué)指標(biāo)和血清HMGB1水平見附表。經(jīng)5組間的方差分析，患者的HMGB1水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=38.967，P=0.000）。組間比較結(jié)果顯示與慢性乙型肝炎患者比較，乙型肝炎病毒相關(guān)肝衰竭患者的血清HMGB1水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.347，P=0.000）。

2.2 血清H M G B1水平比較

血清HMGB1水平檢測結(jié)果見附表。A組、B組和C組90例患者血清中HMGB1均為陽性，D組患者血清中HMGB1均為陰性，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.680，P=0.020）。E組中HMGB1雖為陽性，但是其水平值要低于A、B、C 3組。

由附表可知，HMGB1水平隨著肝衰竭的發(fā)展逐漸增加，兩組間比較應(yīng)采用LSD-t檢驗法，即晚期組的 HMGB1水平高于中期組（t=5.511，P=0.000），中期組的HMGB1水平高于早期組（t=5.328，P=0.000）。

2.3 H M G B1與患者生物化學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析

乙型肝炎病毒相關(guān)肝衰竭患者血清HMGB1水平與血清ALT、AST、TBil和ALB指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果顯示，HMGB1與AST水平呈正相關(guān)，且結(jié)果表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.695，P=0.005）。

附表 各組人群的生物化學(xué)指標(biāo)和H M G B1水平 （n=30，±s）

附表 各組人群的生物化學(xué)指標(biāo)和H M G B1水平 （n=30，±s）

組別肝衰竭早期組（A組）肝衰竭中期組（B組）HMGB1/（μg/L）213.8±20.7 229.6±19.5 69.0±9.2 45.28±5.3 7.54±2.5 256.3±25.9 254.9±20.8 315.4±29.6 34.92±4.1 12.05±3.7 ALT/（u/L）AST/（u/L）TBil/（μmol/L）ALB/（g/L）肝衰竭晚期組（C組）健康對照組（D組）299.1±31.2 25.9±3.8 295.7±28.0 29.7±4.2 403.2±37.6 18.1±2.9 30.27±4.0 41.44±6.5 18.69±5.4 0.0±0.0慢性HBV患者（E組）F值P值129.3±10.7 135.8±12.0 42.461 61.098 0.000 0.000 36.7±5.8 12.36±4.5 77.326 9.295 0.000 0.000 5.26±4.0 15.983 0.000

3 討論

HMGB1是在1970年代發(fā)現(xiàn)因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中有很高的遷移率而得名[5]，是普遍存在于各種細胞核及細胞質(zhì)中的高度保守的蛋白。HMGB1分布十分廣泛，多種器官（如淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾和腎等）的細胞中均有表達，正常時位于大多數(shù)細胞的胞核和胞漿內(nèi)，可參與DNA的復(fù)制、細胞分化及基因表達等多種細胞生命活動[6-7]。HMGB1蛋白包含215個氨基酸，在真核細胞中的表達形式為組成型表達，具種間序列保守性。HMGB1在細胞內(nèi)的作用為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，在細胞外的作用為促進腫瘤生長和炎癥的發(fā)生。

目前國內(nèi)外針對于HMGB1在乙型肝炎病毒相關(guān)肝衰竭患者中的表達研究已經(jīng)有了很多的報道。國內(nèi)的研究多集中在HMGB1與肝衰竭的相關(guān)性研究上，對于機制機理等深入的探討還較少涉及。國外對此方面的研究相對于國內(nèi)來說則更為深入細致，劉洪波等[10]通過研究發(fā)現(xiàn)，急性肝衰竭患者體內(nèi)的HMGB1水平值較正常人體內(nèi)會急劇升高，隨著衰竭程度的惡化，HGMB1值有進一步增加的趨勢。他們還對HMGB1與肝衰竭的病理過程與膿毒癥的相似性及HMCB1在膿毒癥中的核心地位進行了考察探索。發(fā)現(xiàn)重型乙型肝炎發(fā)病機制復(fù)雜，多因素參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，目前多認為是病毒作用和宿主機體免疫狀態(tài)兩方面共同作用的結(jié)果，其中HGMB1起到了主導(dǎo)作用。近年對機體所遭受的內(nèi)毒素-細胞因子軸-肝損傷的“二次打擊”學(xué)說的繼發(fā)性損傷的認識逐漸被多數(shù)學(xué)者關(guān)注，內(nèi)毒素-單核巨噬細胞-腫瘤壞死因子所導(dǎo)致的肝細胞的凋亡與壞死在重型乙型肝炎的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位。

HMGB1在細菌性炎癥及非細菌性疾病發(fā)病過程中，均發(fā)揮重要作用。HMGB1造成肝損傷及肝衰竭與TLR4信號途經(jīng)關(guān)系不大，可能主要通過RAGE受體通路起作用。HMGB1的分泌較其他促炎細胞因子出現(xiàn)晚、持續(xù)時間長，因此被稱為晚期炎癥介質(zhì)[8]。多個臨床和實驗研究表明肝衰竭時胞外HMGB1升高[9-11]，具體表現(xiàn)較為延遲效應(yīng)[12-13]。因此，HMGBl可能參與了急性肝衰竭的病理生理過程并發(fā)揮了重要作用。目前針對HMGB1在HBV相關(guān)肝衰竭患者發(fā)病過程中的作用及特征少見報道[14]。牛春燕等在肝組織的原位研究中證實了HMGB1表達水平與炎癥相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒相關(guān)肝衰竭患者的血清HMGB1水平高于慢性乙型肝炎患者和正常人，且晚期患者高于早期患者。由此可見，HBV相關(guān)肝衰竭患者的血清HMGB1水平隨病情加重逐漸升高[15-16]。

本研究結(jié)果證實：乙型肝炎病毒相關(guān)肝衰竭患者血清HMGB1水平高于慢性乙型肝炎患者和正常對照，隨著肝衰竭的發(fā)展HMGB1水平逐漸升高，即晚期組高于中期組，中期組高于早期組。這表明隨著病情加重，HMGB1表達逐漸增加。其原因可能為免疫損傷可使肝細胞或肝內(nèi)免疫細胞釋放HMGB1。HMGB1的釋放量可能與活化和遷移的炎性細胞數(shù)量有關(guān)，從而進一步造成肝內(nèi)的免疫損傷。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)血清HMGB1在乙型肝炎病毒相關(guān)肝衰竭患者患病過程中的特點，為乙型肝炎病毒相關(guān)肝衰竭的預(yù)警和預(yù)后判斷及可能的治療方法（如抗HMGB1藥物的應(yīng)用）提供了新思路。

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（張西倩 編輯）

Expression of HMGB1 in patients with hepatitis B virus-related liver failure and its significance

Rui-qiang Dong1,Dan-feng Zhang2,Guang-rong Sun3
(1.Department of Hepatobiliary Pancreatic and Hernia Surgery,2.Department of Ophthalmology,3.The Second Department of Oncology,Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University,Luoyang,Henan 471000,China)

ObjectiveTo investigate the expression of serum high mobility group protein 1(HMGB1)in patients with hepatitis B virus(HBV)-related liver failure and its clinical significance.MethodsNinety patients of HBV-related liver failure were divided into early group(group A),middle group(group B)and late group(group C)with 30 cases in each group.In addition,30 cases of healthy persons(group D)and 30 cases of chronic hepatitis B patients(group E)were used as control groups.Serum levels of biochemical indexes related to liver function and HMGB1 were detected in each group.Thettest and variance analysis of independent samples were used to compare the data between the groups,and the correlations between the groups were predicted by multiple linear regression analysis.ResultsThe patients of the groups A,B,C and E were HMGB1 positive,their serum levels of HMGB1 were(7.54±2.5),(12.05±3.7),(18.69±5.4)and (5.26±4.0)μg/L,respectively.The patients of the group D were HMGB1 negative.The patients with HBV-related liver failure had significantly higher serum level of HMGB1 than the patients in the group E(t=2.863,P＜0.05).The patients in the group C had significantly higher serum level ofHMGB 1 than those in the group A(t=2.178,P＜0.05).The serum HMGB1 level was positively correlated with the AST level in the patients with HBV-related liver failure(r=0.695,P＜0.05).ConclusionsThe serum HMGB 1 level in the patients with HBV-related liver failure increases with the progression of the disease,which could partially predict the prognosis of the patients.

high mobility group protein;hepatitis B virus;hepatic failure;clinical value

R512.62

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.015

1005-8982（2017）13-0074-04

2016-11-10

張丹鳳，E-mail：drq1drq@163.com；Tel：18037017286