基于GC-MS結合偏最小二乘判別分析的薰衣草精油指紋圖譜研究

朱燕，趙潔，劉兵，符繼紅

(新疆大學理化測試中心，烏魯木齊 830046)

基于GC-MS結合偏最小二乘判別分析的薰衣草精油指紋圖譜研究

朱燕，趙潔，劉兵，符繼紅*

(新疆大學理化測試中心，烏魯木齊 830046)

建立氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)技術測定薰衣草精油的方法，分析了新疆法國藍和C-197(2)2個不同品種的21批薰衣草精油樣品，并基于該方法建立了薰衣草精油的指紋圖譜。以GC-MS結合保留指數對復雜未知物進行定性分析，共確定了26個共有峰。采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)對訓練集樣本進行模式識別，根據模型的變量權重系數(VIP)篩選出了對品種的分類具有較大貢獻的潛在標志物。并通過PLS-DA模型對7個未知樣品進行預測，2個品種的薰衣草精油的均方根預測偏差(RMSPE)均為0.1323，模型對驗證集中薰衣草樣本的判別準確率為100%。結果表明：該方法精密度好，簡單快速，為新疆薰衣草精油的品種鑒定與質量評估提供了可靠的依據。

薰衣草精油；指紋圖譜；分類；偏最小二乘判別分析

薰衣草(LavandulaangustifoliaMill.)，系唇形科薰衣草屬植物[1,2]。我國薰衣草的主要栽培地區是新疆的伊犁，是世界三大薰衣草基地之一[3]。薰衣草除了作為一種傳統中藥，還是一種重要的天然香料植物[4-6]。薰衣草精油香味濃郁而柔和，無毒副作用，作為食品添加劑，既可以使食品具有特殊風味，又具有保健價值，被廣泛地應用[7]。目前市場上由于不同品種混種、混收，加上人工法合成精油非常容易，導致以次充好的現象時有發生，而應用于食品的精油需要更嚴格的質量保證。因此對薰衣草進行系統的研究，建立薰衣草精油的質量控制體系是非常必要的。薰衣草精油的化學成分極為復雜，不同品種薰衣草精油的化學成分和含量存在較大的差異。天然產物質量控制是一項十分復雜的研究，中藥指紋圖譜技術目前已成為國際公認的控制天然產物質量的最有效手段[8-10]。指紋圖譜的特點是復雜、信息量極大，采用化學計量學方法可以很好地解決指紋圖譜數據的復雜解析問題。本文采用水蒸氣蒸餾法提取薰衣草精油，應用GC-MS技術建立薰衣草精油的分析方法，并結合保留指數對薰衣草精油的化學成分進行鑒定。采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)對新疆不同品種的薰衣草精油指紋圖譜進行分析，從而為新疆薰衣草精油的品種判別和質量控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Aglient 7890B GC-5977A MSD氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司；Sartorius BS124S AG電子天平 德國賽多利斯公司；21批薰衣草樣品采集于新疆伊犁，分為法國藍(A1～A13)和C-197(2)(B14～B21)，樣品被分成訓練集樣品(共14個，包括9個法國藍樣本A1～A9，5個C-197(2)樣本B1～B5)和驗證集樣本(共7個，包括4個法國藍樣本A10～A13，3個C-197(2)樣本B6～B8)；正構烷烴標準品C5～C24上海試劑一廠；無水硫酸鈉(分析純) 天津市河東區紅巖試劑廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 薰衣草精油提取

準確稱取30 g干燥的薰衣草花樣品，置于1 L圓底燒瓶中，加入420 mL蒸餾水，用揮發油提取器提取4 h，得到黃色透明、具有特殊濃郁氣味的精油，用無水硫酸鈉干燥后低溫密封保存。

1.2.2 GC-MS分析條件

色譜柱為HP-INNOWax毛細管柱(60 m×0.25 mm，0.5 μm)；程序升溫：初始溫度50 ℃，以3 ℃/min升溫至200 ℃，再以5 ℃/min 升溫至250 ℃，保持3 min；進樣口溫度250 ℃；載氣(He)流速1.0 mL/min；進樣量0.4 μL；分流比30∶1。離子源溫度230 ℃；EI源電離能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；質量掃描范圍30～550 m/z。

1.2.3 保留指數的測定

取C5～C24正構烷烴標準品，采取與樣品相同的分析條件，測定正構烷烴的保留時間。根據保留指數計算公式計算化合物的保留指數(RI)。通過譜庫檢索、化合物保留指數的計算值與NIST數據庫在相同色譜柱HP-INNOWax上的RI文獻檢索值比對，對薰衣草精油組分進行準確定性。

1.2.4 數據分析

數據通過EXCEL，SIMCA-P13.0軟件進行處理計算。PLS-DA分析方法首先對分類變量和數據進行PLS分析，建立類別判別回歸模型，然后根據所建立模型計算驗證集的分類變量(Yp)，當Yp>0.5，且偏差<0.5時，判定屬于該類；當Yp<0.5，且偏差<0.5時，判定不屬于該類；偏差≥0.5時，判別不穩定。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 精密度實驗

取同一薰衣草精油樣品，在GC-MS色譜條件下連續進樣5次。以乙酸芳樟酯(14號峰)為參照峰，計算共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。結果表明：共有色譜峰的相對保留時間的RSD均小于1%，相對峰面積的RSD小于3%，表明儀器的精密度良好。

1.2.5.2 重復性實驗

取同一批薰衣草樣品5份，按上述實驗方法提取薰衣草精油，在GC-MS色譜條件下進行測定。以乙酸芳樟酯(14號峰)為參照峰，計算共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。結果表明：共有色譜峰的相對保留時間的RSD均小于1%，相對峰面積的RSD小于5%，表明方法的重復性良好。

1.2.5.3 穩定性實驗

取同一薰衣草精油樣品，在GC-MS色譜條件下分別在0，2，4，6，8，10，24 h進樣測定。以乙酸芳樟酯(14號峰)為參照峰，計算共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。結果表明：共有色譜峰的相對保留時間的RSD均小于1%，相對峰面積的RSD小于3%，表明薰衣草精油在24 h內穩定性良好。

2 結果與分析

2.1 薰衣草精油GC-MS指紋圖譜的建立

分別稱取21批薰衣草樣品，按2.1項下方法制得薰衣草精油，按2.2項下色譜條件進樣檢測，指紋圖譜色譜圖見圖1。

圖1 21批薰衣草精油GC-MS指紋圖譜Fig.1 GC-MS fingerprint spectrum of 21 batches spectrum of lavender essential oils

對數據進行處理，從21批薰衣草精油GC-MS指紋圖譜中共匹配出26個共有峰，且共有峰面積之和大于總峰面積的90%以上。將21批樣品色譜峰的響應信號的平均值作為共有模式，建立薰衣草精油GC-MS的對照指紋圖譜，見圖2。

圖2 薰衣草精油GC-MS的對照指紋圖譜Fig.2 GC-MS reference fingerprint spectrum of lavender essential oils

其中，乙酸芳樟酯(14號峰)的色譜峰在色譜圖中較穩定，峰面積較大，因此確定為參照峰，其余共有峰與乙酸芳樟酯的相對保留時間的RSD值在0.159%～0.585%之間。對各批次樣品與對照指紋圖譜之間的相似度進行計算。目前對中藥指紋圖譜相似度的計算方法有向量夾角余弦法和相關系數法。向量夾角余弦法是將指紋圖譜的相似度問題轉換成多維空間中的兩個向量的相似性問題，而相關系數法是對不同批次樣品的同種屬性進行相似度比較[11]。本文以向量夾角余弦和相關系數法為測度，經過計算21批樣品與對照指紋圖譜的相似度在0.904～0.990之間，計算結果見表1。

表1 21批薰衣草精油指紋圖譜的相似度Table 1 Similarities of fingerprint spectrum of 21 batches lavender essential oils

結果表明：21批薰衣草精油樣品的相似度均大于0.900，表明整體相似度良好。

2.2 共有峰的歸屬

由于精油復雜多變的化學成分，僅依靠質譜的匹配度來確定相應的化合物存在一定的不確定性。將樣品質譜圖經計算機數據庫檢索，結合保留指數RI進行驗證，可極大提高鑒定結果的準確性。對薰衣草精油指紋圖譜中的26個共有色譜峰進行歸屬，鑒定結果見表2。結果表明：薰衣草精油的主要成分為芳樟醇(相對峰面積0.789～2.713)和乙酸芳樟酯(相對峰面積1)，是含量最高的2個化合物。同時，21批薰衣草精油中的26個共有特征峰的峰面積變化較大，表明不同樣品的薰衣草精油中化學成分的含量存在一定的差異。

表2 薰衣草指紋圖譜中的共有峰成分分析Table 2 Component analysis of common peaks in fingerprint spectrum of lavender essential oils

續 表

注：文獻值為HP-INNOWax色譜柱上的保留指數；“-”表示文獻未報道。

2.3 PLS-DA判別模型的建立與驗證

本實驗以薰衣草樣品中26個共有化合物的相對面積的百分含量為X變量，以訓練集樣品的品種類別為Y變量，按照法國藍和C-197(2)的實際品種類別，將Y變量人工分為2類，并對樣本進行有監督的PLS-DA分析。法國藍和C-197(2)2個品種的PLS-DA的得分圖見圖3a，從圖中可以看出2個品種的薰衣草樣品明顯被分開。其中R2Y=0.975，Q2=0.734，模型驗證結果表明該模型穩定，預測能力好，建模成功。變量權重系數(VIP)值可以量化由PLS-DA的每個變量對樣品分類的貢獻，VIP>1的變量被認為是貢獻較大的變量。由PLS-DA的VIP得分圖3b中可以發現有8個變量的VIP值大于1，變量對分類的貢獻依次為乙酸薰衣草酯>乙酸芳樟酯>β-檀香萜醇>桉油精>乙酸己酯>枯茗醛>莰烯>β-羅勒烯，而乙酸薰衣草酯和乙酸芳樟酯是對分類具有最大貢獻的2個化合物。

圖3 法國藍和C-197(2)樣品的PLS-DA得分圖(a)和VIP得分圖(b)Fig.3 PLS-DA score plot (a) and variable importance plot (b) of French blue and C-197(2) samples

利用PLS回歸分析方法對訓練集樣本的26個共有化合物的相對面積百分含量與分類變量進行回歸分析，并建立共有成分與分類變量的PLS回歸模型。所有訓練集樣本法國藍和C-197(2)分類變量的PLS預測值與實測值的回歸圖見圖4，圖中的直線為模型校正結果與實際分類間的回歸線，分類變量的實測值和模型的預測值的相關系數為0.975，樣品辨別率為100%，說明模型的擬合較好。

圖4 PLS-DA校正模型樣本分類變量的PLS預測值與實測值的回歸圖Fig.4 Regression plot of reference and prediction category variables of sample by PLS-DA model

由圖4可知，模型將法國藍和C-197(2)樣本區分開，即校正樣品分散在實測值等于1線上的法國藍品種樣品點和實際值等于0線上C-197(2)品種的樣本點能明顯分開，結果表明PLS-DA模型具有很高的可靠性，可以用于檢驗和判別新的樣品。

利用PLS-DA判別分析方法建立的薰衣草品種分類模型，對驗證集中的7個未參加建模的樣本(4個法國藍樣本A10～A13，3個C-197(2)樣本B6～B8)進行判別分析，法國藍樣本特征的預測結果見圖5。法國藍品種的薰衣草精油的均方根預測偏差(RMSPE)為0.1323，其中驗證集中所有的法國藍樣本的分類變量(Yp)的預測值都接近于1，偏差在0.1左右；C-197(2)的分類變量的預測值基本為0，偏差均小于0.3。根據PLS-DA方法的判別準則Yp>0.5且偏差<0.5可知，驗證集所有的法國藍樣本均被正確識別，而C-197(2)樣本不具有法國藍樣本的特征，說明PLS-DA判別模型對樣本的判別準確率為100%。采用上述已建立的PLS-DA模型對C-197(2)樣本特征進行預測，C-197(2)品種的薰衣草精油的均方根預測偏差(RMSPE)為0.1323，結果表明模型對驗證集中的C-197(2)樣本的判別準確率為100%。

圖5 驗證集中薰衣草樣品的PLS-DA模型的判別結果Fig.5 Discriminant results of lavender sample in validation set by PLS-DA model

注：A表示法國藍，B表示C-197(2)。

3 結論

本實驗應用GC-MS法建立了薰衣草精油的指紋圖譜，該方法簡單快速，精密度好，可用于薰衣草精油的指紋圖譜分析。采用GC-MS分析方法，對新疆薰衣草(法國藍和C-197(2))共21批精油樣品進行指紋圖譜分析，結合保留指數共確定了26個共有峰，樣品相似度均在0.900以上。采用PLS-DA對驗證集中薰衣草樣品進行模式識別，從中篩選出的 特征變量被確認為潛在標志物，可以作為薰衣草精油不同品種鑒定的標志性化合物，通過PLS-DA模型對7個驗證集樣品進行預測，正確識別率為100%。因此該方法可以為新疆薰衣草精油的品種判別和質量控制提供科學依據。

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Research on Fingerprint Spectrum of Lavender Essential Oil with Partial Least Squares Discriminant Analysis and GC-MS

ZHU Yan, ZHAO Jie, LIU Bing, FU Ji-hong*

(Center for Physical and Chemical Analysis, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

Aim to establish a fingerprint analysis method of essential oil in lavender for quality control by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Twenty-one samples collected in Xinjiang which belong to two different lavender varieties of French blue and C-197(2) are analyzed by GC-MS. Identification of compounds is based on the retention indices and mass library. Twenty-six peaks are selected as the common peaks in fingerprint spectrum. Samples for training set are for pattern recognition by partial least squares discriminant analysis (PLS-DA). Potential biomarkers screening is performed according to VIP value. Through the forecast of 7 unknown samples in the PLS-DA model, the root mean square prediction error of two kinds of lavender essential oil samples is 0.1323, the discrimination accuracy for the lavender varieties is 100% by PLS-DA model based on the validation set of samples. The results show that the established method could be rapid and accurate to evaluate the quality of lavender essential oil.

lavender essential oil；fingerprint spectrum；classification；partial least squares discriminant analysis

2017-03-15 *通訊作者

國家自然科學基金(21565024)；新疆大學博士科研究啟動基金(BS120135)

朱燕(1993-)，女，碩士，主要從事天然產物研究；

符繼紅(1977-)，女，副教授，博士，主要從事天然產物及食品分析研究。

TS225.19

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.004

1000-9973(2017)09-0014-05