酶法合成Levan多糖的過程調控與機理研究

黃雙霞，侯殿志，陳華磊，于玥，藍蔚冰，王帥靜，陳山

(1.廣西大學糖業工程技術研究中心，南寧 530004；2.廣西蔗糖產業協同創新中心，南寧 530004；3.糖業及綜合利用教育部工程研究中心，南寧 530004)

酶法合成Levan多糖的過程調控與機理研究

黃雙霞1,3，侯殿志1,3，陳華磊1,3，于玥1,3，藍蔚冰1,3，王帥靜1,3，陳山1,2,3*

(1.廣西大學糖業工程技術研究中心，南寧 530004；2.廣西蔗糖產業協同創新中心，南寧 530004；3.糖業及綜合利用教育部工程研究中心，南寧 530004)

Levan是一種主鏈由大量呋喃果糖基團以β-(2,6)糖苷鍵連接，少量支鏈以β-(2,1)糖苷鍵連接的胞外多糖。作為一種功能性多糖，Levan具有益生元、降血脂及抗腫瘤等重要的生理功能，在醫藥和食品行業具有巨大應用前景。就Levan多糖的制備方法、酶法合成Levan多糖的機理研究及過程調控幾方面進行了綜述，對酶法合成Levan多糖中存在的問題進行了分析和討論，對未來酶法合成Levan多糖的研究方向進行了展望。

Levan多糖；酶法合成；Levan蔗糖酶；合成機理；過程調控

Levan多糖是一種主鏈以β-(2,6)果糖苷鍵連接，支鏈以β-(2,1)果糖苷鍵連接的微生物功能多糖，其分子量通常在2×103～1×105kDa(Levan多糖結構式見圖1)[1]。Levan多糖具有多種重要的生物學功能，被廣泛應用于食品、醫藥及化學工業行業中。在食品行業中，Levan多糖作為天然甜味劑、乳化劑、穩定劑、配方輔助物及風味和美味載體等，可以應用于糖果、焙烤食品、調味料及乳品中等[2]；并且Levan多糖含熱量低，進入人體后不易被消化吸收，是一種理想的可溶性膳食纖維，可用作減肥食品的原料[3]。在醫藥行業中，Levan多糖可作免疫增強因子與抗癌抗菌素[4]。在化學工業中，由于Levan多糖具有水溶性、保濕性、熱穩定性、成膜性及抗氧化等特性，可以用來制備化妝品添加劑、冷凍保護劑、薄膜、涂層和納米材料等[5]。Levan多糖的生理活性及功能作用使其具有巨大的商業應用價值，進而其制備方法的研究也越來越受到重視。

圖1 Levan多糖結構圖Fig.1 Structure chart of Levan polysaccharide

1 Levan多糖的制備方法

目前，制備Levan多糖的方法主要有微生物發酵法和酶法合成，也有用化學合成Levan多糖的報道，但由于其合成過程復雜，產物難以分離純化，且僅獲得以β-糖苷鍵連接的Levan三糖，進而很少采用此法[6]。

微生物發酵法是一種通過生產菌株在高濃度蔗糖培養基中發酵，經過離心、沉淀等工序得到多糖粗品的方法。但是此法目前存在諸多需要改進的地方，例如生產菌株篩選困難，易染雜菌；產物分離純化困難，且發酵廢液污染環境及成本高等；此外，該法得到的Levan多糖產量也較低，一般在10～50 g/L左右[7]。Feng等[8]構建了γ-PGA缺陷型解淀粉芽孢桿菌NK-ΔLP，在最適條件下發酵培養獲得Levan多糖22.6 g/L；Silbir等[9]利用運動發酵單胞菌NRRLB-14023在最適條件下培養合成Levan多糖40.2 g/L，通過海藻酸鈣固定化菌后獲得Levan多糖31.8 g/L；Xu X等[10]利用類芽孢桿菌BD3526，在最優條件下培養得到Levan多糖36.25 g/L。

酶法是一種通過Levan蔗糖酶直接作用于底物蔗糖，通過轉糖基反應聚合果糖基形成Levan多糖的方法[11]。相比于微生物發酵方法，酶法合成Levan多糖的過程反應體系簡單，避免了發酵液中菌體的干擾，產物提取及純化較易，并且反應條件溫和；通過調控反應條件可提高生產效率及控制產物分子量分布，使得生產成本大大降低[12]。因此，酶法合成未來將成為Levan多糖制備的研究熱點。

2 酶法合成Levan多糖的機理研究

2.1 Levan蔗糖酶

Levan蔗糖酶(Levansucrase，EC2.4.1.10)屬于GH68家族果糖基轉移酶(FTFs)，具有蔗糖水解酶活性和轉移酶活性，一般微生物Levan蔗糖酶分子量范圍在45～80 kDa之間，少量在100 kDa以上[13]。Levan蔗糖酶生產菌株來源廣泛，包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，主要有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、運動發酵單胞菌(Zymomonasmobilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和木醋桿菌(Acetobacterxylinum)等[14]。

不同來源菌種得到的Levan蔗糖酶，其動力學常數Km、酶活力、最適溫度、最適pH值及結構等存在差異，所以Levan蔗糖酶的特性及其純化分離技術的研究備受關注。目前，國內外學者利用菌種誘變、基因改造、固定化技術及優化培養基等手段，提高Levan蔗糖酶的活力和產量[15]。最適反應條件下不同來源Levan蔗糖酶催化蔗糖合成Levan多糖的分子量及產量的變化情況見表1。

表1 不同微生物Levan蔗糖酶催化蔗糖制備Levan多糖的研究Table 1 Study on enzymatic synthesis of Levan polysaccharide by different microbial Levansucrase

續 表

2.2 Levan蔗糖酶的分泌、酶結構與反應機制

2.2.1 Levan蔗糖酶的分泌

Levan蔗糖酶的基因表達包括誘導性表達和組成性表達，大多數細菌利用蔗糖底物誘導酶轉錄；同時底物存在時某些細菌也進行組成性表達，例如枯草芽孢桿菌、運動發酵單胞菌和谷氨酸木醋桿菌等。微生物Levan蔗糖酶的分泌機制包括以下兩種：對于革蘭氏陽性菌，通過切割引導前體酶的信號肽后分泌Levan蔗糖酶，如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和羅伊乳桿菌等[30]；對于絕大多數革蘭氏陰性菌，通過信號肽獨立通道分泌Levan蔗糖酶，如解淀粉歐文氏菌、拉恩氏菌和丁香假單胞菌等，最后成熟的酶蛋白會被轉移到外部介質或附著在細胞表面[31]。

然而革蘭氏陰性谷氨酸木醋桿菌的Levan蔗糖酶分泌過程與革蘭式陽性菌類似[32]，首先合成N-末端帶30個氨基酸殘基的信號肽來引導前體酶形成，轉移到周質后信號肽被切除，然后通過跨膜轉移β-螺旋折疊的成熟酶蛋白，這種分泌過程稱為II型分泌系統[33]。枯草芽孢桿菌B168菌株的蔗糖代謝途徑以胞外代謝途徑為主，即以sacB基因編碼分泌型的Levan蔗糖酶后催化蔗糖轉化成果糖和葡萄糖[34]；其次以sacA、sacP基因催化進行胞內代謝途徑；研究發現sacA和sacB操縱子均受到抗終止轉錄因子的調控，其中抗終止轉錄因子sacT和sacY起正調控作用，sacX起負調控作用；且sacX、sacY操縱子的表達又受sacY自身、degS、degU及底物蔗糖的調控[35]。

2.2.2 酶結構

Levan蔗糖酶屬于胞外酶，其蛋白質分子結構中通常有5個重要區域：信號肽、N-末端結構域、催化結構域、細胞壁結合區域和C-末端結構域[36]。GH68家族FTFs都有3個高度保守的AA序列，分別稱為共價催化基團、廣義酸/堿催化基團和過渡態穩定基團形成催化三聯體[37]。

圖2 Levan蔗糖酶的三維結構及其活性部位[38]Fig.2 The three-dimensional structure and active sites of Levansucrase

圖2中，微生物Levan蔗糖酶的晶體結構相似，催化結構域均為5片折疊β-螺旋拓撲結構，形成一個帶負電荷、中心深的口袋狀結構[38]。

A為革蘭氏陽性枯草芽孢桿菌Levan蔗糖酶(PDB ID∶1OYG)的三維結構圖，B為其活性部位；C為革蘭氏陰性谷氨酸木醋桿菌Levan蔗糖酶(PDB ID∶1W18)的三維結構圖，D為其活性部位；Levan蔗糖酶催化結構域的5葉片分別對應橙色、藍色、綠色、黃色和紅色。

枯草芽孢桿菌Levan蔗糖酶的親核催化基團Asp86(D86)、廣義酸堿催化基團Glu342(E342)及過渡態穩定基團Asp247(D247)；研究發現Arg360殘基(R360)位于毗鄰中央口袋的溶劑暴露位點，與活性中心周圍的AA殘基E340、N242相互作用形成一個果糖基受體底物的短暫停留位點，因此，Arg360殘基與聚合酶的活性及Levan多糖的生物合成過程密切相關[39]。通過研究酶活性中心的氨基酸組成，有助于探索酶的結構與功能的關系。李潤靜等[40]利用化學修飾劑NBS與PMSF對Levan蔗糖酶進行化學修飾，其中NBS修飾色氨酸(Trp)；PMSF修飾蘇氨酸(Thr)或絲氨酸(Ser)的-OH基團，發現Levan蔗糖酶的水解酶活和轉糖基酶活均受到抑制，說明Trp與-OH基團是Levan蔗糖酶活性的必需基團。

2.2.3 酶催化反應機制

Levan蔗糖酶催化反應過程遵循non-Leloir反應機制，包括形成一種共價的糖基-酶中間體并且通過過渡態氧化碳離子穩定這2個步驟[41]：第一階段是糖基化過程，首先蔗糖作為供體，通過親核-COOH基團攻擊糖基的異頭碳形成共價的果糖-酶中間體，側鏈基團作為廣義酸催化劑為糖基離去基團提供質子；第二階段是去糖基化過程，廣義堿催化劑作為質子受體，從轉移的果糖基(或水分子、蔗糖)移去一個質子從而水解果糖-酶中間體[42,43]。

2.3 Levan多糖的合成過程

蔗糖底物同時作為果糖基的供體和受體；水分子、果糖、葡萄糖及低聚果糖均可作為受體；所以根據不同受體，Levan蔗糖酶利用蔗糖催化以下3個反應，見圖3。

圖3 Levan蔗糖酶利用蔗糖催化的3個反應[44]Fig.3 Three enzymatic reactions catalyzed by microbial Levansucrase

圖3中1為聚合反應，以果聚糖鏈作為受體形成Levan多糖；2為轉果糖基反應，以單糖、二糖或低聚糖作為果糖基受體；3為水解作用，以水分子為受體釋放葡萄糖和果糖。

Levan蔗糖酶直接作用于蔗糖底物，其水解酶活和轉糖基酶活同時起作用，催化蔗糖水解為葡萄糖和果糖基，同時逐步將呋喃果糖基單元以β-(2,6)糖苷鍵連接到葡萄糖殘基受體上，不斷延長糖鏈，最后形成Levan多糖。Méndez-Lorenzo L等[45]發現當底物蔗糖耗盡后，合成的聚合物作為果糖基供體，Levan蔗糖酶外切多糖的β-(2,6)糖苷鍵連續釋放末端果糖，直到外切位點遇到多糖鏈上的分支點后停止，說明連接分支點β-(2,1)糖苷鍵是Levan多糖控制自身合成酶水解作用的關鍵部位。

根據不同Levan蔗糖酶來源及反應條件，合成Levan多糖的過程存在2種增長機制。對于革蘭氏陽性菌產的Levan蔗糖酶催化合成聚合物的過程沒有中間產物低聚果糖的積累，其果聚糖鏈與酶相結合可以產生高聚合度的Levan多糖，稱為高度連續性增長機制，如巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和唾液鏈球菌[46,47]；而革蘭氏陰性菌產的Levan蔗糖酶在反應過程中會生成中間產物，因為水解酶活性依次釋放果糖基形成低聚果糖，導致Levan多糖產量低，這是一種半連續性增長機制，如谷氨酸桿菌、解淀粉歐文菌和丁香假單胞菌[48,49]。不同細菌Levan蔗糖酶對果糖基受體的親和力有顯著差異，因此合成Levan多糖的能力不同，進而需要更深一步研究Levan多糖的合成機制及建立模型。

3 酶法合成Levan多糖的過程調控

通過酶法合成的過程調控，可以提高Levan多糖產量和控制其分子量。目前，國內外相關的研究主要通過溫度、蔗糖濃度、pH、離子強度、合成酶的固定化及酶濃度等對酶法合成Levan多糖的過程進行調控。

3.1 溫度的影響

溫度影響酶活性及催化反應速率。解淀粉芽孢桿菌在4 ℃時聚合酶活性最高，而在30 ℃時水解酶活性最高[50]；產左聚糖細桿菌ATCC15953的Levan蔗糖酶聚合最佳溫度為30 ℃，但是水解最佳溫度在45～50 ℃之間[51]。此外，通過控制溫度可以調控Levan多糖的分子量分布，在50 ℃下地衣芽孢桿菌RN-01產的Levan蔗糖酶主要合成高分子量Levan多糖(612 kDa)，在30 ℃時主要產低分子量多糖(11 kDa)；Santos-Moriano等[52]發現運動發酵單胞菌Levan蔗糖酶，在蔗糖濃度為100 g/L時，4 ℃下蔗糖轉化率為15.7%，轉糖基與水解反應的比率為2.4；40 ℃時蔗糖轉化率為77.2%，轉糖基與水解反應的比率為0.8。因此，溫度會影響水解酶活、轉糖基酶活及Levan多糖分子量分布；通常Levan蔗糖酶的蔗糖水解反應的最佳溫度比聚合反應的最佳溫度高，在低溫下(10～30 ℃)有利于聚合形成Levan多糖。

3.2 蔗糖濃度的影響

通常Levan多糖的產量隨著蔗糖濃度的增加而增加，陸娟等[53]使用地衣芽孢桿菌Levan蔗糖酶在一定條件下培養，蔗糖濃度范圍為10～90 g/L，合成Levan多糖的產量隨著蔗糖量濃度的增大而增大。Porras-Domínguez等[54]研究發現在37 ℃時，枯草芽孢桿菌168 Levan蔗糖酶合成的低分子量分布Levan多糖隨著蔗糖濃度的增加其分子量大小呈降低趨勢；并且在低底物濃度下該酶僅有20%轉糖基效率，而在高底物濃度下達到83%，說明Levan蔗糖酶的轉移酶活性隨底物濃度增加而增加。此外，Belghith K S等研究發現蔗糖濃度影響嗜熱芽孢桿菌的菌體生長和Levan蔗糖酶的產量，在1%～10%(W/V)低蔗糖濃度時碳源主要供給菌體生長而非合成Levan蔗糖酶，蔗糖濃度達到30%(W/V)時Levan蔗糖酶的產量與活性均顯著提高。因此，影響Levan蔗糖酶產量的重要因素是蔗糖濃度而不是菌體細胞的大小；蔗糖濃度變化使Levan蔗糖酶的水解活性和轉糖基活性受到影響，同時也會改變產物Levan多糖的分子量分布狀況。

3.3 pH的影響

pH影響酶蛋白的穩定性及構象，并且通過改變酶與底物的結合或解離狀態來影響酶活力，改變催化速率。地衣芽孢桿菌8-37-0-1重組Levan蔗糖酶的最適pH為6.0，而pH<4.0或pH>8.5時酶活力下降50%；運動發酵單胞菌102250產的Levan蔗糖酶最適pH為6.0；腸膜明串珠菌ATCC8293產的Levan蔗糖酶最適pH為6.5～7.0，當pH超過8.0時酶活迅速下降[55]。所以，通常Levan蔗糖酶最適pH值范圍為6.0～7.0左右，在大多數情況下pH值的變化不影響Levan蔗糖酶的水解酶活性和轉移酶活性。

3.4 離子強度的影響

金屬離子可以調控培養基的離子強度，作為某些酶蛋白分子的激活劑、抑制劑及輔助因子，影響酶的氨基酸電離、氫鍵及酶蛋白分子結構。枯草芽孢桿菌Levan蔗糖酶有Ca2+結合位點，可以穩定活性殘基之間的關鍵結合區域；而谷氨酸木醋桿菌Levan蔗糖酶通過二硫鍵產生類似折疊穩定的作用，無Ca2+存在時酶活力高[56]。地衣芽孢桿菌RN-01產的Levan蔗糖酶，Mn2+存在時酶活增加2.4倍，而Cu2+，Zn2+，Fe3+，SDS，EDTA存在時酶輕微失活，50 ℃時加入0.5 mol/L NaCl后催化合成的Levan多糖分子量從612 kDa降到11 kDa。甲基營養芽孢桿菌SK21.002產的Levan蔗糖酶，Cu2+、Zn2+、Fe3+和N2+對水解酶活和轉糖基酶活呈抑制作用；而Mg2+作為激活劑提高酶活，促進合成高產量Levan多糖；嗜熱芽孢桿菌Levan蔗糖酶在50 mmol/L Fe2+存在時，酶活增加4倍。因此，通常Mg2+可提高Levan蔗糖酶酶活，Ca2+影響Levan蔗糖酶的催化結構域；NaCl會與底物競爭水分子，促進轉糖基反應；此外，強離子作用可能影響酶的氫鍵，導致酶連續性合成能力降低，多產生低分子量的Levan多糖。

3.5 合成酶的固定化

利用酶的固定化技術提高酶的穩定性及循環利用率，使產物更容易分離純化。Esawy等[57]證明枯草芽孢桿菌NRC33a產的Levan蔗糖酶與戊二醛共價結合到殼聚糖上可獲得最高固定化率81.51%。Jang K H等[58]將運動發酵單胞菌Levan蔗糖酶通過離子結合固定在羥基磷灰石表面后，用于生產低分子量的Levan多糖。Chiang等進行運動發酵單胞菌Levan蔗糖酶的重組表達，并固定于幾丁質上，在蔗糖濃度200 g/L時合成產物83 g/L，比游離酶合成產量提高了66%，并且合成高/低分子量Levan多糖的比例沒有改變。對Levan蔗糖酶進行固定化處理在一定程度上不僅可以提高酶的利用率，而且可以簡化后期Levan蔗糖的分離純化程序，節省大量有機溶劑的使用。

3.6 酶濃度的影響

根據不同的酶濃度控制Levan多糖的分子量分布。Jaime R等發現枯草芽孢桿菌168的Levan蔗糖酶反應體系中，1 U/mL酶濃度下得到雙峰重均分子量分布；大于5 U/mL高酶濃度下獲得低分子量Levan多糖(平均7.2 kDa)；0.1 U/mL低酶濃度下獲得高分子量Levan多糖(大于2×103kDa)。Raga-Carbajal等[59]發現低濃度的枯草芽孢桿菌Levan蔗糖酶(0.1 U/mL)通過連續性機制合成高分子量Levan多糖(平均2.3×103kDa)。因此，酶濃度不僅影響轉糖基反應，也影響Levan多糖的平均分子量和分枝數；且在反應過程中由于存在不同果糖親和受體會產生不同分子量的Levan多糖產物。

4 結語

Levan多糖由于其多樣的生理活性已經成為多糖開發的一個熱點，其制備方法的研究是Levan多糖商業化利用的前提。目前Levan多糖的工業化制備還限于微生物發酵階段，存在著諸多的不足和需要改進的地方。而酶法由于反應體系簡單、制備工藝簡潔、產率高等優點迅速引起廣大研究者的興趣。但是目前生產菌株產酶率不高，Levan蔗糖酶的分泌過程復雜等原因造成Levan蔗糖酶活性較低，故而酶法合成Levan多糖還處于實驗研究階段。未來酶法合成Levan多糖的研究可以集中在酶活力的提高及后期Levan多糖的分離純化，例如可以利用基因工程制備工程菌或構建重組酶，改善酶活，并且可以通過酶的化學修飾強化酶的催化性能；而分離純化方面，可以采用耦合其他技術，如固定化、酶耦合膜技術等。盡管目前酶法在制備Levan多糖中還面臨著諸多挑戰，但是隨著研究的深入和創新性成果的不斷涌現，酶法合成Levan多糖必將更加成熟和高效。

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Process Control and Mechanism Analysis of Levan Polysaccharide by Enzymatic Synthesis

HUANG Shuang-xia1,3, HOU Dian-zhi1,3, CHEN Hua-lei1,3, YU Yue1,3LAN Wei-bing1,3, WANG Shuai-jing1,3, CHEN Shan1,2,3*

(1.Research Center of Sugar Industry Engineering Technology of Guangxi University, Nanning 530004, China;2.Guangxi Sugar Industry Collaborative Innovation Center, Nanning 530004, China;3.Engineering Center of Sugar Industry and Comprehensive Utilization, Ministry of Education,Nanning 530004, China)

Levan, an extracellular polysaccharide, is composed of β-2,6 glycosidic linkage in the main chain and β-2,1 glycosidic linkage in the branch. Due to the promising physiological effects of prebiotics, reducing blood fat and anticancer, Levan exhibits great potential in food and pharmaceutical industries. Summarize the preparation methods of Levan polysaccharide, process control and mechanism analysis of Levan polysaccharide by enzymatic synthesis.Meanwhile,the existing problems in the process of enzymatic synthesis are discussed and the orientation of further research of Levan polysaccharide by enzymatic synthesis is prospected in the future.

Levan polysaccharide；enzymatic synthesis；Levansucrase；synthesis mechanism；process control

2017-03-18 *通訊作者

國家自然科學基金項目(21264003)

黃雙霞(1992-)，女，碩士，研究方向：糖廠副產物綜合利用與糖類藥物開發。

TS244

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.036

1000-9973(2017)09-0145-08