米曲霉YP4-1發酵豆醬過程中的氨基酸態氮含量測定

唐國瑾，孫曉東，王輝，武亞楠，劉睿

(大連民族大學 環境與資源學院，遼寧 大連 116600)

米曲霉YP4-1發酵豆醬過程中的氨基酸態氮含量測定

唐國瑾，孫曉東*，王輝，武亞楠，劉睿

(大連民族大學 環境與資源學院，遼寧 大連 116600)

家庭自制豆醬是東北三省非常普遍的佐菜食品，其制作的方法是利用空氣中的微生物自然發酵而成。氨基酸態氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，是判定發酵食品如醬油、料酒、大醬發酵品質的重要指標。該研究從131份東北三省家庭自制豆醬中分離發酵功能菌株，利用脫脂牛奶平板初篩，麥麩固體培養基復篩，采用福林酚法測定蛋白酶活性大小，其中米曲霉YP4-1具有很強的蛋白酶活性。將YP4-1單菌接種于豆醬中發酵培養90天，采用甲醛值法每隔10天測定豆醬樣品中氨基酸態氮含量，結果顯示：發酵第50天時氨基酸態氮含量最高，為0.46 g/mL。

豆醬；蛋白酶活性；米曲霉；氨基酸態氮

傳統家庭自制豆醬是一種普遍的發酵食品，距今已有3000多年的歷史，是人們日常生活中不可或缺的佐菜食品，其味道鮮美、營養豐富、口味獨特、易于消化和吸收[1]。由于家庭自制豆醬開放的制作環境，導致豆醬表面附著大量真菌，真菌通過代謝可以產生蛋白酶等次生代謝產物[2]。蛋白酶是催化蛋白質水解的一種很重要的酶，被廣泛運用于生產生活的各個方面[3]。蛋白酶可分為外膚酶和內膚酶兩大類，外膚酶只對底物的C 端或N 端的膚鍵有作用，內膚酶只能水解大分子蛋白內部的膚鍵，是真正的蛋白酶[4]。目前，蛋白酶常被應用于面包生產、肉類嫩化和皮革工業的脫毛和軟化等方面[5]。本研究從我國東三省采集到131份豆醬樣品，獲得純培養真菌菌株301份，對這些菌株進行蛋白酶活性的篩選，獲得高產蛋白酶的菌株YP4-1。利用甲醛值法[6]對該菌株發酵的豆醬進行氨基酸態氮含量的測定[7]。本研究為篩選優良的發酵功能菌株、提高發酵豆醬的品質奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然發酵豆醬：取自東三省地區的農戶家里；氫氧化鈉(分析純)、福林酚試劑：上海索萊寶生物科技有限公司；酪氨酸：上海酶聯生物科技有限公司；其余試劑均為分析純：天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

奧林帕斯CX21顯微鏡 日本奧林帕斯公司；HZQ-Q全溫振蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；XFH-75C電熱式壓力蒸汽滅菌鍋 深圳市鼎鑫宜實驗設備有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；磁力攪拌器 上海鷹迪儀器設備有限公司；酸度計 上海洪紀儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產蛋白酶菌株的篩選

通過對131份采自東北三省各地的家庭自制豆醬進行分離，對獲得的純培養真菌菌株經脫脂牛奶平板初篩，如表現出蛋白酶活性，則會在培養基的背面形成透明的水解圈。

1.3.2 發酵復篩

采用具有天然成分的麥麩固體培養基，以麥麩∶豆餅粉∶水為4∶1∶3的比例配制，滅菌后將初篩具有活性的菌株接入，25 ℃黑暗培養5天。在發酵培養基中加入50 mL無菌的去離子水，分散均勻，30 ℃震蕩培養4 h，靜置。濾液在4200 r/min下離心20 min，取上清液作為粗酶液測定。

1.3.3 酶活測定

采用福林酚法測定蛋白酶的活性[8]。

1.3.4 豆醬的制作及單菌發酵

挑選飽滿的大豆浸泡，變軟后煮透，搗碎。分裝到罐頭瓶中，每瓶裝120 g。用封口膜封嚴，121 ℃滅菌60 min。將菌株YP4-1接種到PDA培養基上活化，挑取新鮮菌落用無菌水制成濃度為1×106cfu/mL的菌懸液。超凈臺內將菌懸液取1 mL單菌接種于滅菌的大豆中，25 ℃培養。待菌落長滿大豆表面時加入12%(W/W)的鹽水，常溫發酵90天。

1.3.5 氨基酸態氮含量測定

在發酵期間，每隔10天測定豆醬發酵過程中的氨基酸態氮含量，采用甲醛值法(GB/T 5009.39-2003)[9]。

2 結果與分析

2.1 產蛋白酶菌株的篩選

通過脫脂牛奶平板初篩，菌株YP4-1在培養基背面形成透明圈，證明此菌具有蛋白酶活性。發酵復篩后的粗酶液經福林酚法測定的蛋白酶活性大小見表1。

表1 YP4-1的透明圈大小及蛋白酶活力Table 1 The size of transparent zone and protease activity of YP4-1

2.2 氨基酸態氮含量測定結果

對發酵豆醬每隔10天測其氨基酸態氮含量，其含量隨發酵時間的變化規律見圖1。

圖1 YP4-1發酵豆醬的氨基酸態氮含量Fig.1 The content of amino acid nitrogen of soybean paste fermented by YP4-1

由圖1可知，發酵初始氨基酸態氮的含量隨著發酵時間的延長逐步增加，在發酵50天時達到了最大值，之后氨基酸態氮的含量呈現小范圍的波動，至后期菌絲老化，菌體代謝減弱至停止，氨基酸態氮的含量逐漸下降。

3 討論

發酵是醬油、大醬生產的主要環節，也是蛋白質分解的過程以及分解物再次發生復雜反應的過程[10]。這個過程產生的氨基酸態氮亦稱氨基氮，是由大豆和或脫脂大豆、小麥和或麩皮中的蛋白質水解產生的，是衡量發酵能力的重要指標。在YP4-1接種的發酵體系中，發酵初始氨基酸態氮的含量呈直線上升趨勢，這個階段生成的氨基酸及相應的代謝產物參與了糖類和脂類的合成反應，有一些氨基酸參與了丙酮酸、乙酰CoA、α-酮戊二酸、琥珀酰CoA、延胡索酸、草酰乙酸等物質的合成，使氨基酸為其他物質的代謝循環提供了碳骨架[11]。在發酵后期，菌體處于老化狀態，菌體代謝產生的蛋白酶系逐漸降低至停止，體系中氨基酸態氮的含量逐漸降低。由于YP4-1來源于空氣中，為野生型發酵功能菌株，其產蛋白酶的活力及發酵性能均有可優化與提升的空間。米曲霉是公認的食品安全菌株，具有很強的蛋白酶合成能力，其蛋白酶在較廣的pH范圍內均具有活性，另外由于米曲霉含有豐富的糖苷水解酶，可以利用淀粉或纖維素等廉價原料高效生產蛋白酶，所以米曲霉是食品用蛋白酶的主要來源菌株。本研究為篩選優良的發酵功能菌株、提高發酵豆醬的品質奠定了理論基礎。

[1]高秀芝，艾啟俊.傳統豆醬和商品豆醬發酵過程中營養及理化指標動態[J].中國食品報，2013，13(2)：205-210.

[2]胡學智，王俊.蛋白酶生產和運用的進展[J].工業微生物，2008，38(4)：49-61.

[3]徐紅華，賀殷媛，溫其標.Gouda干酪在儲藏期蛋白質水解對其質構和微觀結構的影響[J].中國乳品工業，2008，36(3)：10-13.

[4]胡學智.蛋白酶的生產和運用(上)[J].江蘇調味副食品，2006，23(6)：1-4.

[5]崔東善.蛋白酶及其在食品中的應用[J].杭州食品科技，1997(1)：15-16.

[6]李迎麗.甲醛值法測定醬油中氨基酸態氮結果不確定度的評定[J].中國衛生工程學，2010，9(1)：49-51.

[7]陳美春，康明武，楊勇.醬油中氨基酸態氮測定方法的探討[J].四川食品與發酵，2008，44(2)：54-56.

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[9]劉佳寧.論醬油中氨基酸態氮檢測數據準確性相關影響因素[J].食品工程，2015，36(4):46.

[10]孟發寶.影響醬油中氨基酸態氮含量的因素[J].中國調味品，2008(6)：29-30.

[11]王鏡巖.生物化學(第三版)[M].北京：高等教育出版社，2013：299-366.

Detection of Amino Acid Nitrogen Content of Soybean Paste Fermented byAspergillusoryzaeYP4-1

TANG Guo-jin, SUN Xiao-dong*, WANG Hui, WU Ya-nan, LIU Rui

(College of Environment and Resources, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China)

Homemade soybean paste is a very common food in three provinces of the northeast of China. It is fermented by microorganism in the air. Amino acid nitrogen refers to the nitrogen content that exists in the form of amino acid, and it is the important indicator to distinguish the fermentation quality of the fermented foods such as soy sauce, cooking wine and soybean paste. Isolate the strains with fermentation functions from 131 homemade soybean paste samples in the northeast three provinces. Use skim milk plate and wheat bran solid medium to select, and the Folin-phenol Reagent Method is used to detect the protease activity. The strain ofAspergillusoryzaeYP4-1 is found with high protease activity. Use YP4-1 to ferment soybean paste for 90 days,and the content of amino acid nitrogen is detected every 10 days. The result shows that amino acid nitrogen content is the highest in the 50th day,reaching to 0.46 g/mL.

soybean paste；protease activity；Aspergillusoryzae；amino acid nitrogen

2017-03-16 *通訊作者

國家自然基金青年基金項目(31200014)；中央高校自主基金項目(DC201501012)；大連民族大學大學生創新訓練項目(XA201612346)

孫曉東(1979-)，女，山東掖縣人，高級工程師，博士，研究方向：真菌分類與真菌毒素的檢測。

TS201.5

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.027

1000-9973(2017)09-0113-03