2013年滁州市艾滋病病人亞型和耐藥結果分析

郭顏艷

1安徽理工大學 安徽淮南 232001；2滁州市疾病預防控制中心 安徽滁州 239001

2013年滁州市艾滋病病人亞型和耐藥結果分析

郭顏艷1，2

1安徽理工大學 安徽淮南 232001；2滁州市疾病預防控制中心 安徽滁州 239001

自從1996年提出的HAART（高效抗逆轉錄病毒治療）一方面顯著降低了艾滋病的死亡率和發病率，提高了艾滋病患者的生存質量，延長了艾滋病患者的生命，并且降低了傳染性，但是另一方面HIV-1具有高度的變異性和抗病毒藥物的選擇性壓力，且部分艾滋病病人的依從性差，導致HIV病毒產生耐藥突變。此次將滁州市2013年滁州市在治療大于一年的艾滋病病人的耐藥結果和亞型進行分析，為艾滋病病人的治療做出療效評估和監測。

滁州市；艾滋病；耐藥

1 材料與方法

1.1 樣品：采集滁州市2012年12月31日前所有在治療艾滋病病人血漿共 174份進行病毒載量檢測，選取病毒載量檢測值＞1000CPS/ml的12位病人血漿繼續進行HIV-1耐藥基因型檢測。

1.2 RNA提取 提取試劑采用法國梅里埃 NucliSENS miniMAG（1.0）核酸提取試劑手工提取。將 200ml病人血漿樣本加到裂解液管后充分混勻，并將試管在室溫中靜置裂解孵育10分鐘以上，將二氧化硅和內標的混合液100ul加入裂解液中靜置孵育10分鐘以上，嚴格按照操作說明書進行手工清洗，最后用洗脫緩沖液把吸附的核酸洗脫下來。洗脫下來的核酸及時轉移到無DNase和RNase的樣品保存管中。

1.3 NASBA反應 加入引物在65度1分鐘，41度1分鐘預擴增，加酶在41度等溫擴增1個小時。

1.4 巢式聚合酶聯鏈式反應 使用反擴轉錄巢式 PCR擴增HIV-1POL基因區片段。RNA逆轉錄和巢式第一輪PCR反應體系使用的是Takara公司的一步法試劑盒AMV（Takara one step RNA PCR kit）試劑盒.第二輪擴增使用TIANGEN 2×Taq PCR Master Mix試劑對第一輪的擴增產物進行第二輪 PCR。兩輪擴增產物目的片段約為1200bp.

1.5 RT-PCR 反轉錄擴增反應和第二輪擴增反應 第一輪擴增：引物 MAW26、HBX2、RT21、HBX2 各 0.5ul，酶 1ul，buffer12.5ul，無酶水5.5ul，RNA模板5ul，終體積為25ul。第二輪擴增：引物PRO-1、HBX2、RT20各1ul，MIX25ul，無酶水18ul，RNA模板5ul，終體積為50度。

1.6 電泳 二輪PCR后的擴增產物用EB作核酸染料跑1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.7 測序 PCR產物送由博邁德公司純化和測序。

1.8 把所得到的fasta格式的程序文件提交斯坦福大學HIV耐藥數據庫（SHDB）得到耐藥結果。

2.結果

2.1 此次收集標本均為2012年12月31日前所以在治療艾滋病病人血漿共174份。

其中病毒載量檢測檢測值＞1000的共12人。并對12人進行耐藥檢測.其中異性傳播10例，同性傳播2例，男性8人，女性4人。

2.2 亞型結果分析 在POL區的亞型結果分析中，12例標本中有CRF01-AE重組亞型8例為最多，占66.7%（8/12），且兩例同性傳播亞型均為CRF01-AE重組亞型，其余四例均為B亞型。

2.3 耐藥基因情況分析

在12名抗病毒治療的病人標本中有7例24個突變位點，沒有出現蛋白酶抑制劑主要耐藥相關突變，其中5例出現NRTIs和NNRTIs雙突變。其中M184V和K103N位點突變次數最多，分別為4例。K65R位點突變頻率為2次。見表1.

表1 ：滁州市在治療HIV-1病人相關耐藥突變

3.討論

隨著高效抗逆轉錄病毒治療在我國廣泛應用，以及不斷增長的HIV-1感染者人數。單一或者多重艾滋病病毒耐藥株也隨之產生并傳播。同時隨著耐藥株越來越多的出現，導致耐藥株的流行，以至于原發性耐藥感染者初次接受抗病毒治療后可能失敗或者無法持續控制HIV-1病毒復制。截止2012年12底我市在治療病人共 個，有12名病人病毒載量檢測值＞1000cps/ml，且只有7人出現不同程度耐藥突變，但是都沒有PI主要突變和次要突變，說明目前使用的一線藥物對我市絕大部分HIV-1病人有效。在這12個病人的治療方案全部使用3TC，所以針對3TC的M184V位點頻率最高，引起3TC、FTC的高度耐藥同時引起 ABC的潛在耐藥。在一些調查研究中表明，K103N是所有NNRTIS治療的所有病人里最普遍和重要的突變，可能會對所有的非核苷類反轉錄酶抑制劑產生20到50貝的耐藥性。我市的12名病人突變次數最多K103N，和研究結果一致。12名病人中，治療時間最長的病人只出現V106R突變，沒有產生耐藥，而出現多重藥物重度耐藥的病人治療時間才兩年。隨訪表明病人的服藥依從性差。在我市病人中，外出務工病人占了一部分，回來不便等各種原因導致服藥依從性差，還有長期使用同一種治療方案都有可能導致耐藥相關突變。要盡量可能提高這部分人群的服藥依從性，否則即使使用二線藥，也有可能產生耐藥或者治療失敗。且現在我市新發病人中MSM成了主力軍，據研究報道我國的男男新發感染人群里的原發性耐藥率竟然高達 14.4%，所以有必要對此人群進行治療前耐藥檢測。在我實驗室，耐藥檢測工作還未能開展，為了指導臨床用藥，為了艾滋病防控提供技術支持，

[1]吳建軍，刑輝，沈月蘭，等.2008年安徽省原發HIV-1感染者耐藥毒株變異情況研究[J].中華疾病控制雜志，2011，15（1）：33-35

[2]劉建芳，嚴延生，林勛，等.福建省 HIV-1流行毒株基因分型與流行特征分析[J].中國人獸共患病學報，2006，22（7）：601-605，608.

[3]李晶，姚均.HIV-1表型耐藥檢測方法的研究進展[J].國際病毒學雜志2014，21（2）：45-48

R512.91

A

1672-5018（2017）01-256-01

郭顏艷（1980.10-），女，漢族，籍貫：安徽省滁州市，學歷：研究生在讀，安徽理工大學。職稱：主管檢驗師。主要研究方向醫學免疫學。