復(fù)合微生物肥料對香蕉枯萎病防控作用研究

汪軍　梁昌聰　周游　王國芬　楊臘英　劉磊　黃俊生

摘 要 采用盆栽試驗(yàn)，研究以枯草芽孢桿菌BLG010和淡紫擬青霉E16這2株防控香蕉枯萎病的專利菌株制備的3種復(fù)合微生物肥料（CMF1、CMF2和CMF3）對香蕉枯萎病發(fā)病率、香蕉生長指標(biāo)、病原尖孢鐮刀菌FOC和生防菌株BLG010和E16在香蕉根際定殖情況的影響。結(jié)果表明：（1）施用CMF1、CMF2和CMF3均明顯降低香蕉枯萎病的發(fā)病率，分別降至60.00%，44.44%，26.67%；（2）與對照相比，CMF1、CMF2和CMF3處理能夠顯著提高香蕉生物量，株高、莖圍、地下部和地上部鮮重，分別提高24.46%～44.80%，40.17%～101.43%，18.78%～47.06%，75.88%～109.11%；FOC數(shù)量下降11.57%～49.07%，BLG010和E16在根際中的定殖量分別提高27.55%和32.80%；（3）共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)根際中尖孢鐮刀菌熒光強(qiáng)度減弱，體積縮小；（4）相關(guān)性分析表明，香蕉枯萎病發(fā)病率與尖孢鐮刀菌FOC數(shù)量呈正相關(guān)，E16菌株數(shù)量與BLG010菌株數(shù)量呈正相關(guān)。施用復(fù)合微生物肥料不僅提高了對香蕉枯萎病的防治效果，而且促進(jìn)香蕉生長和提高根際的生防菌株數(shù)量，具有較大生防潛力。

關(guān)鍵詞 淡紫擬青霉 ；枯草芽孢桿菌 ；香蕉枯萎病 ；復(fù)合微生物肥料 ；定殖

中圖分類號 S432 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.08.009

Abstract Three types of compound microbial fertilizer， CMF1， CMF2 and CMF3， were prepared from Bacillus subtilis BLG010 and Paecilomyces lilacinus E16 which could control Fusarium wilt of banana， and were used for pot culture trial to observe the effect of CMF1， CMF2 and CMF3 on disease incidence of Fusarium wilt， banana growth index， and colonization of Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC）， B. subtilis BLG010 and P. lilacinus E16 in banana rhizosphere. The results showed that treatments CMF1， CMF and CMF3 reduced significantly the disease incidence of Fusarium wilt to 60.00%， 44.44% and 26.67%， respectively. Compared with control， the CMF1， CMF and CMF3 treatments could promote the biomass of banana， the plant height， the stem thickness， the fresh weight of aerial and underground part of banana by 24.46%～44.80%， 40.17%～101.43%， 18.78%～47.06% and 75.88%～109.11%， respectively， reduced the number of FOC by 11.57%～49.07% and increased colonization of BLG010 and E16 in the rhizosphere by 27.55% and 32.80%， respectively. The confocal laser scanning microscope showed that the volume and the fluorescence intensity of FOC were reduced. The correlation analysis showed that the number of FOC was positively correlated with the disease incidence， and that the number of BLG010 was positively correlated with the number of E16. Compound microbial fertilizer could not only increase the controlling effect on Fusarium wilt of banana， but also promote the growth of banana and the number of antagonistic strains， indicating a wide application prospect.

Keywords Bacillus subtilis ； Paecilomyces lilacinus ； Fusarium oxysporum f. sp. cubense ； compound microbial fertilizer ； colonization

香蕉枯萎病是目前危害香蕉的一種毀滅性土傳病害，病原菌為尖孢鐮刀菌古巴專化型Fusarium. oxysporum f. sp. cubense，目前對該病的防治仍缺乏有效的方法。生物防治具有綠色、安全的優(yōu)勢，是近年來的研究熱點(diǎn)[1-4]。擬青霉[5-9]和芽孢桿菌[10-15]對尖孢鐮刀菌均具有拮抗活性，是防治土傳病害的優(yōu)良菌株。選擇優(yōu)質(zhì)有機(jī)質(zhì)等營養(yǎng)與高效拮抗菌株（芽孢桿菌、擬青霉等）制備復(fù)合微生物肥料，可補(bǔ)充生防菌在土壤中定殖所需關(guān)鍵營養(yǎng)，提高病害防控效果[1，14-16]，但是目前的研究還比較淺顯。淡紫擬青霉（Paecilomyces. lilacinus）E16和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）BLG010 2個菌株是中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所選育出的對尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)拮抗作用的專利高效菌株[17-18]，同時利用BLG010菌株和E16菌株與有機(jī)質(zhì)等營養(yǎng)制備獲得的復(fù)合微生物肥料CFM已獲正式登記[微生物肥（2016）準(zhǔn)字2028號]，對枯萎病等土傳病害具有較好的控制效果。本研究在此基礎(chǔ)上通過盆栽試驗(yàn)比較了BLG010和E16菌株制備的復(fù)合微生物肥料（CMF1、CMF2和CMF3）對香蕉生長指標(biāo)、枯萎病防治效果及病原尖孢鐮刀菌FOC、生防菌株BLG010和E16在香蕉根際定殖情況等的影響，并對其作用機(jī)理進(jìn)行了初步探討，以期為復(fù)合微生物肥料的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及植株

供試生防菌：淡紫擬青霉E16菌株、具有硫酸鏈霉素抗性的枯草芽孢桿菌BLG010菌株；供試病原菌：攜帶GFP標(biāo)記的尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種FOC由本實(shí)驗(yàn)室保存；供試植株：5片葉巴西香蕉苗。

1.1.2 土壤、培養(yǎng)基及肥料

供試健康土：未種植過香蕉的沙壤土（番木瓜土，海南儋州番木瓜基地），pH值為5.9，有機(jī)質(zhì)含量22.85 g/kg，速效氮（N）含量810 mg/kg，速效磷（P）含量480 mg/kg，速效鉀（K）含量7 410 mg/kg。

供試病土：接種FOC到PD液體培養(yǎng)基中，置于28℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)5 d 后，于室溫以10 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀物即為含孢子的菌懸液，活孢率達(dá)到5.8×108 CFU/mL。將FOC孢子懸浮液接入上述供試健康土壤中，調(diào)整土壤中FOC濃度為4.2×104 CFU/g土。

供試培養(yǎng)基：FOC采用尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基[19]，E16采用選擇性培養(yǎng)基[20]，BLG010采用含有200 μg/mL鏈霉素的LB培養(yǎng)基。

供試肥料：有機(jī)肥OF由海南寶綠春農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司生產(chǎn)；3種復(fù)合微生物肥料（CMF1、CMF2和CMF3）由2株專利菌株E16和BLG010與雞糞等有機(jī)物料通過復(fù)配制成，制備方法參考文獻(xiàn)[21-22]及復(fù)合微生物肥料行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T798-2015），由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所研制，海南寶綠春農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司生產(chǎn)。供試肥料基本性狀見表1。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)：往每個塑料盆（底面直徑20 cm，高30 cm）中裝入500 g病土，分為5個處理：（1）對照（CK）（不施用任何物質(zhì)）；（2）OF（接入3%OF，充分混勻）；（3）CMF1（接入3% CMF1）；（4）CMF2（接入3%CMF2）；（5）CMF3（接入3% CMF3）。各處理移栽香蕉苗50棵，重復(fù)3次，置于溫室大棚（溫度26～31℃），常規(guī)水肥管理。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)方法

發(fā)病率：香蕉移苗后，每天觀察香蕉生長情況，每隔20 d記錄發(fā)病的植株數(shù)量，計(jì)算累積發(fā)病率。發(fā)病率/%=發(fā)病株數(shù)/（總株數(shù)）×100。

植株生長狀況測定：香蕉移栽后82 d，測定株高、莖圍、地上部和地下部鮮質(zhì)量等生長指標(biāo)，測定方法參照文獻(xiàn)[5]。

香蕉根際病原菌FOC、生防菌BLG010和E16的數(shù)量測定：每隔20 d取根際土樣1次，測定方法參考文獻(xiàn)[5]，采用稀釋涂平板法[21]，略作修改，統(tǒng)計(jì)FOC、E16和BLG010等土壤微生物數(shù)量。

香蕉根際病原菌FOC形態(tài)觀察：取香蕉根際土樣按照一定比例稀釋、過濾后，濃縮離心，利用激光共聚焦顯微鏡（Olympus Fluoview-FV1000）觀察土壤中FOC的熒光強(qiáng)度和形態(tài)變化。

對移栽22 、52 和82 d的香蕉枯萎病發(fā)病率與根際FOC、E16、BLG010數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)分析軟件和Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對香蕉枯萎病發(fā)病率的影響

在香蕉移植后82 d，各處理的發(fā)病率見圖1。CK發(fā)病率達(dá)到96.67%，施用不含生防菌株的有機(jī)肥處理（OF）發(fā)病率為72.22%，含有菌株E16的CMF1處理的發(fā)病率為60.00%，含有菌株BLG010的CMF2處理的發(fā)病率為44.43%，含有菌株E16和BLG010的CMF3處理的發(fā)病率為26.67%，防效達(dá)到71.08%。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌BLG010菌株較淡紫擬青霉E16菌株能更好地防治香蕉枯萎病，尤其是2個專利菌株復(fù)配的復(fù)合微生物肥料CMF3效果最優(yōu)。

2.2 不同處理對香蕉生長指標(biāo)的影響

由表2可知，不同處理對香蕉生長的影響顯著，與CK比較，OF顯著促進(jìn)了假莖圍生長，而對株高、地下部和地上部重量則無明顯促生作用；CMF1、CMF2和CMF3的株高、假莖圍、地下部和地上部重量均有顯著的提高，促生作用依次表現(xiàn)為CMF3>CMF2>CMF1>OF>CK。CMF1、CMF2和CMF3對株高、莖圍、地下部和地上部鮮重的提高幅度分別為24.46%～44.80%、40.17%～101.43%、18.78%～47.06%、75.88%～109.11%。

2.3 不同處理對香蕉根際FOC、E16和BLG010定殖的影響

到第82天，利用不同選擇性培養(yǎng)基檢測香蕉根際病原菌FOC、生防菌E16和BLG010的菌量（Log CFU/g）。結(jié)果表明（表3），復(fù)合微生物肥料不僅能有效降低病原菌尖孢鐮刀菌數(shù)量，還能提高生防菌株E16和BLG010數(shù)量；同時含有生防菌E16和BLG010的復(fù)合微生物肥料CMF3處理效果優(yōu)于含有單一生防菌株E16或BLG010的復(fù)合微生物肥料處理。具體表現(xiàn)為：與對照比較，復(fù)合微生物肥料處理顯著降低土壤中的病原菌FOC數(shù)量，以含有E16和BLG010菌株的CMF3處理效果最為顯著，其次為CMF2，CMF1次之，三者對根際FOC定殖的抑制效果分別為49.07%，19.18%，11.57%。生防菌株E16和BLG010均能在土壤中保持存活，CMF3處理的香蕉根際E16定殖量比CMF1處理提高了32.80%，而其BLG010定殖量比CMF2處理提高了27.55%。

2.4 不同處理根際對尖孢鐮刀菌FOC形態(tài)的影響

利用共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果表明（圖2），對照（CK）和有機(jī)肥OF處理中孢子形態(tài)呈橢圓形，病原菌FOC在根際以小孢子形態(tài)存在；經(jīng)過3種復(fù)合微生物肥料（CMF1、CMF2和CMF3）處理的單個孢子體積減小50%以上，F(xiàn)OC熒光強(qiáng)度顯著減弱，形態(tài)不規(guī)則。總體而言，經(jīng)CMF1和CMF3處理后主要表現(xiàn)為FOC孢子體積減小，經(jīng)CMF2處理后主要表現(xiàn)為FOC孢子邊緣不規(guī)則和體積減小。endprint

2.5 香蕉根際FOC、E16和BLG010數(shù)量相關(guān)性分析

對栽培22 、52 和82 d的香蕉枯萎病發(fā)病率與根際FOC、E16、BLG010數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明（表4），香蕉枯萎病發(fā)病率與FOC數(shù)量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；E16與BLG010數(shù)量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；其余指標(biāo)間無顯著相關(guān)關(guān)系。

3 討論

淡紫擬青霉能產(chǎn)生類植物生長素[23]，通過營養(yǎng)競爭抑制病原菌生長[6]，具有防病促生作用[17，23-24]。芽孢桿菌具有分泌拮抗物質(zhì)、抑制和降解病原真菌的作用[17]。本研究選用2株高效專利拮抗菌株（枯草芽孢桿菌BLG010和淡紫擬青霉E16），分別比較了單一菌株和混合菌株制備的復(fù)合微生物肥料對香蕉枯萎病的防控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施用復(fù)合微生物肥料的CMF1、CMF2和CMF 3處理都明顯降低了香蕉枯萎病的發(fā)病率，3個處理的發(fā)病率分別降至60.00%，44.43%，26.67%；與對照相比，CMF1、CMF2和CMF3處理能夠顯著提高香蕉生物量，株高、莖圍、地下部和地上部鮮重的提高幅度為24.46%～109.11%，CMF3促生作用最佳，其次為CMF2、CMF1，推測功能不同的混合菌株效果優(yōu)于單一菌株，而單一菌株中BLG010菌株對香蕉生長的促進(jìn)效果優(yōu)于E16菌株，BLG010菌株分泌拮抗促生物質(zhì)的功效較E16菌株更佳，二者復(fù)配后功效最佳。

香蕉枯萎病的發(fā)生與發(fā)病程度均與根際尖孢鐮刀菌數(shù)量有相關(guān)性[5，25]，生防菌成功定殖是發(fā)揮功效的前提[5，26]。因此應(yīng)調(diào)控適合生防菌生長的土壤環(huán)境，提高其在土壤中的營養(yǎng)利用率和定殖水平，使其快速占據(jù)生態(tài)位點(diǎn)和分泌能有效抑制病原菌的代謝產(chǎn)物，從而降低土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量，這是控制枯萎病的有效途徑。本研究也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用3種復(fù)合微生物肥料后，香蕉根際的病原菌FOC數(shù)量下降了11.57%～49.07%，其中CMF3效果最佳，其次為CMF2，CMF1次之；CMF3較CMF1和CMF2提高了生防菌BLG010和E16的根際定殖量，分別提高了27.55%和32.80%；首次應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察，直觀地發(fā)現(xiàn)根際FOC呈現(xiàn)孢子畸形和體積減小，同時，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，香蕉枯萎病發(fā)病率與FOC數(shù)量正相關(guān)，BLG010和E16正相關(guān)。可能原因是施用復(fù)合微生物肥料后土壤有機(jī)質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)含量和C/N等處于均衡狀態(tài)，促進(jìn)了BLG010和淡紫擬青霉E16對有機(jī)質(zhì)、肥料和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)利用和增殖，形成優(yōu)勢菌群，達(dá)到競爭和分泌活性物質(zhì)、抑制病原菌FOC和控制病害的目的，同時表明施用復(fù)合微生物肥料對香蕉根際病原菌、生防菌等土壤微生物種群的影響是復(fù)雜的。

單一菌株制劑或有機(jī)肥對土傳病害的防治效果不穩(wěn)定，難以應(yīng)用于田間環(huán)境，含有拮抗菌株芽孢桿菌的生物有機(jī)肥顯著降低香蕉枯萎病發(fā)病率[13，15，26]，促進(jìn)香蕉生長，增加土壤細(xì)菌豐度，降低病原菌豐度[26]。本研究選擇功能不同的2株高效生防菌株與有機(jī)肥等營養(yǎng)復(fù)配制備新型復(fù)合微生物肥料，補(bǔ)充生防菌株在土壤中定殖和分泌活性物質(zhì)所需的關(guān)鍵營養(yǎng)，減少了病害發(fā)生，同時提供香蕉生長所需養(yǎng)分，與前人研究結(jié)果（生物有機(jī)肥優(yōu)于傳統(tǒng)的生防菌株制劑或有機(jī)肥）一致。本研究限于盆栽試驗(yàn)，田間應(yīng)用效果還有待評價，同時復(fù)合微生物肥料中的淡紫擬青霉和枯草芽孢桿菌在土壤中競爭營養(yǎng)物質(zhì)、占據(jù)生態(tài)位點(diǎn)和分泌抑菌物質(zhì)的協(xié)同防病機(jī)理還需深入研究。

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