Leber先天性黑曚患者臨床特征與基因篩查

董 嬙，張 華

(1濟(jì)南市第八人民醫(yī)院，山東濟(jì)南250013;2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京100730)

Leber先天性黑曚患者臨床特征與基因篩查

董 嬙1，張 華2

(1濟(jì)南市第八人民醫(yī)院，山東濟(jì)南250013;2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京100730)

目的:對(duì)Leber先天性黑矇的臨床表現(xiàn)以及遺傳學(xué)特點(diǎn)予以分析，并對(duì)已知的和可能存在的致病基因突變位點(diǎn)進(jìn)行篩查研究．方法:以56例Leber先天性黑矇患者為研究對(duì)象，收集其臨床資料．使用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)將Lerber先天性黑矇致病相關(guān)致病基因視網(wǎng)膜色素上皮基因(RPE65)和卵磷脂視黃醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因(LRAT)中的全部外顯子與外顯子-內(nèi)含子接會(huì)處進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序分析致病的突變基因．結(jié)果:對(duì)56例患者行RPE65基因十四個(gè)外顯子和LRAT基因三個(gè)外顯子的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了7處單核苷酸多態(tài)性改變．結(jié)論:由于Leber先天性黑曚的臨床表現(xiàn)具有多樣性，其診斷有賴于癥狀和眼底表現(xiàn)以及各項(xiàng)輔助檢查．本組56例患者可能與RPE65外顯子和LRAT外顯子突變無(wú)關(guān)．不同患者均發(fā)現(xiàn)同一位點(diǎn)的同樣單核苷酸多態(tài)性的改變，具有一定的臨床價(jià)值和基礎(chǔ)研究意義，應(yīng)增加樣本量對(duì)蛋白功能進(jìn)一步分析．

視網(wǎng)膜色素上皮基因;卵磷脂視黃醇?；D(zhuǎn)移酶基因;Leber先天性黑曚;突變;基因

0 引言

Leber先天性黑矇(leber congenital amurasis，LCA)屬于一種少見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，也有少數(shù)的顯性遺傳報(bào)道．其可導(dǎo)致嚴(yán)重的視網(wǎng)膜病變，約占遺傳性視網(wǎng)膜變性病變的5%，并且發(fā)病早，可導(dǎo)致10%～20%的兒童失明［1－2］．LCA的臨床表現(xiàn)呈多樣性，可導(dǎo)致嬰幼兒先天性失明，即出生時(shí)或出生后不久出現(xiàn)嚴(yán)重的視覺(jué)喪失，有畏光、眼球震顫、固視不能、指壓眼球等臨床表現(xiàn)，眼底早期可無(wú)明顯異常，隨病程進(jìn)展眼底周?chē)沙霈F(xiàn)椒鹽樣的色素沉積，視網(wǎng)膜血管狹窄，引起脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的萎縮．視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)檢測(cè)到波幅平緩甚至消失等表現(xiàn)．除此之外，患者常伴有神經(jīng)系統(tǒng)功能異常、肥胖、代謝系統(tǒng)疾病等嚴(yán)重的并發(fā)癥，還可能出現(xiàn)圓錐角膜、白內(nèi)障等異常表現(xiàn)［3－4］．目前研究顯示，LCA可由包括編碼視網(wǎng)膜色素上皮特異性65 kD 蛋白［retinal pigment epithelial(cell)65，RPE65］、磷脂酰膽堿在卵磷脂-視黃醇酰基轉(zhuǎn)移酶(lecithin retinol acyltransferase，LRAT)［5］在內(nèi)的多種不同基因突變所致．LCA具有遺傳的異質(zhì)性，所編碼的蛋白質(zhì)是催化全反式視黃醇轉(zhuǎn)變成11-順式視黃醇的異構(gòu)酶之一，后者再經(jīng)過(guò)一系列代謝轉(zhuǎn)變成視紫紅質(zhì)，參與光信號(hào)的傳導(dǎo)過(guò)程．11-順視黃醛在視網(wǎng)膜色素上皮層(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)由全反式視黃醇轉(zhuǎn)變而來(lái)．通過(guò)內(nèi)吞作用攝取感光細(xì)胞內(nèi)的全反式視黃醇和從脈絡(luò)膜中吸收的類(lèi)胡蘿卜素經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化而變?yōu)槿词揭朁S醇兩種方式，再轉(zhuǎn)變成為RPE細(xì)胞內(nèi)的全反式視黃醇［6］．類(lèi)胡蘿卜素從脈絡(luò)膜轉(zhuǎn)運(yùn)至 RPE后，在RPE65的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)槿词揭朁S醛，后者在與LRAT的催化下經(jīng)過(guò)酯化反應(yīng)生成全反式視黃酯，進(jìn)而在視黃酯水解酶(retinyl ester hydrolase，REH)與視黃醇結(jié)合蛋白 1(cellular retinol-binding protein，CRBP1)的催化下生成全反式視黃醇．RPE65基因和LRAT基因都是導(dǎo)致LCA的常見(jiàn)基因．本文應(yīng)用PCR對(duì)RPE65以及LRAT基因進(jìn)行突變基因的篩查分析，對(duì)LCA的病因產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行更為深入的了解，為臨床中該病的診斷提供幫助．

1 資料和方法

1．1 一般資料 本研究以位于北京、泰安、蘭州盲校的LCA患者以及在北京協(xié)和醫(yī)院眼科門(mén)診治療的散在患者共計(jì)56例為研究對(duì)象．所有研究對(duì)象經(jīng)檢查排除其他的遺傳性疾病或先天性異常．

1．2 方法 對(duì)56例研究對(duì)象采集外周靜脈血進(jìn)行DNA提取，篩查突變基因．本實(shí)驗(yàn)所涉及到的RPE65和LRAT兩個(gè)基因的引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，其分子量計(jì)算公式如下:MW=(A堿基數(shù)× 312)+(C堿基數(shù)×288)+(G堿基數(shù)×328)+(T堿基數(shù)×303)－61．將RPE65與LRAT基因的引物序列送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成．引物合成后，應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)兩個(gè)基因的外顯子及外顯子-內(nèi)含子交接區(qū)域進(jìn)行DNA擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物使用2%的聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定分析．然后將上述擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)至北京華大基因研究中心以及天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司，以PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增DNA，提純DNA后再進(jìn)行基因測(cè)序．

應(yīng)用 NCBI的 BLAST 2 seqences和 UCSC的BLAT search，對(duì)比Genbank中的原始基因序列和測(cè)序結(jié)果的序列，分析已獲取的序列圖譜，從而確認(rèn)是否存在基因突變．如果檢測(cè)到存在基因突變，則首先對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析，確認(rèn)該位點(diǎn)是否為已知的正常多態(tài)位點(diǎn);然后查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究文獻(xiàn)，確認(rèn)該位點(diǎn)是否已經(jīng)過(guò)研究報(bào)道;最后，若確認(rèn)為新的突變位點(diǎn)，則仍需對(duì)至少50名與該患者無(wú)任何血緣關(guān)系的正常人進(jìn)行該位點(diǎn)的PCR檢測(cè)、測(cè)序，以確認(rèn)是否為未知群體多態(tài)性所致．

2 結(jié)果

2．1 臨床表現(xiàn) 收集北京協(xié)和醫(yī)院眼科門(mén)診治療的15例LCA患者的臨床資料，包括患者初診時(shí)的年齡、性別及符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的主要臨床癥狀(畏光、夜盲)、視力、屈光狀態(tài)、眼球內(nèi)陷、指眼征、眼底檢查、初始診斷(表1)．

表1 15例LCA患者的臨床資料

2．2 Leber先天黑曚RPE65基因的突變結(jié)果 所有研究對(duì)象的測(cè)序結(jié)果中均未發(fā)現(xiàn)基因異常序列，但發(fā)現(xiàn)其中存在4處單核苷酸多態(tài)性的改變(表2)．

表2 RPE65基因檢測(cè)的單核苷酸多態(tài)性改變

測(cè)序結(jié)果顯示56例患者中有一例患者的RPE65基因中的3號(hào)外顯子的cDNA278位的甘氨酸被谷氨酸所取代(G278A)，密碼子由GGA變?yōu)镚AA．RPE65基因exon-3 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果(部分)見(jiàn)圖1．

圖1 RPE65基因3號(hào)外顯子的測(cè)序結(jié)果

在RPE65基因中10號(hào)內(nèi)含子的改變?yōu)镚AA 352 GAG，56名受檢者中共發(fā)現(xiàn)了26名有該改變．RPE65基因exon-10 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果(部分)見(jiàn)圖2．

圖2 RPE65基因10號(hào)外顯子的測(cè)序結(jié)果

在RPE65基因中12號(hào)內(nèi)含子的改變?yōu)镮VS12+ 20a/c，56名受檢者中共發(fā)現(xiàn)了 27名有該改變．RPE65基因exon-12 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果(部分)見(jiàn)圖3．

圖3 RPE65基因12號(hào)外顯子的測(cè)序結(jié)果

在RPE65基因中14號(hào)內(nèi)含子的改變?yōu)镃^A Ins AG，56名受檢者中共發(fā)現(xiàn)了9名有該改變．RPE65基因exon-14 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果(患者正向測(cè)序結(jié)果)見(jiàn)圖4．

圖4 RPE65基因14號(hào)外顯子的測(cè)序結(jié)果

2．3 Leber先天黑曚LRAT基因的突變結(jié)果 所有研究對(duì)象的測(cè)序結(jié)果中均未發(fā)現(xiàn)基因異常序列，但發(fā)現(xiàn)其中存在2處單核苷酸多態(tài)性的改變(表3)．

表3 LRAT基因檢測(cè)的單核苷酸多態(tài)性改變

56例患者中有5例測(cè)序結(jié)果顯示在LRAT基因中2a號(hào)內(nèi)含子的改變?yōu)镮vs2a-12t/c．LRAT基因exon-2a PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果(部分)見(jiàn)圖5．

圖5 LRAT基因2a號(hào)外顯子的測(cè)序結(jié)果

56例患者中發(fā)現(xiàn)11例測(cè)序結(jié)果顯示在LRAT基因中2b號(hào)內(nèi)含子的改變?yōu)镮vs2b-55c/a．LRAT基因exon-2b PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果(部分)見(jiàn)圖6．

圖6 LRAT基因2a號(hào)外顯子的測(cè)序結(jié)果

3 討論

LCA是一種少見(jiàn)的視網(wǎng)膜遺傳性疾病，通常發(fā)病早、病情重，具有臨床表現(xiàn)的多樣性和遺傳異質(zhì)性，病因與多種因素有關(guān)．根據(jù)目前的研究顯示，14個(gè)已知的基因和尚未明確與發(fā)現(xiàn)的多種基因的突變均與該病的發(fā)生有關(guān)．其中RPE65與LRAT基因都是引起LCA的常見(jiàn)突變基因．RPE65基因編碼RPE65蛋白，該蛋白是一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特有的特異性蛋白，分子量為65 kDa，位于LCA2位點(diǎn)(lp31)，廣泛表達(dá)于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中．該蛋白主要參與維生素A的代謝以及視紫紅質(zhì)的再生．因此RPE65突變的LCA患者易早期出現(xiàn)視錐細(xì)胞光感受器的缺失，說(shuō)明該基因同時(shí)參與視覺(jué)生色團(tuán)的產(chǎn)生，對(duì)視錐細(xì)胞的正常發(fā)育有重要作用．而當(dāng)早期出現(xiàn)明顯的視錐細(xì)胞光感受器缺失后，殘余結(jié)構(gòu)仍能維持多年的視錐結(jié)構(gòu)和功能，由此可以推斷，存在著其他重要的旁路可以影響視錐細(xì)胞光感受器的生存．LRAT是由230多個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量為26 kDa，其具有視黃醇催化合成功能，且能使細(xì)胞從循環(huán)中獲得視黃醛并存儲(chǔ)于肝星狀細(xì)胞的脂滴以及RPE的視網(wǎng)膜樣結(jié)構(gòu)中．LRAT位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，研究認(rèn)為其具有一個(gè)單跨膜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，N-端位于胞漿內(nèi)，C-端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)．真核細(xì)胞中，C-端的跨膜區(qū)對(duì)于LRAT的活性與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的靶向功能都具有十分重要的作用，而N-端的疏水區(qū)則對(duì)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的靶向功能或者酶活性的作用通常是非必須的，并且其氨基酸序列屬于非保守序列［7－8］．

LCA動(dòng)物模型的建立，有利于更好地理解基因缺陷在視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡中的作用，并且找到治療的方法．近年來(lái)關(guān)于RPE65的基因治療在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上的應(yīng)用取得顯著成效，為L(zhǎng)CA的臨床治療提供了新的研究方向［9－10］．RPE65基因治療僅在第一期臨床試驗(yàn)中取得良好的成效，可能是因?yàn)樵撏蛔冎饕挥谝暰W(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，易于藥物的轉(zhuǎn)入［11］．當(dāng)前，LCA (RPE65基因突變所致)基因治療項(xiàng)目已經(jīng)獲得美國(guó)政府及其他非營(yíng)利性基金會(huì)的援助．在北美以及歐洲，與RPE65基因突變相關(guān)的LCA患者已經(jīng)能夠獲得基因治療，其余基因突變型也處于臨床試驗(yàn)階段，為廣大患者提供了康復(fù)愿景．并且我國(guó)也加入到國(guó)際合作項(xiàng)目LCA基因治療的3期臨床研究中，可以為前期確診的患者提供免費(fèi)的基因治療．

目前在國(guó)內(nèi)對(duì)于LCA的誤診率很高，對(duì)該病進(jìn)行更多的認(rèn)識(shí)和了解具有重要的臨床意義．LCA給患者、其家庭及整個(gè)社會(huì)帶來(lái)的負(fù)擔(dān)是巨大的．LCA致病基因的發(fā)現(xiàn)為認(rèn)識(shí)視網(wǎng)膜的發(fā)育、生物化學(xué)、細(xì)胞學(xué)機(jī)制以及研究視網(wǎng)膜變性發(fā)病的機(jī)制提供了新的信息．成功的開(kāi)展RPE65基因突變所導(dǎo)致的LCA基因治療的臨床試驗(yàn)，具有劃時(shí)代的意義，給患者帶來(lái)了希望．本文通過(guò)對(duì)56例患者進(jìn)行臨床分析和基因測(cè)序后發(fā)現(xiàn)多處同一位點(diǎn)的同樣單核苷酸多態(tài)性的改變．我們?nèi)孕枋占嗟腖CA病例，進(jìn)一步研究中國(guó)LCA患者的基因型和臨床表型的相關(guān)性，為將來(lái)開(kāi)展基因治療提供依據(jù)．

［1］Scholl HP，Moore AT，Koenekoop RK，et al．Safety and proof-ofconcept study of oral QLT091001 in retinitis pigmentosa due to inherited deficienciesofretinalpigmentepithelial 65 protein (RPE65)or lecithin:retinol acyltransferase(LRAT)［J］．PLoS One，2015，10(12):e0143846．

［2］Cideciyan AV．Leber congenital amaurosis due to RPE65 mutations and its treatment with gene therapy［J］．Prog Retin Eye Res，2010，29(5):398－427．

［3］Mackay DS，Borman AD，Sui R，et al．Screening of a large cohort of leber congenital amaurosis and retinitis pigmentosa patients identifies novel LCA5 mutations and new genotype-phenotype correlations［J］．Hum Mutat，2013，34(11):1537－1546．

［4］睢瑞芳，趙 潺，董方田，等．Leber先天黑矇的臨床研究［J］．中華眼底病雜志，2009，25(6):443－446．

［5］Leber T．Ueber retinitis pigmentosa und angeborene Amaurosis［J］．Archiv für Ophthalmologie，1869，15(3):1－25．

［6］Koenekoop RK，T raboulsi EI．Leber's congenital amaurosis，stargardt disease，and pattern dystroph ies．In:T raboulsi EI．Genetic D iseases of the Eye［M］．New York:Oxford University Press Inc 1998:3732387．

［7］Rozet JM，Perrault I，Gerber S，et al．Complete abolition of the retinal-specific guanylyl cyclase(retGC-1)catalytic ability consistently leads to leber congenital amaurosis(LCA)［J］．Invest Ophthalmol Vis Sci，2001，42(6):1190－1192．

［8］Ikeda A，Naggert JK，Nishina PM．Genetic modification of retinal degeneration in tubby mice［J］．Exp Eye Res，2002，74(4):455－461．

［9］Zernant J，Külm M，Dharmaraj S，et al．Genotyping microarray (disease chip)for Leber congenital amaurosis:detection of modifier alleles［J］．Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46(9):3052－3059．

［10］den Hollander AI，Roepman R，Koenekoop RK，et al．Leber congenital amaurosis:genes，proteins and disease mechanisms［J］．Prog Retin Eye Res，2008，27(4):391－419．

［11］Perrault I，Delphin N，Hanein S，et al．Spectrum of NPHP6/ CEP290 mutations in Leber congenital amaurosis and delineation of the associated phenotype［J］．Hum Mutat，2007，28(4):416．

Clinical characteristics and genetic screening of patients with Leber congenital amaurosis

DONG Qiang1，ZHANG Hua2

1The Eighth People's Hospital of Jinan，Jinan 250013，China;2Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing 100730，China

AIM:To analyze the clinical manifestations and genetic characteristics of Leber's congenital amaurosis(LCA)and investigate the known and potential pathogenic gene mutation sites．METHODS:A total of 56 cases of LCA patients were selected as the objects of study，and their clinical data were analyzed．The retinal pigment epithelium gene 65(RPE65)and the leucovide retinol acyltransferase gene(LRAT)are the members of LCA．All exons and connections between exon and intron of these two genes RPE65 and LRAT were amplified by polymerase chain reaction(PCR)，then their sequences were detected and analyzed to explore the related mutant genes．RESULTS: Fourteen exons of RPE65 gene and three exons of LRAT gene were detected in 56 patients，and seven single nucleotide polymorphisms were found．CONCLUSION:Because of the diversified clinical manifestations of LCA，the diagnosis depends on the symptoms，fundus manifestations and the auxiliary examinations．A total of 56 patients with LCA in the study may be irrelevant to exons'mutation of RPE65 and LRAT．However，we found that the same changing site of the single nucleotide polymorphisms were contained in all the 56 patients．This finding provide potential clinical values for the disease of LCA．

retinal pigment epithelium gene;lecithin retinol acyltransferase gene;Leber congenital amaurosis; mutation;gene

Q344+．12

A

2095-6894(2017)08-20-04

2017－01－19;接受日期:2017－02－03

科技部國(guó)際合作項(xiàng)目(2010DFB33430);美國(guó)防盲協(xié)會(huì)(CD-CL-0808-0470-PUMCH)

董 嬙．E-mail:155189814@qq．com

張 華．博士，副研究員．研究方向:眼科學(xué)．E-mail:zhanghua．eye@163．com