慢性心力衰竭患者尿液雙向凝膠電泳技術的優化

侯麗娜，劉煒燁，賈小平，李 亮，李小溪

(南方醫科大學南方醫院健康管理中心，廣東廣州510515)

慢性心力衰竭患者尿液雙向凝膠電泳技術的優化

侯麗娜，劉煒燁，賈小平，李 亮，李小溪

(南方醫科大學南方醫院健康管理中心，廣東廣州510515)

目的:分析慢性心力衰竭患者尿液雙向電泳技術的影響因素以提高其分辨率及穩定性．方法:采用超濾法富集并濃縮尿液蛋白，Bradford法測濃度后進行雙向電泳，凝膠經銀染顯色后，用Melanie 4軟件分析雙向電泳圖譜．分別對蛋白上樣量，聚焦參數等步驟進行優化．結果:超濾濃縮法，150 μg的上樣量，60 KVh的聚焦總伏特數，進行的雙向電泳圖譜分辨率高，穩定性好．結論:對上樣量和聚焦總伏特數優化后可獲得穩定性高和重復性好的慢性心力衰竭患者尿液雙向電泳圖譜，以便開展后續研究．

慢性心力衰竭;尿液;雙向凝膠電泳;蛋白質組

0 引言

慢性心力衰竭是一種復雜的臨床綜合征，其特點是心室充盈和/或射血能力受損從而導致心臟不能泵出足量的血液滿足機體的代謝需要．慢性心力衰竭發病率及死亡率逐年上升意味著沉重的公共衛生和社會經濟負擔［1］．在臨床中清楚地查明所有的致病因素常常是困難的．目前，在日常診療中運用的臨床、實驗室檢查和影像學標記物方法來診斷、預測和隨訪慢性心力衰竭患者常常是復雜的［2］．從尿液蛋白質組學整體水平出發，可能為慢性心力衰竭的診斷和預后提供了額外的預測價值，并有助于指導治療和發現治療新靶點，具有重要的意義．

尿液相比其他體液的蛋白質組學分析的臨床應用是一個新興的和有希望的研究領域，可以直接反映機體的狀態，尿液樣本容易獲取，而且獲取方式為非侵襲性，患者的配合度更高［3］．本研究運用雙向凝膠電泳技術對慢性心力衰竭患者與正常對照人群的尿液差異表達蛋白進行比較分析，以獲得慢性心力衰竭差異表達的蛋白質，可以更好地了解慢性心力衰竭的病理機制，具有重要的學術科研及臨床運用價值．然而，在雙向電泳過程中，影響等電聚焦和凝膠電泳的因素多種多樣，如樣品的處理、上樣量和聚焦參數的設定等．因此，本研究對其中的某些關鍵環節進行了反復對比優化處理，以獲得理想的雙向電泳圖譜．

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 樣品采集 40例健康對照人群來源于南方醫科大學南方醫院健康管理中心．40例患者為南方醫科大學南方醫院心內科住院患者，明確診斷為慢性心力衰竭．診斷標準參考最新中國心血管疾病診斷治療指南．本研究經該單位倫理委員會批準，研究對象均已知情并同意捐獻，簽訂知情同意書．兩組人群的基線資料(年齡、肌酐等)比較，差異無統計學意義(P＞0．05)．尿液標本要求清潔中段尿，2 h內轉移至－80℃冰箱并保存．

1．1．2 試劑 固相pH梯度干膠條(pH 3-10 L和NL，24 cm)、膠條緩沖液(pH 3－10)均為GE公司產品;15 mL超濾管購自Millipore公司;尿素、DTT、3-［3-(膽酰胺丙基)二甲氨基］丙磺酸內鹽、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、Acrylamide、礦物油、甘油、Glycine、Methylene double acrylamide和 Thiourea均為美國 Bio-Rad公司產品;Na2S2O3、AgNO3、C2H5OH、C2H4O2、Na2CO3、甲醛醋酸鈉均為國產分析純．1．1．3 儀器 YM-3超濾離心管(美國Millipore公司)、圖像分析軟件為Melanie 4試用版本、Milli-Q超純水儀購自Millipore公司、等電聚焦儀、垂直電泳系統均購自美國Bio-Rad公司、透射掃描儀為UMAX owerLook 100(美國Bio-Rad公司)．

1．2 方法

1．2．1 尿液蛋白樣品制備 從－80℃冰箱取出樣品混合，放置于冰上解凍后進行低溫超濾離心，超濾離心使用YM-3超濾離心管截留分子質量大于10 KD的各組尿液蛋白，采用Bradford方法測定蛋白濃度后，取離心管內液凍存．

1．2．2 雙向凝膠電泳分離總蛋白 按照如下分成四組進行實驗:150 μg蛋白樣品聚焦60 KVh組(IPG pH 3-10 NL，24 cm)，250 μg蛋白樣品聚焦60 KVh組(IPG pH 3-10NL，24 cm);150 μg蛋白樣品聚焦60 KVh組(IPG pH 3-10 NL，24 cm)，150 μg蛋白樣品聚焦50 KVh組(IPG pH 3-10 NL，24 cm)分別置于450 μL上樣緩沖液中充分混合，采取被動泡漲12 h，等電聚焦參數為100V 1 h，500V 1 h，1000 V 1 h，8 000 V 3 h，8 000 V 50/60 KVh，500 V 3 h．聚焦完畢后進行兩次平衡，隨后進行第二向凝膠電泳．

1．2．3 銀染 經過固定、敏化、染色、顯影等過程［4］．

1．2．4 圖譜分析 凝膠銀染結束后，用UMAX PowerLook 1100投射掃描儀對凝膠進行圖像掃描，并對其呈現的蛋白點進行分析．

1．3 統計學處理 實驗重復三次以上，數據以x ±s表示，計量資料兩組間均數的比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數資料則采用χ2檢驗，由統計軟件 STATA16．0完成．P＜0．05表示差異有統計學意義．

2 結果

2．1 研究對象一般資料比較 慢性心力衰竭患者和健康對照人群各40例樣本的尿液分別各自混合后，提取總蛋白，經過測定后進行雙向凝膠電泳．結果表明，慢性心力衰竭患者和正常對照人群基線資料(年齡、性別、尿液肌酐水平等)的差異無統計學意義(P＞0．05，表1)．

表1 雙向凝膠電泳研究的尿液標本 (n=40，x ±s)

2．2 不同上樣量對雙向凝膠電泳圖譜的影響 為了探索合理的上樣量，在參考相關尿液蛋白質組學文獻的基礎上［4－6］，本研究分別比較了150 μg和250 μg兩組上樣量雙向凝膠電泳圖譜．圖1A上樣量為250 μg，圖譜上有些蛋白點過飽和，許多蛋白質點融合在一起;掩蓋附近一些低豐度蛋白的表達，使其分辨率降低，且其圖染色背景較深．圖1B上樣量為150 μg，盡管蛋白上樣量較圖1A少，但整個圖譜效果明顯優于圖1A．雖然出現的蛋白點要少于圖1A，但大部分蛋白質點能夠清晰辨認，背景較為干潔，以便進行后續實驗．因此，后續實驗上樣量一般為150 μg．

圖1 不同上樣量的雙向電泳圖譜比較

2．3 不同聚焦參數總伏特數對雙向凝膠電泳圖譜的影響 聚焦的程序及總伏特數直接影響圖譜的質量．為了獲取理想的蛋白圖譜，本研究比較了聚焦總伏特數分別為50 KVh/60 KVh兩組實驗，即聚焦程序:100 V 1 h，500 V 1 h，1000 V 1 h，8 000 V 3 h，8 000 V 50/60 KVh，500 V 3 h．結果發現，聚焦總伏特數50 KVh組相應的蛋白圖譜的蛋白點少，橫條紋較多(圖2A);而聚焦總伏特數60 KVh組的雙向凝膠電泳圖譜上不僅蛋白點較多，而且橫條紋也大大減少(圖2B)，分離效果較好，有利于開展后續實驗．因此，60 KVh的聚焦總伏特數是合理的．

圖2 不同聚焦總伏特數的雙向電泳圖譜比較

3 討論

慢性心力衰竭是一種心血管疾病常見的臨床綜合征，伴有心肌結構和功能發生改變、心室泵血功能降低，是多種心臟病潛在的終末期表現．慢性心力衰竭的病因復雜，病理機制尚無統一的認識，不同的病因學說解釋了心臟疾病如何進展到慢性心力衰竭，包括心肌缺血、高血壓、糖尿病、心臟瓣膜病、心律失常和遺傳性心肌病［7－9］．然而，在臨床中清楚地查明所有的致病因素常常是困難的．

現在使用的許多生物標記物只能描述一部分病理特點，不能夠全面整體地闡述疾病．蛋白質組學可以從整個蛋白質動態變化的水平研究疾病的變化，是當前篩選疾病差異表達蛋白，尋找疾病標志物及發現藥物治療新靶標有力工具．尿液相比血液、唾液等其他體液的蛋白質組學分析的臨床應用是一個新興的和有希望的研究領域，可在一定程度上反映血液和整個機體的狀態．運用尿液蛋白質組學分析法識別蛋白質/多肽生物標記物可能為診斷、預測、指導治療和新療法的發展提供了一種新的形式;同時尿液樣本易于收集，且對人體無創，這可能具有利于診斷和預后預測的價值，并有助于指導治療和發現治療新靶點［10－12］．以前的研究運用尿液蛋白質組學分析法來識別針對冠心病和亞臨床期左心室舒張功能不全的尿液多肽生物標記物．這些生物標記物被用來建立特定疾病的分類［13］．但此方法尚未廣泛應用于慢性心力衰竭．Lemesle等［14］報道了將蛋白質組學應用于射血分數相關型患者管理的潛在獲益，即血漿多種標記物蛋白質表達譜可預測慢性心衰患者的心血管事件死亡率．基于尿液蛋白質組分析可用來篩選慢性心力衰竭相關性尿液多肽標記物的一種敏感工具，這些多肽標記物有可能幫助我們進一步理解和診斷心力衰竭．本研究正是從慢性心力衰竭的尿液蛋白組學的立足點出發，以期篩選出慢性心力衰竭密切相關的差異表達蛋白，希望可直接了解慢性心力衰竭的發病機制及探索臨床診療的新思路．蛋白質組學關鍵目的是分離并篩選出盡可能多的蛋白質，以便后續質譜鑒定出盡可能多的不同種蛋白質．因此，研究影響等電聚焦和雙向電泳的關鍵因素是重要內容，可為后續的實驗研究奠定殷實的基礎．

實驗過程中加入蛋白抑制劑抑制蛋白酶的活性，盡量保證蛋白的完整性．為了提高分辨率和相對分子質量較高蛋白質的分離，對比150 μg和250 μg兩組上樣量，結果顯示150 μg的上樣量可以明顯地檢測出低豐度蛋白，同時還可以避免低豐度蛋白被高豐度蛋白掩蓋．此外，本研究還觀察了不同聚焦總伏特數對雙向電泳圖譜的影響，對比發現當聚焦總伏特數不夠時，尿液中的蛋白到達不了相應的等電點部位，電泳圖譜上的蛋白點較少，還會在雙向電泳圖譜上出現顏色較深的橫條紋．通過對比發現60 KVh的聚焦總伏特數是適度的，圖譜上可以看到不僅蛋白點較多，而且橫條紋也大大減少［15］．值得引起注意的是，因尿液PH值偏酸性(6．0～7．0)，在2-DE的實驗過程中本研究使用了pH 3－10非線性(NL)的膠條，因為該膠條不僅相對增大pH 4－7段的長度以更好分離此區間的蛋白點，還能夠兼顧檢測標本蛋白總體情況，包括堿性段的蛋白［16］．

綜上所述，為更好地開展慢性心力衰竭的尿液蛋白質組學研究，我們認為采用超濾的方法，150 μg的上樣量，60 KVh的聚焦參數，使用非線性的IPG膠條可以得到理想的雙向電泳圖譜，有助于分離、篩選出相關差異表達蛋白質．

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Optimization of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis on urine samples from patients with chronic heart failure

HOU Li-Na，LIU Wei-Ye，JIA Xiao-Ping，LI Liang，LI Xiao-Xi
Department of Healthy Mangement，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China

AIM:To analyze the influence factors of two-dimensional electrophoresis(2-DE)on urine samples from the patients with chronic heartfailure and improve the resolution and stability of 2-DE map．METHODS:After using the method of ultrafiltration，the 2-DE was conducted after measuring the concentration of the total protein by Bradford method．The gel was scanned and analyzed by Melanie 4 following silver staining．We improved the sample volume of proteins，focus parameters and other related steps to optimize the 2-DE．RESULTS:We could successfully obtain a higher resolution and reproducible 2-DE image with ultrafiltration，protein loaded with 150 μg and focus voltage with a total of 60 KVh．CONCLUSION:The well-established 2-DE map on urine samples of chronic heart failure patients made by 2-DE is useful in studying the mechanism and treatments of chronic heart failure．

chronic heart failure;urine;two-dimensional gel electrophoresis(2-DE);proteome

R541．6+1

A

2095-6894(2017)08-41-03

2017－02－10;接受日期:2017－02－26

廣東省科技廳科技計劃項目(2016zc0078)

侯麗娜．博士，主治醫師．研究方向:心血管及泌尿系統疾病健康管理．E-mail:1175024441@qq．com

李小溪．博士，主治醫師．E-mail:ursin7872@fmmu．com