脂肪酶在催化酯交換過程中的穩定性

李成,王勝杰,季敏,黃清吉,黃仕群,翁新楚

(1.上海大學環境與化學工程學院,上海200444;2.上海大學生命科學學院,上海200444; 3.大馬棕櫚油技術研發(上海)有限公司,上海201108)

脂肪酶在催化酯交換過程中的穩定性

李成1,王勝杰2,季敏3,黃清吉3,黃仕群3,翁新楚2

(1.上海大學環境與化學工程學院,上海200444;2.上海大學生命科學學院,上海200444; 3.大馬棕櫚油技術研發(上海)有限公司,上海201108)

脂肪酶是一種能夠在非水相體系中催化酯交換的生物酶.在實際應用過程中,脂肪酶的穩定性非常重要,因為這會直接影響工業化的成本和效率.針對溫度、時間、溶劑和酰基供體對脂肪酶催化酯交換反應穩定性的影響進行了系統的研究.結果表明,溫度和溶劑極性對脂肪酶催化穩定性的影響比較顯著,而時間和酰基供體的影響不明顯.

脂肪酶;酯交換;穩定性

脂肪酶(lipase,E.C.3.1.1.3)是一種既能在水相中水解長鏈酯類化合物,又能在非水相中催化酯類合成反應或者酯交換反應的酶類[1].它是一種重要的工業酶類,常用于油脂水解、食品風味和香味的改進、醫療醫藥、皮革絹紡脫脂、低等油脂的改性,以及添加于洗滌劑和化妝品中等[2-3].特別是在油脂化工和有機合成工業中,酶催化的反應具有條件溫和、耗能低、原料要求低、成品質量高等優點,尤其是1,3-專一脂肪酶可用于特殊脂肪酸、單甘酯的合成及立體選擇性化學合成和拆分,具有巨大的應用潛力[4-6].

在酶法制備類可可脂的研究中,脂肪酶一直是各國科研工作者研究的熱點[7-10].本工作主要研究了脂肪酶在催化酯交換反應制備類可可脂過程中的穩定性,系統地分析了溫度、時間、溶劑、酰基供體等對脂肪酶穩定性的影響.

1 實驗材料與方法

1.1 材料與試劑

棕櫚油中間分提物、硬脂酸,由大馬棕櫚油技術研發(上海)有限公司贈送.脂肪酶LipozymeTLIM,購自諾維信(中國)有限公司.正己烷、丙酮、乙醚等均為分析純,購自中國醫藥集團上海化學試劑有限公司.

1.2 實驗儀器

TECHCOMP7890F氣相色譜儀(上海天美科學儀器公司),BSA224S-CW電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司),DK-S12電熱恒溫水浴鍋(上海華連醫療器械有限公司), RE-85Z旋轉蒸發器(上海青浦滬西儀器廠),MYP11-2恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀表制造有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 脂肪酶酯交換活力

在一定條件下每分鐘交換1μmol硬脂酸需要的酶量定義為1個脂肪酶活力單位(U).

稱取4.0 g橄欖油和4.0 g硬脂酸于100mL三頸燒瓶中.加入10.0mL正己烷,置于恒溫磁力攪拌器上,溫度為55?C,轉速為300 r/min.待溫度穩定后加入1.0 g脂肪酶,并開始計時.5 min后趁熱過濾去除脂肪酶以終止反應.分離提純甘油三酯,利用氣相色譜檢測酯交換進入橄欖油中的硬脂酸含量.

脂肪酶酯交換活力計算公式為

式中:X為脂肪酶酯交換活力,U/g;M為橄欖油脂肪酸摩爾量,μmol;ΔST為酯交換的硬脂酸占總脂肪酸的比例,%;m為脂肪酶的質量,g;T為反應時間,min.

1.3.2 溫度對脂肪酶穩定性的影響

稱取4.0 g棕櫚油中間分提物和4.0 g硬脂酸于100 mL三頸燒瓶中.加入10.0 mL正己烷和1.0 g脂肪酶,分別在45,50,55,60,65和70?C下連續反應60 h后,過濾出酶.用正己烷沖洗干凈,檢測脂肪酶酯交換活力.

1.3.3 時間對脂肪酶穩定性的影響

稱取4.0 g棕櫚油中間分提物和4.0 g硬脂酸于100 mL三頸燒瓶中.加入10.0 mL正己烷和1.0 g脂肪酶,在55?C下分別反應4,8,12,24,36,48和60 h后,過濾出酶.用正己烷沖洗干凈,檢測脂肪酶酯交換活力.

1.3.4 溶劑對脂肪酶穩定性的影響

稱取4.0 g棕櫚油中間分提物和4.0 g硬脂酸于100 mL三頸燒瓶中.加入1.0 g脂肪酶,分別加入10.0 mL正己烷、石油醚、甲苯和丙酮,在55?C條件下反應60 h后,過濾出酶.用正己烷沖洗干凈,檢測脂肪酶酯交換活力.

1.3.5 酰基供體對脂肪酶穩定性的影響

稱取4.0 g棕櫚油中間分提物.分別稱取4.0 g酰基供體(硬脂酸、硬脂酸甲酯)于100mL三頸燒瓶中.加入1.0 g脂肪酶,10.0mL正己烷在55?C條件下反應60 h后,過濾出酶.用正己烷沖洗干凈,檢測脂肪酶酯交換活力.

2 實驗結果與討論

2.1 溫度對脂肪酶穩定性的影響

圖1表示脂肪酶在不同反應溫度下,連續催化棕櫚油中間分提物與硬脂酯交換反應60 h后,相對酯交換活力的變化情況.可以看出,當反應溫度不高于55?C時,脂肪酶在連續催化60 h后相對酯交換活力變化不是很明顯,說明酶活力的損失很小,相對酯交換活力達到97.3%.但是當反應溫度高于55?C時,脂肪酶的相對酯交換活力就出現明顯的下降趨勢.當反應溫度達到70?C時,60 h后脂肪酶的相對酯交換活力只有67.9%,說明脂肪酶的酯交換活力已經出現較大程度的下降.可見,溫度對脂肪酶催化酯交換反應的穩定性具有較大影響.在實際應用中,應該盡量使用較低的反應溫度,這樣既可以避免脂肪酶的失活,也可以降低能耗,節約成本.

圖1 脂肪酶在不同反應溫度下連續催化酯交換反應60 h后的相對酯交換活力Fig.1 Relative interesterification activities of lipase at diff erent reaction temperatures for 60 h after catalytic interesterifi cation reactions

2.2 反應時間對脂肪酶穩定性的影響

脂肪酶催化酯交換穩定性最重要的指標就是能夠在一定反應溫度條件下,經過長時間的連續酯交換反應而酯交換活力損失較小,這對實際生產應用具有極其重要的意義.本工作通過分析在不同反應溫度下反應時間對脂肪酶酯交換活力的影響來判斷脂肪酶的穩定性.由圖2可以看出,脂肪酶在相對較低的溫度條件下,催化酯交換反應的穩定性明顯優于較高的反應溫度條件,脂肪酶在低于60?C的酯交換反應溫度下的穩定性顯著優于60?C以上.在55?C反應溫度下經過連續反應60 h后,相對活力僅下降2.7%,而在70?C反應溫度下,相對活力下降的速率明顯加快,達到了32.1%.反應時間對脂肪酶有一定的影響,當催化體系的溫度保持相對較低的時候,脂肪酶的酯交換活力損失較少.隨著催化體系溫度的升高,脂肪酶的酯交換活力損失開始快速減少.因此,在實際生產中要控制好整個反應體系的溫度,以防溫度過高使脂肪酶失活.

2.3 溶劑對脂肪酶穩定性的影響

本工作選取常用的幾種不同極性的有機溶劑作為脂肪酶催化酯交換反應的有機相溶劑.從圖3可以看出,溶劑極性越小,脂肪酶的穩定性就越高.在弱極性溶劑正己烷和石油醚反應體系中,脂肪酶連續催化酯交換反應60 h后的相對活力依然保持在97%以上,說明脂肪酶在弱極性溶劑中的穩定更高.這可能是由于在弱極性溶劑中,脂肪酶的三維結構比較穩定,不易出現失活.在極性溶劑丙酮中脂肪酶的相對酯交換活力下降速率明顯高于弱極性溶劑,經過0 h連續反應后的相對酯交換活力降至56.9%.這可能是由于極性溶劑中的質子會影響脂肪酶酶活中心的氫鍵,從而導致脂肪酶的酯交換活力下降.

圖2 脂肪酶在不同反應溫度下連續催化酯交換反應的相對酯交換活力隨時間的變化Fig.2 Changes of the relative interesterification activities of lipase at diff erent reaction temperatureswith diff erent time in the caltalytic interesterification reactions

圖3 脂肪酶在4種不同溶劑系統中反應溫度為55?C下連續催化60 h后的相對酯交換活力Fig.3 Relative interesterification activities of lipase in 4 diff erent solvent systems after catalytic 60 h of continuous catalytic reaction under 55?C

2.4 酰基供體對脂肪酶穩定性的影響

本工作比較了硬脂酸和硬脂酸甲酯兩種酰基供體對脂肪酶催化酯交換反應過程中的穩定性的影響,結果如圖4所示.分析發現,酰基供體對脂肪酶催化穩定性的影響不明顯.進一步研究發現,雖然兩種不同酰基供體對脂肪酶催化穩定性沒有明顯影響,但是酰基供體硬脂酸甲酯的酯交換反應速率明顯高于硬脂酸.在實際應用中可以根據不同的需求選擇合適的酰基供體.

3 結束語

脂肪酶是催化酯交換反應中最重要的酶,因其具有立體專一性已被廣泛應用于食品、化工等領域.在實際生產應用中如何保持脂肪酶的穩定性是脂肪酶工程研究的重點.本工作針對溫度、時間、溶劑和酰基供體對脂肪酶催化酯交換反應過程中穩定性影響的研究,希望可以為脂肪酶的實際應用提供參考.研究發現,溫度和溶劑的極性對脂肪酶催化酯交換反應的穩定性影響最為顯著,其在相對低溫和弱極性溶劑中的穩定性最優,而高溫和極性溶劑對其穩定性影響顯著.因此,在實際生產應用過程中,應該盡量避免使用極性溶劑作為反應溶劑.酰基供體對脂肪酶催化穩定性的影響不明顯,但是不同的酰基供體對脂肪酶的酯交換反應速率有較大影響,以硬脂酸甲酯作為酰基供體的催化速率明顯高于以硬脂酸作為酰基供體.

圖4 脂肪酶在不同酰基供體下連續催化酯交換反應60 h后的相對酯交換活力Fig.4 Relative interesterifi cation activities of lipase after 60 h of continuous catalytic reaction in diff erent acyl donors

[1]王海雄,吳侯,翁新楚.活性炭吸附法固定豬胰脂酶的初步研究[J].上海大學學報(自然科學版), 2003,9(5):428-432.

[2]曹茜,馮鳳琴.微生物脂肪酶的研究進展及其在食品中的應用[J].中國食品學報,2013,13(10): 136-143.

[3]韋偉,馮鳳琴.sn-1,3位專一性脂肪酶在食品中的應用[J].中國糧油學報,2012,27(2):122-128.

[4]李品周,施碧紅,施巧琴.脂肪酶穩定性研究[J].化學與生物工程,2006,23(12):43-46,54.

[5]黃璜,李宗軍,王遠亮,等.各類微生物脂肪酶酶學性質及應用的研究進展[J].糧油食品科技,2014, 22(1):109-118.

[6]劉寧,汪勇,趙強忠,等.結構脂的構效關系及酶法制備的研究進展[J].食品工業科技,2012,33(10): 382-384,389.

[7]蘭立新,肖懷秋.微生物脂肪酶應用研究進展[J].安徽農業科學,2010,38(14):7547-7548,7561.

[8]談重芳,王雁萍,陳林海,等.微生物脂肪酶在工業中的應用及研究進展[J].食品工業科技,2006, 27(7):193-195.

[9]TAO Q,LI A,LIU X,et al.Improved thermal stability of lipase in W/O microemu lsion by temperature-sensitive polymers[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2013,111(1):587-593.

[10]PERIGNON M,LECOMTE J,PINAM,et al.Activity of immobilized Thermomyces lanuginosus and Candida antarctica B lipases in interesterifi cation reactions:eff ect of the aqueous microenvironment[J].Journal of the American Oil Chemists Society,2013,90(8):1151-1156.

Stab ility o f lipase in the process o f cataly tic in teresterifi cation reaction

LICheng1,WANG Shengjie2,JIMin3,OOIChengkeat3,WONG Sookhan3, WENG Xinchu2
(1.School of Environmental and Chemical Engineering,Shanghai University,Shanghai 200444,China; 2.School of Life Sciences,Shanghai University,Shanghai 200444,China; 3.PalmO il Research and Technical Service Institu te of MPOB,Shanghai 201108,China)

Lipase is a kind of enzyme that can catalyze interesterifi cation in a non-aqueous system.Stability of lipase is important in practical applications because of its eff ection of the production cost and effi ciency.To understand the influence of diff erent factors on catalytic stability of lipase,the eff ects of temperature,time,solvents and acyl donor on stability of lipase interesterifi cation are studied.The resu lts show that the eff ects of temperature and solvent polarity on catalytic stability of lipase are significant.But the eff ects of time and acy l donor are not obvious.

lipase;interesterification;stability

TS 201

A

1007-2861(2017)04-0623-05

DO I:10.12066/j.issn.1007-2861.1692

2015-09-08

翁新楚(1962—),男,教授,博士生導師,研究方向為油脂化學.E-mail:wxch@staff.shu.edu.cn