硫酸去氫表雄酮定量測定試劑盒（化學發光免疫分析法）的研制及性能評價

蘇立 賈晨路

硫酸去氫表雄酮定量測定試劑盒（化學發光免疫分析法）的研制及性能評價

蘇立★賈晨路

目的研制硫酸去氫表雄酮定量測定試劑盒（化學發光免疫分析法），并對其試劑盒性能進行評價。方法利用競爭抑制法，對原料進行篩選，建立硫酸去氫表雄酮定量測定試劑盒。并分別對本試劑盒的準確性、最低檢測限、線性、重復性、特異性、參考范圍及樣本對比方面進行評價。結果經過篩選，選用反應模式：磁微粒包被羊抗鼠IgG?鼠抗硫酸去氫表雄酮單克隆抗體?吖啶酯標記DHEAS?BSA；對此方法建立的試劑盒進行方法學評價，最低檢測限可達1.84μg/dL，線性在0～1 500μg/dL之間，相關系數r=0.999 8，準確度的回收率為105.38%，重復性均小于8%；建立了健康人參考范圍（女性：47.9～407.5μg/dL，男性 97.1～522.5μg/dL），與西門子 ADVIA Centaur測定結果顯著相關，線性方程為y=1.078 13+0.992 16x，相關系數r=0.994 7，2種試劑盒的測定結果具有較高的一致性。結論本研究建立的硫酸去氫表雄酮定量測定試劑盒（化學發光免疫分析法）各項性能均達到了臨床檢驗的要求，為國產化66硫酸去氫表雄酮定量測定試劑盒（化學發光免疫分析法）的研發奠定了基礎，有望用于臨床血清硫酸去氫表雄酮的檢測。

硫酸去氫表雄酮；化學發光免疫分析法；定量測定試劑盒

去氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA），3β?羥基?5?雄烯?17?酮，亦稱脫氫異雄酮。血清中脫氫表雄酮大部分以硫酸結合物（DHEA?S）的形式存在。DHEA?S主要來源于腎上腺皮質網狀帶，具有微弱的雄激素活性，是人體血循環中最為豐富的甾體物質［1］。

女性的DHEA?S幾乎全部來源于腎上腺皮質，是女性絕經前75%和絕經后100%的雄激素來源。在21～45歲月經正常的育齡女性中，血清DHEA?S與年齡呈負相關，可作為評估卵巢儲備功能的一項參考指標，為臨床診治提供參考［2?3］。而多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）患者血清中的DHEA?S與性激素結核球蛋白（sex hormone binding globulin，SHBG）之間存在負相關關系，聯合檢查對PCOS的診斷具有一定的參考價值［4］。

本研究的目的在于建立一種靈敏度、線性范圍、精密度等方面能夠與進口廠家試劑盒相近甚至是更好的試劑盒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG、鼠抗硫酸去氫表雄酮、兔抗硫酸去氫表雄酮、人工抗原DHEAS?BSA和吖啶酯均來自蘇州亞科科技股份有限公司；硫酸去氫表雄酮企業標準品、質控品由廣州市達瑞生物技術股份有限公司制備；伯樂質控品購自 Bio?Rad公司。

1.1.2 樣本

健康人群血清樣本及臨床血清樣本均來自鄭州大學第三附屬醫院。

1.1.3 儀器

全自動化學發光免疫分析儀，型號：Caris200，來源于廈門優邁科醫學儀器有限公司。

1.1.4 耗材

樣本杯、反應杯及槍尖均購自廈門優邁科醫學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 磁珠包被

磁微粒用 Binding Buffer（0.1 mol/L MES，pH=5）洗滌5次后加入新配置的活化劑活化30min；用Binding Buffer洗滌5次，加入抗體，室溫下反應16 h；用含2%BSA的Tris緩沖液洗滌兩次，定容后于2～8℃保存。

1.2.2 吖啶酯標記

將0.05 mg吖啶酯加入到0.5 mg DHEAS?BSA中，置于搖床上，室溫避光反應6 h；然后用葡聚糖凝膠色譜柱分離純化，流動相為PB（pH=6.3）。純化后于2～8℃保存。

1.2.3 全自動化學發光免疫分析實驗

1.2.3.1 包被羊抗鼠IgG二抗 向反應杯中加入樣本50μL、包被羊抗鼠IgG的磁微粒50μL、鼠抗硫酸去氫表雄酮單克隆抗體50μL，在37℃條件下反應14min，再加入按1∶5 000稀釋的吖啶酯標記的DHEAS?BSA，繼續在37℃條件下反應15min。用洗液清洗4遍后將反應杯內洗液全部吸出，加入預激發液 100μL，混合均勻，再加入 100μL 激發液并即刻檢測發光值。

1.2.3.2 包被羊抗兔IgG二抗 向反應杯中加入樣本50μL、包被羊抗兔IgG的磁微粒50μL、兔抗硫酸去氫表雄酮多克隆抗體50μL，在37℃條件下反應14min，再加入按1∶5 000稀釋的吖啶酯標記的DHEAS?BSA，繼續在37℃條件下反應15min。用洗液清洗4遍后將反應杯內洗液全部吸出，加入預激發液 100μL，混合均勻，再加入 100μL 激發液并即刻檢測發光值。

1.2.3.3 包被鼠單抗DHEA?S抗體 向反應杯中加入樣本50μL、包被鼠抗硫酸去氫表雄酮單克隆抗體的磁微粒50μL，在37℃條件下反應14min，再加入按1∶5 000稀釋的吖啶酯標記的DHEAS?BSA，繼續在37℃條件下反應15min。用洗液清洗4遍后將反應杯內洗液全部吸出，加入預激發液100μL，混合均勻，再加入100μL激發液并即刻檢測發光值。

1.2.3.4 包被兔多抗DHEA?S抗體 向反應杯中加入樣本50μL、包被兔抗硫酸去氫表雄酮多克隆抗體的磁微粒50μL，在37℃條件下反應14min，再加入按1∶5 000稀釋的吖啶酯標記的DHEAS?BSA，繼續在37℃條件下反應15min。用洗液清洗4遍后將反應杯內洗液全部吸出，加入預激發液100μL，混合均勻，再加入 100μL 激發液并即刻檢測發光值。

1.2.4 分析性能評價

1.2.4.1 最低檢測限 將零濃度校準品進行測定，重復測定20次，計算20次測定結果發光值的平均值（mean，M）和標準差（standard deviation，SD），得出M?2SD的發光值，根據零濃度校準品和相鄰校準品的濃度?發光值的結果進行兩點回歸擬合得出一次方程，將零濃度校準品的平均值M?2SD的發光值代入上述方程中，求出對應的濃度值，即為最低檢測限。

1.2.4.2 線性 將濃度接近線性范圍上限的高值樣本按一定比例稀釋為5個濃度，其中低值濃度樣本需接近線性范圍下限。每一濃度樣本均重復測試2次，計算其平均值，將結果平均值和稀釋比例用最小二乘法進行直線擬合，并計算線性相關系數r。

1.2.4.3 準確度 將濃度接近線性范圍上限（允許其濃度偏差為±20%）的硫酸去氫表雄酮樣品（A）加入到血清或其他相應基質的樣品B中，所加入A的體積宜不超過總體積（A+B）的10%，將樣品（A+B）重復測試2次并計算其平均值，根據公式（1）計算回收率R。

式中：R?回收率；V?樣品 A 液的體積；V0?樣品B液的體積；C?樣品B液加入A液后的檢測平均濃度；C0?樣品B液的檢測濃度；Cs?樣品A液的濃度。

1.2.4.4 重復性 將低、中、高濃度樣本各重復檢測10次，計算10次測量結果的平均值（M）和標準差（SD），計算公式為：變異系數（variable coeffi?cient，CV）CV=SD/M×100%。

1.2.4.5 分析特異性 測定一定濃度的DHEA、皮質醇、醛固酮、雌二醇，各檢測2次，并計算其交叉反應率。

1.2.5 參考值范圍建立

測定健康人群空腹血清，采用百分位數法建立本試劑盒健康人群空腹硫酸去氫表雄酮參考值范圍。

1.2.6 樣本比對

西門子公司的硫酸去氫表雄酮測定試劑盒（化學發光法）作為對照試劑，對臨床樣本進行測定，計算并分析本試劑盒測定結果與西門子對照試劑的相關性及一致性。

1.3 統計學方法

用OrigiPro 7.5對不同反應模式的濃度梯度DHEAS的劑量?反應擬合Hill曲線，選擇線性關系較好的曲線對應的反應模式。用最小二乘法將零濃度校準品和相鄰校準品及梯度濃度樣本的測定結果進行計算及分析，得到新建立試劑盒的最低檢測限及線性相關系數r。用SPSS 24.0分別將健康男性和健康女性的測定結果進行直方圖分析、百分數法和正態分布分析，得到健康男性和健康女性測值的直方圖、正態分布曲線及95%置信區間。

2 結果

2.1 反應模式的選擇

分別用羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、鼠抗硫酸去氫表雄酮單克隆抗體、兔抗硫酸去氫表雄酮多克隆抗體包被磁微粒，并用吖啶酯標記DHEAS?BSA，以競爭抑制法建立DHEA?S的化學發光免疫分析法，檢測濃度梯度的DHEA?S。將劑量?反應擬合Hill曲線，由表1結果可以看出，4個反應模式均顯示Hill曲線線性關系較好，其中磁微粒包被羊抗鼠IgG的線性關系為優，R2達到0.993 1。

表1 濃度與發光值的Hill曲線方程Table1 Hill curve equation of concentration and luminescence

2.2 分析性能評價

2.2.1 試劑盒定標與質量控制

試劑定標后分別測量企業質控品及第三方質控品，得到定標結果如圖1質控結果如表2所示，兩者結果均在質控標示范圍內，實驗結果準確可靠。

圖1 硫酸去氫表雄酮標準曲線Figure 1 Master curve of DHEA?S

表2 質控品測量結果Table 2 Measurement results of control

2.2.2 最低檢測限

根據零濃度校準品和相鄰校準品的濃度?發光值的結果進行兩點回歸擬合得出一次方程，將零濃度校準品的平均值M?2SD的發光值代入上述方程中，得到的結果如表3。

表3 最低檢測限檢測結果（n=20）Table 3 Measurement results of sensitivity（n=20）

2.2.3 線性

用濃度約為1 500μg/dL的高值樣本按一定比例稀釋為5個濃度，每一濃度樣本均重復測試2次，計算其平均值，將結果平均值和稀釋比例用最小二乘法進行直線擬合，得到曲線方程為：y=-0.002 15+0.000 7x，線性相關系數r=0.999 8，由此可知試劑在0～1 500μg/dL的測定范圍內線性相關性良好（見表4、圖2）。

表4 線性檢測結果Table 4 Measurement results of linearity

圖2 硫酸去氫表雄酮線性擬合Figure 2 Linear fitting of DHEA?S

2.2.4 準確度

將濃度接近1 500μg/dL的硫酸去氫表雄酮樣品 100μL（A）加入到 900μL 相應基質的樣品 B中，將樣品A、B和（A+B）重復測試2次并計算其平均值，根據公式（1）計算回收率R，結果見表5。

表5 準確度檢測結果Table 5 Measurement results of accuracy

2.2.5 重復性

用濃度分別為（25±5）μg/dL、（150±30）μg/dL和（1 000±200）μg/dL的樣本各重復檢測10次，計算10次測量結果的平均值（M）和標準差（SD），再計算變異系數（CV），結果顯示該試劑重復性良好，見表6。

表6 重復性檢驗結果（n=10）Table 6 Measurement results of repeatability（n=10）

2.2.6 分析特異性

測定一定濃度的 DHEA（4 000μg/dL）、皮質醇（10 000μg/dL）、醛固酮（5 000μg/dL）、雌二醇（5 000μg/dL），各檢測2次，得到測量濃度小于3μg/dL，其交叉反應率小，見表7。

表7 分析特異性Table 7 Result of analytical specificity

2.3 參考值范圍建立

本試劑盒對370例健康人血清樣本進行檢測，其中男性樣本177例，女性樣本193例，分別用SPSS 24.0軟件進行分析，并按照百分數法［5］對測定結果進行分布排序，得到正常人95%置信區間（女性：47.9～407.5μg/dL；男性：97.1～522.5μg/dL），結果如圖3、圖4所示。

2.4 樣本比對

測定218例樣本，與西門子公司的硫酸去氫表雄酮測定試劑盒（化學發光法）作測值進行比對，計算并分析本試劑盒測定結果與西門子對照試劑的相關性及一致性。

圖3 177例健康男性DHEAS測值直方圖Figure 3 Histogram of DHEAS in 177 health male

圖4 193健康女性DHEAS測值直方圖Figure4 Histogram of DHEAS in 193 health female

2種試劑測定結果線性相關方程為y=1.078 13+0.992 16x（斜率95%置信區間為0.985 15～0.999 17，P＜0.01），相關系數r=0.994 7（圖 4），由此可知兩者具有良好的相關性。

采用Bland?Altmen統計下方法對2種試劑測值進行分析，以2種試劑測值的平均值為橫坐標，2種試劑測值的比值為縱坐標，結果顯示兩者比值的均值為1.01，95%置信區間為（0.79～1.24），其中在95%置信區間外占總樣本數的4.13%（9/218）（圖5），由此分析2種試劑盒的測定結果一致性較高。

圖5 2種試劑樣本測值相關性散點圖Figure 5 The scatter plot of correlation analysis of 2 assays

圖6 2種試劑Bland?Altmen分析比對圖Figure 6 Bland?Altmen Plot assays with 2 reagents

3 討論

DHEA?S的檢測在臨床上具有重要的意義，而DHEA?S的定量測定方法有很多，其中以色譜法最為普遍。2015年Patrick等人［6］用色譜/串聯質譜法同時測定10種內源性類固醇激素；2017年Zang等人［7］開發了可以同時測定人血清中9種羥基雄激素及其結合物的方法——液相色譜?電噴霧串聯質譜法（liquid chromatogra?phy?mass spectrometry，LC?MS）。質譜、色譜等方法具有靈敏度、精密度和準確度高以及特異性好等優點，但由于儀器成本高昂，在普通的臨床檢驗中推廣應用成本非常高。為了有效降低檢測成本，有研究者通過聯合化學發光免疫分析法和LC?MS分析不同類型PCOS的雄激素水平，除有力證明血清睪酮、雄烯二酮、DHEA?S以及雌激素指數均為診斷PCOS高雄激素血癥的敏感指標外，也呈現了化學發光免疫分析法和LC?MS對PCOS高雄激素血癥的診斷具有一致性這一重要結果［8］。

上述的LC?MS和免疫診斷技術配合使用雖有效減少單純LC?MS應用所帶來的高成本、耗時長等缺點，但在現代臨床檢驗和生命科學研究中，單純的免疫診斷技術的使用更為普遍和易于推廣。免疫診斷技術的日新月異，使傳統的手工操作復雜，反應時間長，對環境污染性強的低端檢測技術逐步被新型的化學發光免疫分析技術所取代，化學發光免疫分析具有速度快，結果精確，靈敏度高等優點，通常可測定納克級或皮克級的化學成分。為腫瘤［9］、糖尿?。?0］、性腺分泌異常，甲狀腺功能障礙［11］等疾病提供了有力的診斷工具。本研究中建立的試劑盒同樣具有化學發光免疫分析的特點，最低檢測限可達1.84μg/dL，線性在10～1 500μg/dL之間（西門子、雅培：最低檢測限：3μg/dL；線性范圍：0～1 500μg/dL），相關系數r=0.999 8，準確度的回收率為105.38%，重復性均小于8%，并且與DHEA、皮質醇、醛固酮、雌二醇交叉反應值小于最低檢測限，特異性良好。

市場上硫酸去氫表雄酮的檢測以進口試劑盒為主，本文作者對各個進口廠家硫酸去氫表雄酮（化學發光免疫分析法）試劑盒的反應模式進行比較分析，可以看到除了與雅培包被抗DHEA?S抗體外，貝克曼包被山羊抗兔IgG二抗，羅氏、西門子2個進口廠家均采用磁珠包被鏈霉親和素的反應模式，該模式可以利用鏈霉親和素系統的信號放大作用達到更好的靈敏度。本研究在不同的反應模式中比較、選擇了與這幾個進口廠家不一樣的模式，該方法則是利用了二抗的信號放大作用，提高靈敏度，除此之外還可以使得標記和檢測更加靈活。

本研究新建立的試劑盒精密度、分析靈敏度和檢測范圍等性能與進口廠家相比，有很大的競爭優勢。為更好地滿足臨床檢測的需要，本文作者未來將對該試劑盒進行覆蓋線性范圍的大量樣本進行檢測和比對，并研究該試劑盒的各項穩定性進行驗證和評估，有望替代國外昂貴試劑應用于臨床檢測。

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Development and evaluation of a quantitative assay for dehydroepiandros?terone sulfate:chemiluminescence immunoassay

SU Li★，JIA Chenlu
（The Neonatal Disease Screening Center,The Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan，China，450052）

ObjectiveTo develop and evaluate the performance of the Dehydroepiandrosterone sulfate quantitative determination kit:chemiluminescent immunoassay.MethodsThe method of competitive inhibition was used to screen the raw materials and to establish the Dehydroepiandrosterone sulfate quantitative determination kit with chemiluminescent immunoassay.The performance of accuracy,limit of detection,lineari?ty,repeatability,analytical specificity,reference interval and samples comparison were determined.ResultsAfter screening,the reaction mode of magnetic particle coated goat anti mouse IgG?mouse anti DHEAS antibody?acridine ester labeled DHEAS?BSA was selected.The limit of detection was less to 1.84μg/dL.This assay was designed to be linear across the measurement range of 0～1 500μg/dL with valuer=0.999 8.The recovery rate was 105.38%.The repeatability was less than 8%.The DHEAS reference interval of healthy population was established(female:47.9～407.5μg/dL,male:97.1～522.5μg/dL).The determination results of serum samples were significantly correlated with results tested by SIEMENS ADVIA Centaur assay with the linear equation was y=1.078 3+0.992 16x and the valuer=0.994 7.The results of these 2 assays showed high consistency.ConclusionAll the performance characteristics of this kit reached the requirements for clinical detection andlaid a foundation for establishing the domestic quantitative assay of dehydroepiandrosterone sulfate,which is able to apply to the clinical detemination of serum DHEA?S.

Dehydroepiandrosteronesulfate;Chemiluminescence immunoassay;Quantitative deter?mination kit

作者單位：鄭州大學第三附屬醫院新生兒疾病篩查中心，河南，鄭州450052

★通訊作者：蘇立，E?mail：29715562@qq.com