草麻黃根中總黃酮超聲提取工藝研究

禹琦

[摘要]目的 研究從草麻黃根中提取總黃酮的工藝。方法 采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定草麻黃根中總黃酮的含量，考察乙醇濃度、料液比、超聲次數(shù)和超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝。結(jié)果 確定紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為500 nm，精密度的RSD為1.26%，重現(xiàn)性的RSD為1.07%，在10 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定，加樣回收率為98.80%。超聲提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比是1∶12，乙醇濃度是75%，超聲2次，超聲時(shí)間是30 min。結(jié)論 工藝操作簡(jiǎn)便，方法穩(wěn)定可靠，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。

[關(guān)鍵詞]草麻黃根；總黃酮；正交試驗(yàn)；超聲；提取工藝

[中圖分類(lèi)號(hào)] R965.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）08（c）-0085-04

[Abstract]Objective To study the extraction process of the total Flavonoids from roots of Ephedra sinica Stapf.Methods The content of total Flavonoids in root of Ephedra sinica Stapf was determined by UV visible spectrophotometry.The influence of ethanol fraction，solid-liquid ratio，extraction duration and extraction times on the extraction rate of total flavonoids were investigated，and the orthogonal design was used to optimize the extraction process.Results The detection wavelength was 500 nm.The RSD of precision and reproducibility tests were 1.26% and 1.07%，the sample was stable within 10 h，and the average recovery rate was 98.80%.The optimum conditions for extracting the total flavonoids were as follow：material-liquid ratio was 1∶12，alcohol concentration was 75%，extraction times was twice and extraction duration was 30 min.Conclusion The extraction process is simple，stable and feasible，and suitable for the industrial production.

[Key words]The roots of Ephedra sinica Stapf；Total flavonoids；Orthogonal experimen；Ultrasonic；Extraction technology

草麻黃根是草麻黃（Ephedra sinica Stapf）的干燥根及根莖，有固表止汗之功效[1]。黃酮類(lèi)成分具有降壓、抗腫瘤等生物活性，是草麻黃根中重要的有效成分之一[2-5]，目前未見(jiàn)其超聲提取法報(bào)道。本研究通過(guò)超聲法優(yōu)選提取總黃酮類(lèi)化合物的工藝，為草麻黃根的研究和應(yīng)用提供理論支持。

1儀器與試藥

1.1儀器

KQ-100KDB型高功率數(shù)控超聲器（昆山舒美超聲儀器有限公司），UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津公司）。

1.2試劑與試藥

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，編號(hào)：100080-201203），草麻黃根（購(gòu)于長(zhǎng)沙佰佳中藥飲片有限責(zé)任公司），其他試劑試藥均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱(chēng)量10 mg，放入容量瓶中，加入濃度為70%的乙醇溶液定容至50 ml，搖勻，制成0.2 mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法測(cè)量總黃酮含量。精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2 ml，移入70%乙醇至6 ml，加入5% NaNO2溶液1 ml，混勻，放置6 min，加入10% Al（NO3）3溶液1 ml，混勻，放置6 min，再加入5% NaOH溶液10 ml，搖勻，加入70%的乙醇定容至25 ml，放置15 min。取此溶液用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[6]，發(fā)現(xiàn)在500 nm處有最大吸收值，因此，確定測(cè)量波長(zhǎng)為500 nm。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密量取1、2、3、4、5、6 ml，分別移入70%乙醇至6 ml，按“2.2”項(xiàng)下操作，在500 nm波長(zhǎng)下測(cè)定6份溶液的吸光度。以吸光度（Y）和總黃酮濃度（X）為坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[7-8]，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)方程得：Y=8.2542X-0.0523，r=0.9998，表明蘆丁在8～48 μg/ml范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.4供試品溶液制備

精密稱(chēng)取草麻黃根粉1 g，倒入具塞三角瓶中，移入乙醇溶液，開(kāi)啟超聲器，超聲結(jié)束后抽濾，合并濾液，待濾液冷卻后，移入相應(yīng)乙醇，并定容至100 ml，再稀釋2倍，即得供試品溶液。其乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間、超聲次數(shù)均按照設(shè)定的水平。精確移取供試品溶液2 ml，按照“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行操作，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)量總黃酮吸光度，且使用標(biāo)準(zhǔn)方程算出總黃酮含量[9-12]。endprint

2.5單因素實(shí)驗(yàn)

選擇料液比、乙醇濃度、超聲次數(shù)和超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素考察，將總黃酮含量作為指標(biāo)，找出上述4因素對(duì)總黃酮提取的影響。

2.5.1乙醇濃度的選擇 精密量取5份草麻黃根粉，各1 g，分別放入具塞三角瓶中，分別移入55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液，料液比（g∶ml）為1∶10，超聲30 min，共超聲3次，抽濾，合并濾液。濾液冷卻后，移入相應(yīng)的乙醇溶液，定容至100 ml，再稀釋2倍，即得待測(cè)溶液。分別精確吸取待測(cè)溶液2 ml，按照“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行操作，在500 nm處測(cè)量總黃酮吸光度，且用標(biāo)準(zhǔn)方程算出總黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。根據(jù)結(jié)果可知，隨著乙醇濃度的上升，總黃酮提取率先上升后下降，在75%時(shí)為最高值，故選擇75%的乙醇濃度較為合適。

2.5.2料液比的選擇 精密稱(chēng)取5份草麻黃根粉，各1 g，分別放入具塞三角瓶中，加入75%乙醇溶液，料液比（g∶ml）分別為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，超聲30 min，共超聲3次，抽濾，合并濾液。濾液冷卻后，移入75%乙醇溶液，定容至100 ml，再稀釋2倍，得待測(cè)溶液。分別精確移取上述待測(cè)溶液2 ml，按照“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行操作，在500 nm處測(cè)量總黃酮吸光度，且用標(biāo)準(zhǔn)方程算出總黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)結(jié)果可知，隨著料液比的提高，總黃酮的提取率也隨之上升，當(dāng)料液比達(dá)到1∶10后，總黃酮提取率增長(zhǎng)變緩。考慮到成本因素，選擇料液比為1∶10比較合適。

2.5.3超聲時(shí)間的選擇 精密稱(chēng)量5份草麻黃根粉，各1 g，分別放入具塞三角瓶中，加入75%乙醇溶液，料液比（g∶ml）為1∶10，超聲時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min，共超聲3次，抽濾，合并濾液。濾液冷卻后，移入75%乙醇溶液，定容至100 ml，再稀釋2倍，即得待測(cè)溶液。分別精確吸取上述待測(cè)溶液2 ml，按照“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行操作，在500 nm處測(cè)量總黃酮吸光度，且用標(biāo)準(zhǔn)方程算出總黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。根據(jù)結(jié)果可知，隨著超聲時(shí)間的變長(zhǎng)，總黃酮提取率也隨之增加，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30 min后，總黃酮提取率增長(zhǎng)變緩。考慮到時(shí)間成本，選擇超聲時(shí)間為30 min比較合適。

2.5.4超聲次數(shù)的選擇 精密量取5份草麻黃根粉，各1 g，分別放入具塞三角瓶中，加入75%乙醇溶液，超聲時(shí)間為30 min，料液比（g∶ml）為1∶10，超聲次數(shù)分別選擇：1、2、3、4、5次，超聲結(jié)束后抽濾，合并濾液。濾液冷卻后，吸入75%乙醇溶液，定容至100 ml，再稀釋2倍，即得待測(cè)溶液。分別精確吸取上述待測(cè)溶液2 ml，按照“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行操作，在500 nm處測(cè)量總黃酮吸光度，且用標(biāo)準(zhǔn)方程算出總黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。根據(jù)結(jié)果可知，隨著超聲次數(shù)的增加，總黃酮提取率也隨之增加，當(dāng)達(dá)到3次后，總黃酮提取率增長(zhǎng)變緩。考慮到成本因素，超聲次數(shù)選擇3次比較合適。

2.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)“2.5”項(xiàng)下單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、乙醇濃度、超聲次數(shù)和超聲時(shí)間4個(gè)因素中最優(yōu)水平及周邊水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，因素水平考察表見(jiàn)表1。

采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，將總黃酮含量作為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳工藝。試驗(yàn)結(jié)果和方差分析分別見(jiàn)表2、表3。

由表2可知，4因素的影響為A（乙醇濃度）>B（料液比）>C（提取時(shí)間）>D（提取次數(shù)）。由表3可知，只有乙醇濃度（A）對(duì)提取有顯著性影響，其余三因素?zé)o顯著性影響。最后確定超聲法提取總黃酮的最佳工藝為A2B3C2D1，即乙醇濃度為75%，料液比1∶12，超聲時(shí)間30 min，超聲2次。

2.7方法學(xué)考察

2.7.1精密度試驗(yàn) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 ml，按照“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行操作，在500 nm處測(cè)量總黃酮吸光度。測(cè)量6次，并用標(biāo)準(zhǔn)方程算出總黃酮含量，計(jì)算得RSD值為1.26%，提示其精密度良好。

2.7.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)量草麻黃根粉1 g，按照正交試驗(yàn)篩選出的各因素最佳水平，按“2.4”項(xiàng)下進(jìn)行提取，得供試品溶液。精密移取上述供試品溶液2 ml，分別在0、2、4、6、8、10 h時(shí)按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，且用標(biāo)準(zhǔn)方程算出總黃酮含量，計(jì)算得RSD值為1.33%，提示供試品溶液中的總黃酮含量在10 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.7.3重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)量草麻黃根粉1 g，共6份，分別以正交試驗(yàn)篩選出的各因素最佳水平按照“2.4”項(xiàng)下制備，并測(cè)定吸光度，且用標(biāo)準(zhǔn)方程算出總黃酮含量，計(jì)算得RSD值為1.07%，提示其重現(xiàn)性良好。

2.7.4回收率試驗(yàn) 取已知含量的草麻黃根，精密稱(chēng)量6份，每份約0.5 g，放入蘆丁對(duì)照品溶液，選取正交試驗(yàn)篩選出的各因素最佳水平，按照“2.4”項(xiàng)下制備供試品溶液并測(cè)量吸光度，且計(jì)算出總黃酮含量。算得平均回收率為98.80%，RSD值為0.90%，提示回收率良好（表4）。結(jié)果顯示，本方法具有較好的回收率。

2.8驗(yàn)證試驗(yàn)

精密稱(chēng)取草麻黃根粉1 g，按正交試驗(yàn)的最優(yōu)工藝條件制備3批樣品進(jìn)行試驗(yàn)，得總黃酮含量分別為6.02%、6.11%、5.95%，結(jié)果提示此工藝提取率高、穩(wěn)定性好。

3討論

超聲波是頻率20 Hz以上、人們聽(tīng)覺(jué)閾外的一種彈性機(jī)械振動(dòng)波，能產(chǎn)生并傳遞強(qiáng)大的能量，具有機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)、及熱效應(yīng)，是近年來(lái)興起的一項(xiàng)新技術(shù)。此方法無(wú)須加熱，節(jié)約溶劑用量，提取時(shí)間短，提取溫度溫和，尤其適用于熱不穩(wěn)定、易水解和易氧化的物質(zhì)。并且，據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，超聲波法提取總黃酮的效果要優(yōu)于傳統(tǒng)回流法[8-10]，故筆者選用超聲波法進(jìn)行提取。

本實(shí)驗(yàn)先通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)料液比、乙醇濃度、超聲次數(shù)和超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行考察，篩選出較好的水平；再通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)這4個(gè)因素進(jìn)行進(jìn)一步的考察，得出最佳工藝為乙醇濃度75%，料液比1∶12，超聲時(shí)間30 min，超聲2次，并通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證此工藝條件穩(wěn)定可行，提取的總黃酮含量穩(wěn)定。本試驗(yàn)有利于草麻黃根的綜合利用與開(kāi)發(fā)，可為草麻黃根的工業(yè)應(yīng)用提供工藝參數(shù)，也為進(jìn)一步研究該植物奠定了基礎(chǔ)。endprint

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（收稿日期：2017-06-19 本文編輯：祁海文）endprint