肝細胞肝癌腫瘤微環境中功能耗竭CD8+T細胞脂代謝特征的觀察

沈 琦， 卓樂盈， 劉芳銘， 張苗苗， 王 晗， 劉衛仁， 武多嬌*

1.復旦大學附屬中山醫院實驗研究中心，上海 2000322.溫州醫科大學，溫州 325035

·論著·

肝細胞肝癌腫瘤微環境中功能耗竭CD8+T細胞脂代謝特征的觀察

沈 琦1， 卓樂盈2， 劉芳銘1， 張苗苗1， 王 晗1， 劉衛仁1， 武多嬌1*

1.復旦大學附屬中山醫院實驗研究中心，上海 2000322.溫州醫科大學，溫州 325035

目的： 探討肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)腫瘤微環境中CD8+T細胞耗竭與脂代謝的關系。方法： 利用流式細胞分析、實時細胞能量代謝檢測儀、實時PCR等方法檢測HCC和癌旁組織中CD8+T細胞脂代謝及功能相關蛋白或基因的表達；在此基礎上分析其功能和脂代謝的關系。結果： HCC浸潤的CD8+T細胞具有以下特征：功能耗竭(干擾素-γ減少、程序性死亡分子-1表達升高)；多個脂肪酸合成酶表達下調，脂肪酸含量下降；線粒體結構、功能受損(P<0.05)。結論： HCC中浸潤的功能耗竭CD8+T細胞具有脂肪酸代謝異常特征。

肝細胞肝癌；CD8+T細胞；代謝；功能耗竭；微環境

腫瘤微環境在腫瘤發生、發展過程中有至關重要的作用[1]。細胞毒性CD8+T淋巴細胞是腫瘤特異性適應性免疫反應的關鍵細胞，攻擊表面上具有主要組織相容性Ⅰ類復合物的腫瘤相關抗原肽的腫瘤細胞。CD8+T細胞在與其腫瘤靶標相互作用后，可通過干擾素-γ(IFN-γ)依賴性機制殺傷腫瘤細胞。腫瘤微環境抑制因素的持續存在最終導致浸潤CD8+T細胞喪失殺傷腫瘤的能力，成為耗竭性細胞，導致腫瘤的免疫逃逸[1]。逆轉CD8+T細胞耗竭(T cell exhaustion)，恢復其抗腫瘤活性是腫瘤免疫治療的重要策略之一。CD8+T細胞耗竭的特征是具有免疫抑制作用的分子，包括程序性死亡分子-1(PD-1)、細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)、淋巴細胞活化基因3(LAG-3)等在細胞上表達上調，具有抑制CD8+T細胞活化和效應的功能。因此，研究CD8+T細胞功能障礙的機制至關重要，也是下一步設計聯合多靶點腫瘤免疫治療策略的關鍵。

目前已有文獻[2-3]提示，CD8+T細胞功能耗竭與其代謝異常密切相關，無論是在慢性淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)感染或黑素瘤小鼠模型中，耗竭的CD8+T細胞過表達共抑制分子的同時都呈現出廣泛的代謝和生物能量缺陷的特點。科學家在小鼠肉瘤模型中發現腫瘤細胞掠取T細胞營養，導致哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活性和糖酵解能力減弱、效應因子IFN-γ分泌減少，促進了腫瘤進展[4]。結果提示腫瘤浸潤的CD8+T細胞代謝異常與微環境中腫瘤細胞營養競爭導致組織中可獲取的葡萄糖等營養物質減少有關。

前期研究[5]表明，Toll樣受體9(TLR9)激活的漿細胞樣樹突狀細胞發生代謝重組，脂肪酸氧化增強是該類細胞活化并分泌大量Ⅰ型干擾素的能量基礎；過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)介導了這一分解代謝過程。另外有研究[6-7]發現，黑素瘤中效應性T細胞特異性缺失乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1，脂肪酸合成的限速酶)，其功能會受損，細胞數量也顯著減少；而給予ACC1缺陷型細胞補充外源性脂肪酸，可以恢復其功能。

在肝炎、肝硬化等致病因素反復刺激下，肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)被認為是典型的“微環境腫瘤”。根治性手術切除目前是HCC治療首選。然而，由于術后高復發轉移率等原因，近十年來HCC生存率并未得到明顯改善。本研究從代謝角度探討HCC微環境中CD8+T細胞耗竭的代謝特征，為后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 標本及組織病理 選取復旦大學附屬中山醫院肝外科2016年6月至2016年10月經手術切除的HCC標本20例，另取癌旁3 cm以上的肝組織標本20例作為對照組。HCC標本組中，10例進行免疫組織化學染色，具體步驟如下：石蠟包埋的組織切成5 μm切片，進行免疫組織化學染色。抗人CD8抗體 (賽默飛公司，貨號RB-9009-P0)孵育，蘇木精復染。使用ImagePro Plus 軟件(美國Media Cybernetics公司，V6.0)在高倍鏡視野下，每張切片隨機選擇5個視野，比較癌和癌旁CD8抗體陽性的細胞數目。本研究獲得醫院倫理委員會批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 單細胞懸液制備 20例HCC標本中有10例癌和癌旁組織分別制備單細胞懸液，步驟如下：在超凈臺中，將組織放入裝有消化液的培養皿中，用眼科剪切成0.5～1.0 mm3。剪碎的組織放入燒瓶中，加入5～10 mL Ⅳ型膠原酶消化液，以及青霉素及鏈霉素雙抗100 U/mL，置于37℃水浴磁力攪拌器中振蕩消化，連續觀察0.5～1 h，直至組織碎塊彌散開為止。消化組織液用200目不銹鋼濾網過濾。收集上述液體，1 800 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，用Hanks液洗滌2次。

1.3 細胞實時能量代謝特征檢測 分選癌旁和腫瘤組織內CD8+T細胞(CD3+CD8+TCRβ+CD45RO+CD62L-)，簡述步驟如下：(1)如上述獲取細胞懸液；(2)進行抗體染色：CD3(FITC，克隆號HIT3a)，CD8+(PE，克隆號HIT8a)，TCRβ+(PE-cy7，克隆號3C10)，CD45RO+(Percp，克隆號UCHL1)，CD62L-(APC-cy7，克隆號DREG-56)，上述流式抗體都購自Biolegend公司；(3)抗體染色4℃孵育30 min后使用流式緩沖液清洗，緩沖液為含2%胎牛血清(Gibco公司)的磷酸鹽緩沖液(PBS)；(4)清洗后細胞移入流式上樣管，調整管中的細胞密度至(7～9)×106/mL，過濾細胞，避光置冰上運至分選室；(5)上機檢測并設定分選條件，選取85 μmol/L噴嘴，調整分選關鍵參數及設門，分選細胞后上機回測，檢測純度。

細胞實時能量檢測儀(安捷倫公司，Seahorse XF96)檢測細胞有氧呼吸O2消耗速率(OCR)、細胞外酸化率(ECAR)、細胞儲備呼吸能力(SRC)等指標；其中，OCR代表細胞線粒體氧化磷酸化水平；ECAR代表糖酵解水平；SRC代表細胞在應激及壓力狀態下生存的能力。具體方法如下：將T細胞 (1.5×105細胞/孔)移入特殊的96孔檢測培養板中，置入XF96細胞能量代謝實時測定儀檢測。在線粒體能量測試中，首先測定基線OCR，然后依次測量加入1 μmol/L寡霉素(oligomycin，ATP合成酶抑制劑)、1.5 μmol/L氟羰基氰化物苯腙(FCCP，離子載體)和100 nmol/L 魚藤酮(rotenone，電子轉運鏈抑制劑)及1 μmol/L抗霉素A(antimycin A，電子轉運鏈抑制劑)后的OCR。上述試劑來自于線粒體壓力測試盒內的配套試劑(安捷倫公司，貨號103015-100)。

1.4 線粒體特征觀察 單細胞懸液用Mitotracker Green(賽默飛公司，貨號M7514)、Mitotracker Red(賽默飛公司，貨號M22425)等探針染色后，流式細胞儀檢測線粒體質量、膜電位等指標。

1.5 流式細胞儀檢測 應用Bodipy探針(賽默飛公司，貨號D3922)、葡萄糖轉運蛋白Glut1抗體(R&D公司，貨號MAB1418)標記染色等方法在流式細胞儀(BD公司， FACSAriaTMⅢ)上測量細胞脂質含量及葡萄糖轉運蛋白表達水平；同樣用抗體標記法檢測癌旁和腫瘤組織內CD8+T細胞IFN-γ(Biolegend公司，克隆號GIR-94)、PD-1(Biolegend公司，克隆號EH12.2H7)表達水平。

細胞流式表面抗體染色步驟如下：(1)用PBS洗滌細胞，1 500 r/min離心5～10 min，棄上清，計數；(2)取適量含1%胎牛血清的流式緩沖液，按照比例加入抗體，4℃避光孵育細胞半小時；(3)1 500 r/min離心5～10 min，棄上清；(4)用1%胎牛血清的流式緩沖液洗滌細胞，1 500 r/min離心5～10 min，棄上清。重復洗滌后加入適量流式緩沖液混勻，上機檢測。

1.6 Real-time PCR檢測 流式細胞儀(BD公司， FACSAriaTMⅢ)分選HCC癌及癌旁的CD8+T細胞，提取核酸后進行Real-time PCR(羅氏公司，LightCycler○R96 Instrument，貨號05815916001)檢測脂肪酸合成相關的基因表達水平，具體方法如前所述[5]。

2 結 果

2.1 免疫組化染色結果 結果(圖1)表明：癌組織平均高倍視野中CD8抗體表達陽性的細胞數低于癌旁組織[(3.4±0.8)vs(6.5±1.2)，P<0.05 ]。

圖1 HCC腫瘤組織及癌旁正常組織CD8抗體染色

A：癌旁正常組織；B：癌組織. Original magnification:×200

2.2 流式細胞儀檢測 結果(圖2)表明：腫瘤組織中CD8+T細胞數量少于癌旁組織(P=0.05)，且效應分子IFN-γ表達減少[(13.2±3.6)%vs(5.4±2.1)%，P<0.05]，共抑制分子PD-1、CD8+T細胞的表達增加[(9 800±1 660)vs(7 000±1 260)，P<0.05]，提示腫瘤組織內CD8+T細胞功能耗竭。

圖2 CD8+T細胞效應分子及共抑制分子表達

A：CD8+T細胞數量；B：流式細胞儀檢測CD8+T細胞IFN-γ表達；C,D：流式細胞儀檢測CD8+T細胞PD-1表達.*P<0.05

2.3 代謝特征改變 結果(圖3)表明：兩組間Glut1表達無顯著改變，說明腫瘤內浸潤的CD8+T細胞從環境中攝取葡萄糖的活動未受到抑制；但腫瘤組織中的CD8+T細胞較癌旁細胞內脂質含量減少，表現為Bodipy脂質探針平均熒光強度減弱[(5 120±1 060)vs(2 200±1 260)，P<0.05]。

圖3 CD8+T細胞代謝特征

A：葡萄糖轉運蛋白Glut1表達；B：Bodipy染色顯示脂質含量

2.4 線粒體特征改變 結果(圖4)表明：腫瘤內浸潤的CD8+T細胞線粒體電位下降[(8 100±960)vs(6 200±1 060)，P<0.05)]，伴隨ATP產量下降(P<0.05)、氧化磷酸化下降(P<0.001)。

2.5 基因表達改變 Real-time PCR檢測顯示，腫瘤內浸潤的CD8+T細胞ATP-檸檬酸裂解酶(ACLY)、脂肪酸合酶(FASN)基因表達下調(P<0.01，圖5)。

圖4 CD8+T細胞線粒體及實時能量代謝特征

圖5 HCC腫瘤內浸潤的CD8+T細胞脂肪酸合成相關酶表達

3 討 論

脂肪酸代謝與細胞的功能密切相關。首先，脂肪酸和甾醇的合成是細胞增殖必需的原料。脂肪酸合成途徑即細胞內脂質合成過程，可利用其他幾種代謝途徑的中間產物作為原料，例如糖酵解、三羧酸循環和磷酸戊糖途徑。脂肪酸可以與糖酵解衍生的丙三醇縮合產生多種三酰基甘油和磷脂的組合，這是許多細胞結構的關鍵組分[8]。其次，合成的脂肪酸除了是細胞膜結構的關鍵組成部分，還可在線粒體或過氧化物酶體中進行氧化，產生許多具有重要生理功能的代謝中間產物，包括乙酰輔酶A、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和還原型黃素二核苷酸(FADH2)。另外，脂肪酸氧化產生大量單一棕櫚酸酯分子(ATP，哺乳動物細胞中的主要脂肪酸)，ATP的完全β-氧化具有產生超過100個ATP分子的潛力[9]，是細胞供能的重要方式。

雖然已有部分文獻[10-12]報道了脂肪酸代謝與免疫細胞的功能活化密切相關，但研究非常有限，且主要聚焦在脂肪酸氧化與病毒感染的動物模型上。本研究在人HCC標本中發現腫瘤浸潤的CD8+T細胞比癌旁組織中CD8+T細胞數目減少且功能受損。這類T細胞在腫瘤殺傷功能異常的同時，表現出了代謝異常的特征，包括脂肪酸含量以及脂肪酸氧化和氧化磷酸化水平下降(氧耗率和儲備呼吸能力SRC下降)、產能減少(ATP產生減少、線粒體膜電位下降)。胞內脂肪酸含量直接影響細胞脂肪酸氧化及氧化磷酸化水平，而脂肪酸氧化是免疫細胞生成ATP的關鍵方式；并且脂質是組成細胞膜結構的重要組成部分，脂肪酸從頭合成減少會影響含膜結構細胞器的功能，如線粒體功能。線粒體功能可直接影響T細胞分化及免疫應答[13]。本研究發現，HCC中浸潤的CD8+T細胞SRC減少，代表了細胞線粒體呼吸能力損傷[14]。另外，脂質是細胞增殖所必需的材料，脂質減少可顯著妨礙細胞增殖和信號轉導，這可部分解釋腫瘤內浸潤的CD8+T細胞數目比癌旁組織少。因此本研究中觀察到HCC中CD8+T細胞脂肪酸含量下降可能是細胞產能及效應功能受抑制的重要原因之一。

其次，本研究發現HCC中耗竭的CD8+T細胞脂肪酸從頭合成的酶ACLY、FASN表達下降。由于HCC組織樣本中CD8+T細胞分選所得數量有限，目前還不能進行免疫印跡實驗檢測這些基因的蛋白水平。脂肪酸從頭合成酶的表達主要由固醇調節元件結合蛋白(SREBPs)控制。SREBPs可能是HCC浸潤的CD8+T細胞代謝重組的關鍵調控因子。SREBPs是3個基本螺旋-環-螺旋-亮氨酸拉鏈轉錄因子家族。SREBPs與其靶基因的啟動子中的固醇調節元件(SRE)和一些E盒序列結合。目前已知蛋白激酶B/哺乳動物靶蛋白雷帕霉素復合物1(AKT/mTORC1)與SREBPs構成信號轉導軸，誘導SREBPs核聚集，連接了致癌信號傳導和脂質代謝。AKT/mTORC1-SREBP軸及其下游基因是否在HCC中耗竭的CD8+T細胞代謝中起關鍵調控作用目前尚不清楚，有待進一步探討。

綜上所述，本研究發現了HCC內浸潤的功能耗竭的CD8+T細胞具有線粒體功能受損、脂肪酸代謝異常的特征。HCC中CD8+T細胞脂肪酸從頭合成減少，可通過影響線粒體膜結構、限制了脂肪酸氧化等機制，導致線粒體結構和功能受損，最終削弱CD8+T細胞分泌IFN-γ等腫瘤殺傷功能。目前關于脂代謝與CD8+T細胞的研究還遠不夠深入，下一步可通過細胞及動物實驗進一步驗證脂代謝異常與T細胞功能異常的關系，繼而探討靶向干預CD8+T細胞脂代謝異常能否重激活T細胞的腫瘤殺傷作用。

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[本文編輯] 葉 婷， 賈澤軍

Lipid metabolic characteristics of functionally exhausted CD8+T cells in tumor microenvironment of hepatocellular carcinoma

SHEN Qi1, ZHUO Le-ying2, LIU Fang-ming1, ZHANG Miao-miao1, WANG Han1, LIU Wei-ren1, WU Duo-jiao1*

1. Department of Experimental Research Center, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China2. Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, Zhejiang, China

Objective： To explore the lipid metabolic characteristics of functionally exhausted CD8+T cells in tumor microenvironment of hepatocellular carcinoma (HCC).Methods： By using flow cytometry analysis and real-time PCR to detect the functions and lipid metabolism-related proteins and genes expression of CD8+T cells in HCC and peri-tumor tissues, then the relationship between function and lipid metabolism was analyzed.Results： The infiltrated CD8+T cells in HCC have the following characteristics: functional exhaustion (decreased interferon-γ secretion and up regulated programmed death molecule-1 expression); down regulated expression of multiple fatty acid synthases, and the decreased content of intracellular fatty acids; impaired mitochondrial structure and function (P<0.05).Conclusions： Fatty acid metabolism abnormalities are the characteristics of exhausted CD8+T cell infiltrated in HCC.

hepatocellular carcinoma; CD8+T cells; metabolism; functional exhaustion; microenvironment

R 735.7

A

2017-07-22 [接受日期] 2017-08-19

上海市浦江人才計劃(17PJD006)，上海市衛計委科研項目(201740101). Supported by Pujiang Talent Plan of Shanghai (17PJD006) and Project of Shanghai Municipal Health Planning Commission (201740101).

沈 琦，技師. E-mail: shen.qi@zs-hospital.sh.cn

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64040731, E-mail: wu.duojiao@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170621