過表達整合素連接激酶促進心臟c-Kit+細胞的存活和增殖*

李菁菁， 劉 玉， 趙 娟， 李愛英， 王冬梅△

(1中國人民解放軍白求恩國際和平醫院心血管內科， 2河北醫科大學基礎醫學院細胞生物教研室，3河北省中醫學院生物化學與生物學教研室， 河北 石家莊 050082)

·論著·

過表達整合素連接激酶促進心臟c-Kit+細胞的存活和增殖*

李菁菁1, 2， 劉 玉1， 趙 娟2， 李愛英3， 王冬梅1△

(1中國人民解放軍白求恩國際和平醫院心血管內科，2河北醫科大學基礎醫學院細胞生物教研室，3河北省中醫學院生物化學與生物學教研室， 河北 石家莊 050082)

目的： 探討整合素連接激酶(ILK)過表達對心臟c-Kit+細胞存活和增殖的影響，以及移植ILK過表達的心臟c-Kit+細胞改善心肌梗死(MI)大鼠心功能的作用。方法: 從新生SD大鼠分離培養心臟c-Kit+細胞，構建含人ILK全長的腺病毒載體并感染心臟c-Kit+細胞。感染48 h后，應用細胞計數和CCK-8法測定細胞活力和增殖，并通過Western blot法檢測c-Kit+細胞中增殖相關蛋白cyclin D1和增殖細胞核抗原(PCNA)的表達。40只8周齡SPF級大鼠經冠狀動脈結扎建立MI模型，結扎15 min后于梗死區及梗死邊緣區分3點通過心肌注射移植心臟c-Kit+細胞。采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組(sham組)、心梗+生理鹽水注射組(MI組)、心梗+感染空載體的c-Kit+細胞注射組(Ad-null-c-Kit+cell組)和心梗+感染攜帶ILK腺病毒載體的c-Kit+細胞注射組(ILK-c-Kit+cell組)，每組10只。術后2周，免疫組化法檢測梗死區和梗死邊緣區c-Kit的表達；術后4周，通過血流動力學檢測心臟功能。結果: 過表達ILK促進了心臟c-Kit+細胞的存活和增殖(P<0.05)。過表達ILK的心臟c-Kit+細胞中cyclin D1和PCNA的表達明顯增加(P<0.05)。細胞移植2周后，ILK-c-Kit+cell組心肌組織中c-Kit表達明顯增加(P<0.05)；細胞移植4周后，ILK-c-Kit+cell組大鼠心功能改善比Ad-null-c-Kit+cell組更明顯(P<0.05)。結論: 過表達ILK通過提高cyclin D1和PCNA的表達，促進了心臟c-Kit+細胞的存活和增殖。ILK-c-Kit+細胞移植能更好地改善MI大鼠的心功能。

整合素連接激酶； 心臟c-Kit+細胞； 細胞存活； 細胞增殖； 心功能； 心肌梗死

心肌梗死(myocardial infarction，MI)后局部心肌組織缺血，心肌細胞大量死亡，纖維組織增生，進而導致左心室重構和缺血性心力衰竭，嚴重危害人類健康[1]。隨著介入治療和藥物治療等方法研究的進展，急性心肌梗死患者的生存率得到明顯提高，但這些傳統的方法不能使壞死心肌細胞再生，而由纖維組織代替，即不能從根本上使已經壞死的心肌修復，改善心肌的舒縮功能。近年來，研究發現在成體的心肌組織和骨髓中存在具有特異性心肌分化潛能的多能干細胞，即心肌干細胞(cardiac stem cells，CSCs)[2]。心肌梗死后，CSCs在多種機制下被動員至心肌缺血區，向心肌細胞等心肌譜系細胞分化，進而修復心臟，改善心功能，因而心肌干細胞移植逐漸成為最有前景的治療手段之一[3]。然而移植到損傷局部組織的CSCs存活和增殖能力受限，大部分細胞因缺血缺氧的心肌微環境而死亡，難以達到預期治療效果[4]。整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)是一種與細胞存活和增殖密切相關的蛋白，廣泛表達在心血管系統，調節多種心血管細胞的生理和病理過程。例如，我們前期研究發現ILK參與調解血管平滑肌細胞的增殖和遷移[5]；另有研究報道，ILK修飾的骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)能改善梗死后大鼠心功能[6]，提示ILK可能參與了MSCs移植誘導的心臟修復過程。c-Kit是干細胞表面的重要標志，心臟c-Kit+細胞主要來源于心臟，具有分化為多種心臟細胞類型的能力，比MSCs具有更強的心肌分化性和修復力，具有更好的治療效果[7]，因而在心臟c-Kit+細胞中過表達ILK可能成為提高其細胞移植治療效果的手段之一。本研究探討過表達ILK對心臟c-Kit+細胞存活和增殖的影響，進而觀察經ILK修飾的心臟c-Kit+細胞移植對急性心肌梗死大鼠心功能的作用，以期為治療缺血性心肌病提供更佳的手段和方法。

材料和方法

1動物

SPF級8周齡雄性SD大鼠，體重約280～350 g，以及新生SD大鼠均購自河北醫科大學動物中心，許可證號為SCXK(冀)-1-003。

2主要試劑

II 型膠原酶和胰蛋白酶購自Gibco； IMDM和DMEM/Ham F-12培養基購自Invitrogen；兔抗鼠ILK多抗、小鼠抗大鼠c-Kit、β-actin和GAPDH單抗購自Santa Cruz；小鼠抗大鼠cyclin D1和增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)單抗購自Cell Signaling Technology；CCK-8試劑盒購自Dojindo；含人ILKcDNA全長的腺病毒載體(Ad-ILK)及對照空載體(Ad-null)購自北京諾賽公司；實驗所用其它試劑和材料均購自Sigma。

3主要方法

3.1大鼠心臟c-Kit+細胞分離、純化、擴增培養及腺病毒感染 根據文獻報道[8]，新生SD大鼠無菌操作下取出整個心臟，剪成1～2 mm3小塊，PBS液沖洗。加入0.2%胰酶和0.1% II 型膠原酶，37 ℃消化5 min，重復3次。棄掉消化液，剩余組織塊用完全移植物培養液(包括IMDM、10% FBS、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和0.1 mmol/L β-巰基乙醇)清洗2次后移入培養瓶培養。1周后，可看到組織塊周圍成纖維細胞層上出現小、圓、亮的細胞，按照快速消化洗脫法[9]，用含0.53 mmol/L EDTA 和0.5 g/L 胰酶的PBS室溫沖洗2遍收集脫落的細胞，以1×108/L的密度接種于培養瓶，用含35% IMDM/65% DMEM/Ham F-12的混合培養液(包含15% FBS、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、10 μg/L EGF和20 μg/L bFGF)繼續培養。流式細胞術分析c-Kit陽性率用于鑒定心臟c-Kit+細胞。心臟c-Kit+細胞生長至80%匯合度時，更換無血清培養基，按感染復數值200加入Ad-ILK或Ad-null，37 ℃孵育2 h，加入新鮮的培養基，繼續培養48 h后流式細胞術再次分析c-Kit陽性率后，用于下列各實驗。

3.2細胞計數儀及CCK-8法檢測心臟c-Kit+細胞增殖 將心臟c-Kit+細胞以1×105/L密度接種于12孔板，生長到80%匯合度后，感染Ad-ILK或者Ad-null，感染后48 h，更換無血清培養基，繼續培養48 h。0.25%胰酶消化Ad-ILK感染的心臟c-Kit+細胞、Ad-null感染的心臟c-Kit+細胞和未感染的心臟c-Kit+細胞(control)，獲得細胞懸液，按照說明書，3組細胞各取10 μL與10 μL臺盼藍混合均勻，將10 μL經過染色的樣品加入到CountessTM細胞計數池玻片上，插入CountessTM自動細胞計數儀(Invitrogen)進行活細胞計數，實驗重復3次。

心臟c-Kit+細胞以每孔2×103個接種于96 孔板，生長到80%匯合度后，感染Ad-ILK或者Ad-null。于感染前(0 h)和感染后24 h、48 h，按照CCK-8試劑盒說明書，加入含CCK-8的等體積培養基，在450 nm波長檢測Ad-ILK感染的心臟c-Kit+細胞、Ad-null感染的心臟c-Kit+細胞和未感染的心臟c-Kit+細胞3組樣品的吸光度，計算細胞活力，實驗重復3次。

3.3大鼠心肌梗死模型的制備及分組 將40只大鼠按隨機數字表法分為假手術組(sham組)、心梗+生理鹽水注射組(MI組)、心梗+Ad-null感染的心臟c-Kit+細胞注射組(Ad-null-c-Kit+cell組)和心梗+Ad-ILK感染的心臟c-Kit+細胞注射組(ILK-c-Kit+cell組)，每組10只。采用冠狀動脈左前降支結扎法建立心肌梗死模型[9]。模型成功15 min后，直視下分3點在心肌梗死區及其梗死邊緣區注射30 μL Ad-null感染的心臟c-Kit+細胞、Ad-ILK感染的心臟c-Kit+細胞(每30 μL 1×105個細胞)或生理鹽水，心肌梗死區注射1次(10 μL)，梗死邊緣區分2次注射(每次10 μL)。術后給予大鼠常規處理。假手術組不結扎左冠狀動脈也不注射。心肌梗死診斷標準為心電圖示2個以上肢體導聯或胸導聯ST段弓背向上抬高。

3.4Western blot法檢測心臟c-Kit+細胞中增殖相關基因及心肌組織中ILK的蛋白表達 分別提取細胞和心肌組織中的總蛋白，腺病毒感染48 h后，用RIPA裂解液分別提取Ad-ILK感染的心臟c-Kit+細胞、Ad-null感染的心臟c-Kit+細胞和未感染的心臟c-Kit+細胞3組細胞的總蛋白；行大鼠心肌梗死模型術后4周，處死大鼠，迅速取出心臟，0 ℃生理鹽水清洗干凈，沿室壁分離左右心室，每組收集3只大鼠的梗死區及梗死邊緣區心肌組織。各組取等量蛋白(50 μg)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉至PVDF膜，5% BSA室溫封閉2 h后，分別加入抗cyclin D1、PCNA或ILK 的I 抗，4 ℃過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的 II 抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，ECL顯影。以GAPDH或β-actin為內參照。用Quantity One軟件對Western blot條帶進行灰度分析。

3.5免疫組化法檢測大鼠心肌組織中c-Kit的蛋白表達 移植后2周，處死大鼠，迅速取出心臟，0 ℃生理鹽水清洗干凈，沿室壁分離左右心室，每組收集3只大鼠的梗死區及梗死邊緣區心肌組織，置于4%多聚甲醛中固定，常規制作組織切片，脫蠟至水，用3% H2O2室溫孵育10 min，PBS洗3次；給予1% Triton X-100通透20 min，PBS洗3次；之后滴加10 %正常羊血清室溫封閉20 min；滴加 I 抗c-Kit(1∶100)，4 ℃過夜，PBS洗3次；滴加 II 抗，室溫2 h，PBS洗3次；鏡下DAB顯色，蘇木精復染，常規脫水、干燥、透明和封片。顯微鏡下觀察陽性表達的棕黃色顆粒，Image-Pro Plus 6.0軟件圖像分析系統進行累積吸光度測定。

3.6左心室功能的測定 術后4周，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠，沿頸部正中切開，游離右頸總動脈，按常規方法將20 G導管插入左心室，另一端接上4道生理記錄儀，記錄大鼠最大左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、最大左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)。撤回導管至右頸總動脈，測量平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)，所有數據連續測量3次，每次間隔3 min。

4統計學處理

用SPSS 13.0軟件進行數據分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1心臟c-Kit+細胞的培養、鑒定及感染后ILK的表達

組織塊培養1周后在梭形成纖維細胞層上出現小、圓、亮的細胞，折光度高，圓球狀，核不可見， 呈團簇樣集落生長。應用快速消化洗脫法收集細胞可獲得較純的心臟c-Kit+細胞，此時，大部分心臟c-Kit+細胞仍為球形，少量細胞向外伸展而形成梭形、 多邊形或不規則異形等形狀。流式細胞儀分析c-Kit陽性率可達到(85.68±7.34)%。Ad-ILK感染心臟c-Kit+細胞48 h后，c-Kit陽性率仍可達到(80.23±5.65)%，Western blot實驗結果表明Ad-ILK感染后ILK表達明顯增加，說明ILK得到有效表達，見圖1。

Figure 1. The protein expression of integrin-linked kinase (ILK) in the cardiac c-Kit positive cells determined by Wes-tern blot. Means±SD.n=3.*P<0.05vsAd-null.

圖1心臟c-Kit+細胞中ILK的蛋白表達

2過表達ILK促進了心臟c-Kit+細胞的活力和增殖

細胞計數結果顯示，過表達ILK后心臟c-Kit+細胞的活力與Ad-null感染的心臟c-Kit+細胞相比明顯增加(P<0.05)。與對照組比較，Ad-null感染的心臟c-Kit+細胞的活力沒有明顯改變，見圖2。這提示在血清饑餓條件下，ILK可以提高心臟c-Kit+細胞的存活能力。

Figure 2. Cell counting results of cardiac c-Kit+cells. The number of survival cardiac c-Kit+cells was identified by cell counting after ILK overexpression for 48 h followed by serum starvation for another 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsAd-null.

圖2細胞計數儀測定過表達ILK對心臟c-Kit+細胞增殖的影響

細胞計數結果顯示，過表達ILK后c-Kit+活細胞數為(4.80±0.53)×105/L，與Ad-null感染的心臟c-Kit+細胞相比明顯增加(P<0.05)。CCK-8實驗檢測結果顯示，感染ILK 48 h后，c-Kit+細胞的吸光度明顯升高(P<0.05)，而Ad-null感染的心臟c-Kit+細胞的吸光度與對照組相比沒有明顯改變，見圖3。兩種實驗結果共同提示，過表達ILK可以促進心臟c-Kit+細胞的增殖。

Figure 3. The proliferation of cardiac c-Kit+cells. A: the number of survival cardiac c-Kit+cells was identified by cell counting after 48 h of ILK overexpression； B: the viability of cardiac c-Kit+cells measured by CCK-8 assay. Means±SD.n=3.*P<0.05vsAd-null.

圖3細胞計數術和CCK-8法測定過表達ILK對心臟c-Kit+細胞增殖的影響

3過表達ILK促進了心臟c-Kit+細胞中cyclinD1和PCNA的表達

Western blot實驗結果顯示，感染ILK 48 h后，心臟c-Kit+細胞中cyclin D1和PCNA表達明顯增加(P<0.05)，提示過表達ILK通過提高增殖相關蛋白cyclin D1和PCNA的表達促進了心臟c-Kit+細胞的增殖，見圖4。

Figure 4. The protein expression of cyclin D1 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in the cardiac c-Kit+cells determined by Western blot. Means±SD.n=3.*P<0.05vsAd-null.

圖4心臟c-Kit+細胞中cyclinD1和PCNA的蛋白表達

4過表達ILK的心臟c-Kit+細胞移植增加了MI后心肌組織中c-Kit的表達

免疫組化結果顯示，細胞移植2周后，ILK-c-Kit+cell組心肌組織中c-Kit表達明顯增加(P<0.05)，提示注射ILK過表達的心臟c-Kit+細胞能使MI后的心肌組織中保留更多的c-Kit+的干細胞，見圖5。

Figure 5. Immunohistochemical results of c-Kit in the hearts of MI rats. The brown color represents a positive result. Means±SD.n=3.*P<0.05vsAd-null-c-Kit+cell.

圖5免疫組化檢測MI大鼠心肌組織中c-Kit的表達

5心功能測定結果

細胞移植4周后，Western blot實驗結果顯示，ILK蛋白表達在ILK-c-Kit+cell組仍顯著高于Ad-null-c-Kit+cell組(P<0.05)，間接說明此時仍有較多的ILK-c-Kit+細胞存活，見圖6。用生理記錄儀記錄大鼠LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax和MAP，其結果顯示，ILK-c-Kit+cell組和Ad-null-c-Kit+cell組的LVSP、+dp/dtmax、 -dp/dtmax和MAP較MI組都顯著增加(P<0.05)，而LVEDP明顯降低，ILK-c-Kit+cell組較Ad-null-c-Kit+cell組改變更明顯(P<0.05)，見表1。

討 論

干細胞是指一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞，能自我復制，并且在一定條件下能分化成具有特定功能的體細胞。以前的觀點認為成熟哺乳動物的心臟是一個沒有再生能力的終末分化器官，但隨著研究的進展，已發現心臟中存在可增殖并且能夠進行分化的細胞，即c-Kit+心肌干細胞[10]。心肌梗死后氧化應激反應及炎癥反應增加，使梗死區心肌組織處于缺血缺氧的環境中，導致心肌細胞大量死亡。通過c-Kit+的心肌干細胞移植代替死亡的心肌細胞可以穩定病損心臟結構，防止心肌重塑，有益于心肌梗死區域的修復及愈合[11]。然而，研究表明心肌梗死后移植的干細胞很快就死亡，其存活和增殖能力都較低，不能達到完全改善心臟功能的作用[12]，因此尋找提高心臟干細胞存活和增殖的方法，優化心臟干細胞移植的療效是干細胞研究領域亟待解決的重要課題。國內外研究發現，應用基因調控的方法預處理干細胞可以起到一定的作用。例如，糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK-3)過表達的MSCs移植能改善心梗后心功能[13]；在MSCs中過表達bcl-2[14]或者livin[15]可抑制細胞凋亡，增加細胞存活，提高了MI的治療效果。

Figure 6. The protein expression of integrin-linked kinase (ILK) in the hearts of MI rats determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsAd-null-c-Kit+cell.

圖6MI大鼠心肌組織中ILK蛋白的表達

ILK是在研究整合素β1結合蛋白的過程中發現的一個多功能蛋白，參與調節細胞的存活，控制細胞形態和生長。在心血管系統，ILK同樣發揮重要作用，Ding等[16]發現在心梗后大鼠心肌中注射表達ILK的腺病毒載體能促進血管新生，抑制細胞凋亡，從而改善心功能。本研究應用腺病毒感染的方法在心臟c-Kit+細胞中過表達ILK，細胞計數和CCK-8結果表明，心臟c-Kit+細胞的存活和增殖明顯提高，且與增殖相關蛋白cyclin D1和PCNA的高表達有關。細胞實驗的結果證實，過表達ILK是一種增加心臟c-Kit+細胞存活和增殖的有效手段。為了進一步驗證ILK-c-Kit+細胞治療心肌梗死的療效，我們通過結扎冠狀動脈左前降支建立大鼠MI模型，15 min后進行細胞移植，移植后4周，ILK-c-Kit+cell組大鼠心功能明顯改善，效果要好于感染空載體的心臟c-Kit+細胞組。我們推測心功能的改善可能與增加的ILK-c-Kit+細胞存活和增殖有關，為了驗證這一推測，我們調查了移植2周后心臟中c-Kit的表達，免疫組化結果表明，空載體組c-Kit+的細胞數量與MI組相比有所增加，但是沒有顯著性意義，可能是由于移植的細胞在心梗缺血缺氧環境中存活較少，大部分已經死亡造成的，這與其它相關報道一致[17]。而ILK-c-Kit+cell組大鼠中c-Kit+的細胞數量明顯高于MI組和空載體組。雖然心臟c-Kit+細胞增加的原因有可能是細胞移植動員了組織中或循環系統中原有的心臟祖細胞(cardiac progenitor cells，CPCs)遷移到梗死區，但是結合本研究體外實驗的結果，我們認為增加的c-Kit+細胞至少部分來源于移植的ILK-c-Kit+細胞；另外，移植4周時心肌組織中仍有較高的ILK表達，這都提示ILK過表達增加了心臟c-Kit+細胞在心臟的存活和后續的增殖，當然其具體作用機制和安全性仍需進一步研究，但這不失為一種提高移植后心臟c-Kit+細胞存活和增殖，并進一步提高治療效果的手段。

表1 移植后4周各組大鼠心功能血流動力學測定

LVEDP: left ventricular end-diastolic pressure; LVSP: left ventricular systolic pressure; +dp/dtmax: maximal increase rate of left ventricular pressure; -dp/dtmax: maximal decrease rate of left ventricular pressure; MAP: mean arterial pressure.△P<0.05vssham；*P<0.05vsMI;#P<0.05vsAd-null-c-Kit+cell.

總之，過表達ILK可提高心臟c-Kit+細胞的存活和增殖，移植過表達ILK的心臟c-Kit+細胞能夠更好地改善左心室功能，為優化心臟c-Kit陽性干細胞移植治療提供了一個可行的方法。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Overexpression of integrin-linked kinase improves survival and proliferation of cardiac c-Kit+cells

LI Jing-jing1,2, LIU Yu1, ZHAO Juan2, LI Ai-ying3, WANG Dong-mei1

(1Department of Cardiology, Bethune International Peace Hospital of People’s Liberation Army，2Department of Cell Biology, School of Basic Medicine, Hebei Medical University，3Department of Biochemistry and Biology, Hebei Traditional Chinese Medicine College, Shijiazhuang 050082, China. E-mail: wangdm1234@126.com)

AIM: To investigate the effects of integrin-linked kinase (ILK) overexpression on survival and proliferation of cardiac c-Kit+cells, and the role of ILK-overexpressing c-Kit+cell transplantation in cardiac function in a rat myocardial infarction (MI) model.METHODS: Cardiac c-Kit+cells were isolated from the hearts of neonatal Sprague-Dawley (SD) rats and cultured to prepare the ILK-c-Kit+cells by infected with recombinant adenoviral vector harboring human wild-typeILKcDNA. The survival and proliferation of cardiac c-Kit+cells were detected by cell counting and CCK-8 assay at 48 h after infection, respectively. The protein levels of cyclin D1 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in the cardiac c-Kit+cells were examined by Western blot. MI was induced by coronary artery ligation in 40 adult rats. After 15 min, ILK-c-Kit+cells were transplanted into the hearts by myocardial injection at 3 different sites in the infracted zone and border zone. All rats were randomly divided into 4 groups: sham group, MI plus saline injection group (MI group), MI plus null vector-infected cardiac c-Kit+cell injection group (Ad-null-c-Kit+cell group), and MI plus ILK-overexpressing cardiac c-Kit+cells injection group (ILK-c-Kit+cell group), with 10 rats in each group. At 2 weeks after MI, the protein levels of c-Kit in MI hearts were investigated by immunohistochemical assay. At 4 weeks, left ventricular function was examined by hemodynamic measurement.RESULTS: The survival and proliferation of cardiac c-Kit+cells and the protein levels of cyclin D1 and PCNA were enhanced by ILK overexpression compared with Ad-null group. In MI rat model, the number of c-Kit+cells was increased by ILK-c-Kit+cell injection compared with Ad-null-c-Kit+cell group at 2 weeks after MI. Cardiac function was significantly improved in ILK-c-Kit+cell-transplanted rats.CONCLUSION: ILK overexpression improves survival and proliferation of cardiac c-Kit+cells by increasing the protein levels of cyclin D1 and PCNA. ILK-c-Kit+cell transplantation enhances the therapeutic efficiency of cardiac c-Kit+cells in the post-MI hearts of rats.

Integrin-linked kinase; Cardiac c-Kit+cells; Cell survival; Cell proliferation; Cardiac function; Myocardial infarction

1000- 4718(2017)09- 1537- 07

2017- 01- 17 [

] 2017- 05- 17

國家自然科學基金資助項目(No. 81573698)；河北省科技支撐計劃重大項目(No. 11276124D)；河北省教育廳青年基金資助項目(No. 2011177)

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.001

△通訊作者 Tel: 0311-87978777； E-mail: wangdm1234@126.com