Rb1延緩人臍靜脈內皮細胞早熟性衰老與caveolin-1表達的關系*

劉定輝， 吳 琳， 余舒杰， 周 彬， 王 敏， 劉 勇， 郝寶順， 鄭振達， 錢孝賢, 2△

(中山大學 1附屬第三醫院心血管內科， 2中西醫結合研究所， 廣東 廣州 510630)

Rb1延緩人臍靜脈內皮細胞早熟性衰老與caveolin-1表達的關系*

劉定輝1， 吳 琳1， 余舒杰1， 周 彬1， 王 敏1， 劉 勇1， 郝寶順1， 鄭振達1， 錢孝賢1, 2△

(中山大學1附屬第三醫院心血管內科，2中西醫結合研究所， 廣東 廣州 510630)

目的： 血管內皮細胞衰老是動脈粥樣硬化發生的病理生理機制之一。本研究旨在探討人參皂苷Rb1延緩人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)早熟性衰老與窖蛋白1(caveolin-1)表達的關系，為延緩HUVECs衰老提供新的靶點。方法: 建立60 μmol/L過氧化氫(H2O2)誘導的HUVECs早熟性衰老模型，根據細胞形態學的變化、衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色陽性率和細胞周期評估內皮細胞衰老，采用Western blot和激光共聚焦顯微成像的方法檢測caveolin-1的變化，觀察人參皂苷Rb1對HUVECs衰老的作用及其相關的分子機制。結果: 60 μmol/L H2O2可成功地誘導內皮細胞衰老，早熟性衰老的HUVECs體積變大，SA-β-Gal活性明顯增加，細胞發生G1期阻滯，細胞增殖受抑制，caveolin-1表達增多。與H2O2處理組相比，人參皂苷Rb1預處理延緩HUVECs早熟性衰老，SA-β-Gal染色陽性細胞百分比降低，G0/G1期細胞比例下降，caveolin-1表達減少。結論: 人參皂苷Rb1可通過抑制caveolin-1的表達延緩H2O2誘導的HUVECs早熟性衰老。

細胞衰老； 窖蛋白1； 人臍靜脈內皮細胞； 人參皂苷Rb1

細胞衰老是生命體中普遍存在的一種壓力和損傷反應現象，表現為不可逆的增殖停滯，其可分為兩大類：復制性衰老和壓力誘導的早熟性衰老。氧化應激可誘導早熟性衰老[1]。其中，內皮細胞衰老呈現出促炎、促血栓形成、促動脈粥樣硬化的表型，在增齡相關性血管疾病如動脈粥樣硬化的發病中發揮重要作用[2]。因此，深入探討內皮細胞衰老的機制有助于為增齡相關性血管疾病治療提供新視角、新靶點。

胞膜窖是細胞質膜內陷形成的一種特異性結構。在大部分細胞，窖蛋白1(caveolin-1)是胞膜窖的主要結構蛋白成分，在調節信號轉導中起重要作用[1]。目前文獻報道caveolin-1在衰老中發揮重要作用。有研究發現，在氧化應激誘導的成纖維細胞早熟性衰老模型中，caveolin-1通過抑制Sirt1從而促進P53依賴的早熟性衰老并刺激IL-6的分泌[1]。但caveolin-1在內皮細胞衰老中的作用研究尚不多見。

目前有部分報道阿司匹林、他汀、白藜蘆醇等對內皮細胞衰老有一定的防治作用[3-5]。人參是我國常見的中草藥之一，具有“久服輕身延年”的作用。人參皂苷是人參發揮藥理學作用的主要成分，其中人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1，Rb1)是人參皂苷的主要活性單體。有研究發現Rb1可通過抗氧化應激對內皮衰老有一定的作用[6]，但Rb1對caveolin-1的調節研究不多見。

本研究以過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)衰老為研究模型，觀察Rb1延緩內皮細胞衰老的作用，并從caveolin-1角度探討Rb1延緩內皮細胞衰老的機制。

材料和方法

1材料

人參皂苷Rb1購自于中國藥品生物制品檢定所。30% H2O2購自廣州化學試劑廠。M199粉劑、無血清培養基(serum-free medium，SFM)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、EDTA胰酶和Ⅰ型膠原酶購自Gibco；內皮細胞生長添加劑(endothelial cell growth supplement，ECGS)購自BD；DMSO和碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自Sigma-Aldrich；X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)購自AMESCO；全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司；預染分子marker購自Fermentas；兔抗caveolin-1多抗購自Cell Signaling Technology；兔抗GAPDH多抗購自Proteintech Group；辣根酶標記羊抗兔IgG購自武漢博士德公司；綠色熒光羊抗兔 II 抗購自Invitrogen。

2HUVECs原代分離及培養

HUVECs原代培養參考Bandin等[7]報道的方法。取健康新生兒臍帶，在無菌條件下用PBS反復沖洗直至液體清亮，使用0.1%Ⅰ型膠原酶室溫消化20～30 min，收集膠原酶細胞混合液，1 000 r/min離心7 min，棄上清，用預溫的完全培養液(60% M199，20% SFM，20% FBS，2 mmol/L谷氨酰胺，60 mg/L ECGS)懸浮細胞，吹打數次后種于培養瓶進行培養。第1～3代用于實驗。通過顯微鏡下觀察細胞的形態以及流式檢測細胞表面標志物CD31鑒定細胞類型。

3實驗方法

3.1內皮細胞衰老模型的建立以及細胞處理 第1～2代臍靜脈內皮細胞消化計數后，以1×104cells/mm2種入不同的培養板或培養皿。待培養24 h后，換用含2%血清的M199培養基饑餓細胞至少8 h，然后加入H2O2進行刺激處理，刺激1 h后置換成正常完全培養基，培養24 h后進行后續實驗。通過衰老相關β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)染色和細胞周期的檢測判斷模型成功與否。

在探討人參皂苷Rb1逆轉內皮細胞早衰及其機制時，細胞分組為：空白對照組(正常完全培養基培養)、模型組(60 μmol/L H2O2作用細胞1 h)及10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L Rb1干預組(10、20和40 μmol/L Rb1作用30 min后加入60 μmol/L H2O2刺激1 h)。

3.2SA-β-Gal染色 SA-β-Gal染色參考Dimri等[8]的方法進行。染色18 h后在倒置顯微鏡下以物鏡(×10)觀察細胞染色情況，進行相關計數和拍照，連續計數400個細胞，統計其中的藍染細胞數目(即SA-β-Gal染色陽性細胞)，藍染細胞/400個細胞為染色百分比，該百分比作為衰老程度的評價標準。

3.3細胞周期測定 各組細胞消化后于低溫離心機300×g離心 5 min，PBS清洗2次，緩慢加入70%冰乙醇，輕柔吹散混勻細胞，于4 ℃固定過夜；次日300×g離心5 min棄去乙醇，冷PBS清洗細胞2次，加入終濃度為50 mg/L PI染液，4 ℃避光反應60 min，隨后流式細胞術檢測分析各組的細胞周期時相。

3.4Western blot實驗 細胞蛋白提取方法按照南京凱基生物有限公司全蛋白提取試劑盒說明書執行。隨后按照上海生工生物工程技術服務有限公司BCA蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白量。經BCA定量后，10 μg樣品蛋白進行SDS-PAGE分離，然后轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h后，加入抗caveolin-1(1∶10 000)抗體，4 ℃搖床過夜孵育12 h以上。 I 抗孵育結束后，棄去 I 抗，TBST洗膜 5 min×3次，加入羊抗兔 II 抗(1∶40 000)，室溫孵育1 h，TBST洗3次后使用化學發光法曝光顯影。最后用Quantity One軟件掃描條帶，分析圖像。

3.5激光共聚焦成像觀察 將第1～2代細胞消化計數，種于含有玻璃蓋片的6孔板中，培養24 h后，用含2%胎牛血清的M199培養基同步化細胞，同步化次日加入相應處理因素，處理好的細胞再培育24 h，隨后棄去培養基，PBS洗滌2次后使用4%多聚甲醛固定細胞15 min，用預冷的TBST輕柔洗滌細胞2次，再用含0.25% Triton X-100的TBST孵育細胞7 min進行打孔，隨后使用碧云天封閉液封閉60 min，先后加入 I 抗、II 抗和Hoechst染色液進行不同時間孵育，封片避光過夜。最后在正置熒光顯微鏡下觀察，進行激光掃描共聚焦觀察。

4統計學處理

用SPSS 16.0 軟件進行統計分析。計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示。多組數據間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1HUVECs培養形態學觀察及鑒定

HUVECs單層生長，早期呈小多角形，胞漿豐富，核清晰，細胞融合后呈典型鋪路石樣排列(圖1)。CD31(血小板內皮細胞黏附分子1)被廣泛應用于鑒定內皮細胞，本實驗的流式細胞術分析結果顯示，第1代和第2代人臍靜脈內皮細胞的CD31陽性率分別為99.9%和99.6%，符合內皮細胞特性(圖2)。

Figure 1. Normal appearance of HUVECs.

圖1人臍靜脈內皮細胞顯微鏡下形態

Figure 2. The identification of HUVECs via CD31 with flow cytometry. A: the cells at passage 1 (left: negative control; right: positive rate of CD31 on the surface of cells); B: the cells at passage 2 (left: negative control; right: positive rate of CD31 on the surface of cells).

圖2流式細胞術檢測細胞表面CD31鑒定內皮細胞

2Rb1對H2O2誘導的早熟性衰老HUVECsSA-β-Gal染色的影響

本課題組既往的研究顯示40～100 μmol/L H2O2可以有效地誘導HUVECs衰老，且未引起明顯凋亡，基于后續實驗對細胞數目的要求，我們選用60 μmol/L H2O2刺激HUVECs建立衰老模型[6, 9]。從圖3中我們可以看到，60 μmol/L H2O2刺激組與對照組相比，細胞形態失去鋪路石樣排列外觀，細胞體積變大、呈扁平狀，SA-β-Gal染色陽性細胞數明顯升高(P<0.01)。Rb1 (10、20和40 μmol/L)作用于H2O2誘導的早熟性衰老HUVECs，與H2O2組相比，SA-β-Gal染色陽性細胞數明顯降低(P<0.01)，以20 μmol/L Rb1組效果最佳，見圖3。

Figure 3. The effect of Rb1 pretreatment on H2O2-induced senescence in the HUVECs detected by SA-β-Gal staining (×100). Senescent cells were identified as blue-stained cells. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsH2O2group.

圖3不同濃度Rb1預處理對于各組細胞衰老染色的影響

3Rb1對H2O2誘導的早熟性衰老HUVECs細胞周期的影響

H2O2誘導的早熟性衰老模型組細胞G0/G1期比例明顯高于對照組(P<0.05)，S期細胞明顯低于對照組(P<0.05)；10 μmol/L Rb1作用于HUVECs，與衰老模型組相比，G0/G1期比例降低(P<0.05)，S期細胞比例增多，但差異無統計學顯著性；20和40 μmol/L Rb1作用于HUVECs，與衰老模型組相比，G0/G1期比例降低(P<0.05)，S期細胞比例增多(P<0.05)；20 μmol/L Rb1組與40 μmol/L Rb1組各期細胞比例的差異無統計學顯著性，見圖4。

4Rb1對H2O2誘導的早熟性衰老HUVECscaveolin-1蛋白的影響

為了評估Rb1抗內皮細胞衰老是否與caveolin-1有關，我們分別使用Western blot和激光共聚焦技術對caveolin-1蛋白表達進行了檢測。Western blot結果顯示，與對照組相比，60 μmol/L H2O2組的caveolin-1蛋白表達明顯增多，Rb1(10、20和40 μmol/L)預處理后，caveolin-1表達減少。其中，以20 μmol/L Rb1組的效果最佳(P<0.05)，見圖5。

Figure 4. The effect of Rb1 pretreatment on cell cycle in the HUVECs. The cell cycle was detected by flow cytometry with PI staining. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsH2O2.

圖4不同濃度Rb1預處理對于各組細胞周期的影響

同時，我們采用激光共聚焦技術對caveolin-1的蛋白表達進行了檢測。如圖6所示，與對照組相比，60 μmol/L H2O2組內皮細胞胞漿體積明顯增大，形態扁平，caveolin-1熒光強度變強，其在胞膜和胞漿分布均增多，說明caveolin-1蛋白表達明顯增多；20 μmol/L Rb1預處理后，胞漿體積有所減小，caveolin-1熒光強度變暗，胞膜和胞漿分布均減少，說明其表達減少。

Figure 5. The effect of Rb1 on the protein expression of caveolin-1 in the HUVECs. The protein level of caveolin-1 was evaluated by Western blot with caveolin-1 antibody. GAPDH served as loading control. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsH2O2.

圖5Rb1對HUVECscaveolin-1蛋白的影響

Figure 6. The effect of Rb1 on the expression of caveolin-1 in the HUVECs evaluated by confocal laser-scanning microscopy (×400).

圖6激光掃描共聚焦顯微鏡觀察H2O2處理及人參皂苷Rb1預處理后HUVECscaveolin-1的表達

討 論

本課題研究發現，60 μmol/L H2O2能夠有效地誘導原代人臍靜脈內皮細胞的衰老，而人參皂苷Rb1可通過抑制caveolin-1的表達發揮延緩H2O2誘導的人臍靜脈內皮細胞早熟性衰老的作用。

胞膜窖是細胞質膜內陷形成的囊狀結構。在大部分細胞類型包括內皮細胞，caveolin-1是胞膜窖的重要功能蛋白。Caveolin-1具有特殊的腳手架區(caveolin scaffolding domain，CSD)，該區可介導ca-veolin-1與許多信號分子之間的直接作用，成為多條信號通路的樞紐中心，影響信號轉導、細胞代謝、膽固醇平衡、自噬、腫瘤增殖或抑制等過程，近年來，其在細胞衰老方面的作用日益被關注[15]。Feng等[16]的研究發現caveolin-1與高糖誘導的人腎小球系膜細胞衰老有關，阻斷caveolin-1能顯著地減少細胞衰老，其可能與P53途徑有關。Volonte等[1]的研究表明caveolin-1能結合Sirt1，從而抑制Sirt1的活性，促進成纖維細胞的衰老以及IL-6的分泌。Rippe等[17]在研究microRNA變化與內皮細胞衰老的關系時發現，caveolin-1抑制miR-133a，抑制eNOS的活性，在衰老人動脈內皮細胞中，caveolin-1表達增多。Powter 等[18]的研究發現胞膜窖可調控內皮細胞一種新的抗炎衰老表型，在H2O2誘導或過表達ARHGAP18/SENEX誘導的衰老內皮細胞中，胞膜窖和caveolin-1表達明顯增多。與既往在不同細胞模型中的研究結果類似，我們的研究發現在氧化應激誘導的人臍靜脈內皮細胞衰老模型中，caveolin-1表達明顯增多，說明caveolin-1表達與內皮細胞衰老密切相關。

人參首見于《神農本草經》，具有“補五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目開心益智，久服輕身延年”等作用，其作為補氣藥在中國使用已超過2 000余年。人參皂苷Rb1是人參發揮藥理作用的主要成分之一[19]。近年來，已有部分研究證實，人參皂苷Rb1在心血管及神經系統中具有保護作用[20-24]。Lan等[23]的研究證實人參皂苷Rb1可通過激活PI3K/Akt途徑、抑制PKC從而改善同型半胱氨酸引起的內皮細胞損傷。Xu 等[24]的研究發現人參皂苷Rb1可上調NO水平、刺激ghrelin表達，保護同型半胱氨酸損傷的內皮細胞。我們的研究發現人參皂苷Rb1可改善內皮細胞衰老，目前人參皂苷Rb1抗內皮細胞衰老的研究并不多見。我們課題組既往的研究發現H2O2刺激的衰老內皮細胞ROS水平明顯增加，MDA水平增高，SOD1活性明顯下降，細胞內SOD1 mRNA及蛋白水平明顯減少，eNOS表達和NO含量明顯下降，以上作用均能被人參皂苷Rb1有效地逆轉[6, 9]。本研究中發現，在加入不同濃度人參皂苷Rb1預處理后，H2O2誘導的內皮細胞衰老能被有效地遏制，大且扁平、多形核的細胞數目減少，SA-β-Gal染色陽性細胞數明顯減少，G0/G1期細胞比例降低，S期細胞比例增多，caveolin-1表達減少，說明人參皂苷Rb1具有抗衰老作用，其抗衰老作用可能與Rb1調節caveolin-1的表達相關。并且在大多數情況下，以20 μmol/L Rb1預處理的抗衰老效果最佳，提示在我們的研究中人參皂苷Rb1逆轉H2O2誘導的內皮細胞衰老并不是劑量依賴的。本研究從caveolin-1角度進行探討，發現人參皂苷Rb1抗衰老可能與Rb1調節caveolin-1的表達相關。我們的研究進一步豐富了人參皂苷Rb1抗內皮細胞衰老的機制。

本研究結果表明人參皂苷單體Rb1可能通過抑制caveolin-1的表達發揮延緩H2O2誘導的人臍靜脈內皮細胞早熟性衰老的作用。本課題探索了人參皂苷Rb1防治內皮細胞衰老的可行性及部分機制，但仍需在體外及體內實驗進一步深入探討其上游及下游機制。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Rb1 protects human umbilical vein endothelial cells from hydrogen peroxide-induced senescence: involvement of caveolin-1

LIU Ding-hui1, WU Lin1, YU Shu-jie1, ZHOU Bin1, WANG Min1, LIU Yong1, HAO Bao-shun1, ZHENG Zhen-da1, QIAN Xiao-xian1, 2

(1Department of Cardiology, The Third Affiliated Hospital，2Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, China. E-mail: xiaoxianq@qq.com)

AIM: Endothelial cell senescence has been proposed to be involved in endothelial dysfunction and atherogenesis. This study aims to investigate the effects of ginsenoside Rb1, a major constituent of ginseng, on hydrogen peroxide (H2O2)-induced endothelial cell senescence， and to explore the expression and production of caveolin-1 in H2O2-induced premature senescence.METHODS: The senescence of primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was induced by H2O2as judged by morphology inspection, senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) staining and cell cycle detection. The protein expression of caveolin-1 was determined by Western blot and confocal laser-scanning microscopy.RESULTS: Treatment of the HUVECs with H2O2at 60 μmol/L induced premature senescence, as judged by enlarged, flattened cell morphology, increased SA-β-Gal activity and sustained growth arrest. H2O2effectively increased caveolin-1 level. Pretreatment of the HUVECs with Rb1 was found to reverse endothelial cell senescence, as witnessed by a significant decrease in senescent cell numbers and a decreased percentage of G0/G1phase cells. Furthermore, Rb1 administration reversed the H2O2-increased protein level of caveolin-1.CONCLUSION: Ginsenoside Rb1 antagonizes H2O2-induced endothelial cell senescence through caveolin-1 modulation.

Cell senescence; Caveolin-1; Human umbilical vein endothelial cells; Ginsenoside Rb1

1000- 4718(2017)09- 1544- 07

2017- 02- 06 [

] 2017- 03- 22

國家自然科學基金資助項目(No. 81370447)； 廣東省自然科學基金博士啟動項目(No. 2015A030310048)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.002

△通訊作者 Tel: 0738-85252168； E-mail: xiaoxianq@qq.com