核受體NR6A1通過上調RIPK3基因表達誘導血管平滑肌細胞凋亡*

張亞輝， 汪 雄， 吳勝英， 彭吉霞， 武福云， 柯 鏡， 張 鵬， 張秋芳， 呂艷霞

(湖北醫藥學院病理生理學教研室， 湖北 十堰 442000)

核受體NR6A1通過上調RIPK3基因表達誘導血管平滑肌細胞凋亡*

張亞輝， 汪 雄， 吳勝英， 彭吉霞， 武福云， 柯 鏡， 張 鵬， 張秋芳， 呂艷霞△

(湖北醫藥學院病理生理學教研室， 湖北 十堰 442000)

目的： 探討核受體亞家族6A1(NR6A1)對血管平滑肌細胞凋亡的影響及可能的分子機制。方法: 將腺病毒Ad-NR6A1感染大鼠血管平滑肌細胞，分別在感染后0 h、24 h和48 h時進行MTT實驗，以時間為橫坐標，A570為縱坐標繪制細胞生長曲線，觀察NR6A1對細胞生長的影響；進行DAPI染色、TUNEL染色及caspase活性檢測，觀察細胞凋亡情況； 進一步通過基因芯片技術，尋找NR6A1的靶基因；采用siRNA介導的基因沉默技術，觀察受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3(RIPK3)基因沉默對NR6A1誘導的血管平滑肌細胞凋亡的影響。結果: 腺病毒Ad-NR6A1感染細胞48 h時，NR6A1過表達組細胞數量較對照組(重組腺病毒載體Ad-LacZ)明顯減少；DAPI染色顯示NR6A1過表達誘導血管平滑肌細胞出現核濃縮和核碎裂的凋亡表型，TUNEL染色顯示NR6A1過表達引起細胞凋亡，caspase活性檢測結果顯示NR6A1過表達細胞內caspase-3、caspase-8和caspase-9活性均較對照組高；基因芯片技術檢測發現，NR6A1過表達上調血管平滑肌細胞中RIPK3基因表達；RIPK3基因沉默可以顯著抑制NR6A1誘導的平滑肌細胞凋亡。結論: NR6A1通過上調RIPK3基因表達誘導血管平滑肌細胞凋亡。

核受體亞家族6A1； 受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3； 細胞凋亡

核受體亞家族6A1(nuclear receptor subfamily 6，group A，member 1，NR6A1)又名生殖細胞核因子(germ cell nuclear factor，GCNF)，是目前發現的核受體超家族第6亞族唯一的成員。核受體家族在調節生長發育、生殖、代謝及維持內環境穩定等方面發揮了重要作用。已有研究表明NR6A1在生殖及神經發育中具有重要生物學作用。NR6A1通過調節魚精蛋白、線粒體3-磷酸甘油脫氫酶、endozepine樣肽等基因的表達，影響精子的成熟、活力[1-3]；NR6A1還可以下調BMP-15和GDF-9基因的表達，從而調節卵泡發育[4]。NR6A1基因缺陷的小鼠胚胎出現神經發育障礙及心血管缺陷[5]。研究發現，NR6A1能夠抑制Oct4基因表達，調節神經細胞分化[6]；通過抑制miR-302a調節cyclin D1表達，影響胚胎干細胞分化[7]。Rajkovic等[2]報道，NR6A1能夠與CREMτ競爭結合靶基因啟動子，影響下游基因表達。我們前期研究發現，平滑肌細胞中的NR6A1能夠與細胞核actin和RNA聚合酶Ⅱ形成復合物，抑制平滑肌細胞內源性骨橋蛋白(osteopontin)的轉錄水平，并調節平滑肌細胞遷移[8]。本研究觀察了NR6A1對血管平滑肌細胞凋亡的影響及可能的分子機制。

材料和方法

1材料和試劑

Ad-NR6A1腺病毒由本實驗室制備[9]；DMEM及胎牛血清購自Gibco；小鼠抗FLAG標簽抗體和TRITC偶聯的羊抗小鼠IgG購自Santa Cruz；紫杉醇(paclitaxel)購自成都曼思特生物科技公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒和caspase活性檢測試劑盒購自Millipore；小鼠抗受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2(receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2，RIPK2)和RIPK3抗體購自Santa Cruz；RIPK3干擾片段購自上海生工生物科技有限公司；SYBR Green PCR試劑盒購自Clontech。

2方法

2.1免疫熒光化學染色技術 將體外培養的大鼠血管平滑肌細胞接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養至90%融合。將Ad-NR6A1感染細胞，24 h后細胞經4%多聚甲醛固定，進行常規的免疫熒光化學染色，用抗FLAG標簽抗體為 I 抗在4 ℃孵育過夜，隨后用TRITC標記的 II 抗顯示NR6A1的表達，用DAPI標記細胞核，采用相同種屬的IgG作為陰性對照抗體，在共聚焦顯微鏡下觀察染色結果并照相。

2.2RNA提取及RT-qPCR技術 將體外培養的大鼠血管平滑肌細胞接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養至90%融合。然后向細胞加入10 nmol/L濃度的paclitaxel，分別在0 h、6 h、12 h和24 h后用Trizol試劑提取總RNA。采用逆轉錄試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒做RT-qPCR反應，檢測靶基因的表達。

2.3細胞凋亡的檢測 如上述方法接種血管平滑肌細胞于6孔板中，將Ad-NR6A1-FLAG感染細胞，分別在感染后0 h、24 h和48 h時進行MTT實驗，以時間為橫坐標，A570為縱坐標繪制細胞生長曲線，觀察NR6A1對細胞生長的影響；進行DAPI染色和TUNEL染色，觀察細胞凋亡情況。Ad-NR6A1感染細胞48 h后用4%多聚甲醛固定，加入新鮮配制的TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，在共聚焦顯微鏡下觀察染色結果并照相。Caspase活性檢測按試劑盒操作要求，在Ad-NR6A1感染細胞48 h后裂解細胞，離心收集上清，使樣品與底物37 ℃孵育約2 h，測定A570值，根據對硝基苯胺標準曲線和樣品A值，計算出caspase酶活性。

2.4蛋白免疫印跡技術 收集腺病毒感染后的細胞，制備蛋白樣品。Ad-NR6A1感染血管平滑肌細胞24～48 h后收集細胞，運用RIPA裂解液提取總蛋白，蛋白變性后采用SDS-PAGE及ECL顯色檢測相關蛋白水平。

2.5siRNA介導的基因沉默 將體外培養的大鼠血管平滑肌細胞接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養至60%～80%融合，使用前換成無血清培養基培養。分別用Opti-MEM reduced serum medium 稀釋Lipo2000與siRNA,將稀釋好的siRNA與Lipo2000輕輕混勻，室溫培養20～25 min，將siRNA-Lipo2000混合液加入細胞，37 ℃的CO2培養箱中培養4～6 h，換成完全培養基，繼續培養24 h后裂解細胞提取總蛋白，運用Western blot檢測基因沉默效果。

2.6基因表達譜芯片技術 Ad-LacZ或者Ad-NR6A1感染血管平滑肌細胞24h，采用Trizol法提取總RNA，由上海生工生物技術有限公司行Affymetrix表達譜分析。

3統計學分析

采用SPSS軟件處理，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1NR6A1表達于血管平滑肌細胞核中

既往研究顯示NR6A1表達于細胞核中。我們首先觀察了NR6A1在平滑肌細胞中的亞細胞定位。免疫熒光化學技術發現，血管平滑肌細胞中所表達的融合蛋白NR6A1與細胞核有共定位，提示NR6A1定位在血管平滑肌細胞核內，見圖1。

Figure 1. The sub-cellular localization of NR6A1 in the VSMCs (×400). VSMCs were infected with Ad-NR6A1 for 24 h. Indirect immunofluorescence staining of VSMCs with anti-NR6A1 and tetramethylrhodamine isothiocyanate-conjugated donkey anti-rabbit antibodies was performed. The nuclei stained with DAPI were shown. The negative controls were stained with normal IgG only. The arrows pointed at VSMCs were positive for NR6A1.

圖1免疫熒光化學技術檢測NR6A1在平滑肌細胞中的定位

2紫杉醇增加血管平滑肌細胞中NR6A1的表達

RT-qPCR結果顯示，在紫杉醇處理平滑肌細胞12 h和24 h后，可以抑制細胞中actin的表達，同時NR6A1 mRNA的表達較對照組明顯增加，提示NR6A1是紫杉醇的靶基因，見圖2。

Figure 2. The effect of paclitaxel on mRNA expression of NR6A1 in the VSMCs. Serum-starved VSMCs were treated with paclitaxel for 6 h, 12 h and 24 h. The mRNA levels of NR6A1 were measured by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2紫杉醇對平滑肌細胞中NR6A1mRNA表達的影響

3NR6A1過表達引起血管平滑肌細胞凋亡

在Ad-NR6A1感染細胞后0 h、24 h和48 h時進行MTT實驗，Western blot顯示腺病毒誘導NR6A1蛋白過表達(圖3A)。以時間為橫坐標，A570為縱坐標繪制細胞生長曲線，結果表明，48 h時NR6A1過表達組細胞數量較對照組明顯減少(圖3B)。DAPI染色顯示NR6A1過表達誘導血管平滑肌細胞出現核濃縮和核碎裂的凋亡表型，TUNEL染色結果顯示NR6A1過表達引起細胞凋亡(圖3C)。進一步的caspase活性檢測結果顯示NR6A1過表達組細胞內caspase-3、caspase-8和caspase-9活性均較對照組高(圖3D)。

4凋亡信號基因RIPK3是NR6A1靶基因

本研究通過基因芯片技術檢測發現，NR6A1過表達可以上調血管平滑肌細胞中的169個基因，下調217個基因(圖4A)。另外我們對挑選出來的差異表達基因做了gene ontology的統計分析，發現NR6A1參與調節免疫反應、氧化還原反應、蛋白水解、發育、轉錄調節等生物學過程(圖4B)。其中，凋亡信號調節基因RIPK3是NR6A1的靶基因，芯片結果顯示NR6A1過表達可以上調平滑肌細胞中RIPK3基因表達(圖4C)。進一步采用蛋白免疫實驗發現，NR6A1過表達可以增加平滑肌細胞RIPK2和RIPK3的蛋白表達，其中主要增加了RIPK3的表達(圖4D)。

Figure 3. The effect of NR6A1 over-expression on VSMC apoptosis. VSMCs were infected by Ad-LacZ or Ad-NR6A1 at 100 MOI for 48 h. A: NR6A1 protein levels in the cells were determined by Western blot; B: the cell viability was assessed by MTT assay; C: the cell apoptosis was analyzed by TUNEL assay (×200); D: the activities of caspase-3, 8 and 9 in the VSMCs were measured by colorimetric enzymatic assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsAd-LacZ group.

圖3NR6A1過表達對平滑肌細胞凋亡的影響

Figure 4. The effect of NR6A1 over-expression on VSMC signal pathways and RIPK expression. A: log-log scatter plot of NR6A1 over-expression group (X axis) and control group (Y axis) was shown (the red labeled valid points and green labeled valid points were the ratio values of the fluorescence signal intensity in the 2 groups ≥2 or ≤0.5, respectively, indicating the genes with differential expression； the black labeled valid points were the ratio values of the fluorescence signal intensity in the 2 groups between 0.5 and 2, indicating the genes without differential expression); B: statistic analysis of gene ontology (GO) for the differentially expressed genes (the minimalPvalues of the 10 categorizations of GO analysis were shown); C: the effect of NR6A1 over-expression on RIPK expression was measured by DNA microarray; D: the effect of NR6A1 over-expression on RIPK expression was analyzed by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsAd-LacZ group.

圖4NR6A1過表達對平滑肌細胞信號途徑和RIPK表達的影響

5RIPK3基因沉默抑制NR6A1誘導的平滑肌細胞凋亡

本研究采用siRNA介導的基因沉默技術，敲低了RIPK3基因，觀察RIPK3基因是否是NR6A1誘導平滑肌細胞凋亡的分子機制。結果顯示，RIPK3基因沉默可以顯著抑制NR6A1誘導的平滑肌細胞凋亡，見圖5。

Figure 5.RIPK3 silencing inhibited NR6A1-induced apoptosis of the VSMCs. The VSMCs were transfected withRIPK3 siRNA fragments for 24 h. A: the protein expression of RIPK3 was determined by Western blot; B: the cell viability was analyzed by MTT assay； C: the caspase activities were measured. Mean±SD.n=3.*P< 0.05,**P<0.01vsAd-LacZ group;#P<0.05vsscrambled siRNA group.

圖5RIPK3基因沉默對NR6A1誘導的平滑肌細胞凋亡的影響

討 論

心腦血管疾病已成為目前死亡率最高的疾病，其具有“發病率高、死亡率高、致殘率高”的特點，嚴重威脅中老年人健康。它們共同的病理基礎是動脈粥樣硬化、內膜增生。病變部位主要在大型及中型肌彈力型動脈，尤其以主動脈、冠狀動脈及腦動脈多見。在動脈粥樣硬化進展過程中，血管平滑肌細胞從動脈中膜增殖并遷移至內膜下是動脈粥樣硬化及內膜增生的重要發病環節之一，造成血管腔狹窄，是引起血管腔閉塞的重要原因[10]。因此探尋抑制平滑肌細胞的增殖與遷移或促進平滑肌細胞凋亡的分子機制是心腦血管疾病研究領域的熱點問題。

NR6A1是目前發現的核受體超家族第6亞族唯一的成員。核受體超家族在調節胚胎生長發育、生殖、代謝及維持內環境穩定等方面發揮了重要作用[11-13]。人與大鼠NR6A1基因的同源性、蛋白結構功能的一致性超過90%。NR6A1由A/B、C、D和E四個結構域組成：A/B區高度可變，包含至少一種本身有活性的配體非依賴性的轉錄激活域；保守的C域為DNA結合區，包含2個鋅指結構可以和靶基因上的激素應答元件或其它特異性DNA序列結合，如AGGTCAAGGTCA及TCAAGGTCAAGGTCA；D域為一鉸鏈區可與輔抑制子結合；最大的E域能夠與配體結合，二聚體化并被激活，發揮轉錄因子的作用，調控下游靶基因[14]。但是與其它核受體不同的是，NR6A1對靶基因的作用主要表現為抑制效應。比如，NR6A1可以下調BMP-15和GDF-9基因的表達，從而調節卵泡發育[4]；NR6A1能夠抑制Oct4基因表達，調節神經細胞分化[6]；還通過抑制miR-302a調節cyclin D1表達，影響胚胎干細胞分化[7]。

我們前期研究發現，NR6A1過表達能夠抑制PDGF-BB和血清誘導的血管平滑肌細胞遷移，NR6A1可以與RNA聚合酶Ⅱ和細胞核中的actin形成大復合物，并進而結合cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)，抑制CREB對分泌型磷蛋白1(secreted phosphoprotein-1，SPP1)基因的轉錄激活，從而下調SPP1基因表達[8]。可見，NR6A1是調節血管平滑肌細胞的重要分子。

本研究進一步探討了NR6A1過表達對平滑肌細胞凋亡的影響，結果發現NR6A1過表達48 h可引起平滑肌細胞明顯凋亡，細胞內caspase-3、caspase-8和caspase-9活性均升高，以caspase-3活性升高最明顯。進一步的實驗表明NR6A1過表達能增加RIPK3的基因表達。RIPK3是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體相互作用蛋白家族的一員，其氨基端為特征性的絲/蘇氨酸激酶結構域，羧基端為RIPK3所獨有的結構域[14]。有研究顯示，作為腫瘤壞死因子受體1信號復合物的一部分，RIPK3能誘導細胞凋亡[15-16]。本研究發現RIPK3基因沉默則抑制NR6A1過表達誘導的平滑肌細胞凋亡。因此我們認為NR6A1很可能通過上調RIPK3的基因表達，啟動平滑肌細胞內的caspase凋亡信號通路導致細胞凋亡。NR6A1調節RIPK的分子機制還有待進一步研究。

[1] Hummelke GC, Cooney AJ. Reciprocal regulation of the mouse protamine genes by the orphan nuclear receptor germ cell nuclear factor and CREMτ[J]. Mol Reprod Dev, 2004, 68(4):394-407.

[2] Rajkovic M, Middendorff R, Wetzel MG, et al. Germ cell nuclear factor relieves cAMP-response element modulator τ-mediated activation of the testis-specific promoter of human mitochondrial glycerol-3-phosphate dehydrogenase[J]. J Biol Chem, 2004, 279(50):52493-52499.

[3] Valentin M, Balvers M, Pusch W, et al. Structure and expression of the mouse gene encoding the endozepine-like peptide from haploid male germ cells[J]. Eur J Biochem, 2000, 267(17):5438-5449.

[4] Lan ZJ, Gu P, Xu X, et al. GCNF-dependent repression of BMP-15 and GDF-9 mediates gamete regulation of female fertility[J]. EMBO J, 2003, 22(16): 4070-4081.

[5] Cooney AJ, Lee CT, Lin SC, et al. Physiological function of the orphans GCNF and COUP-TF[J]. Trends Endocrinol Metab, 2001, 12(6):247-251.

[6] Fuhrmann G, Chung AC, Jackson KJ, et al. Mouse germline restriction of Oct4 expression by germ cell nuclear factor[J]. Dev Cell, 2001, 1(3):377-387.

[7] Wang H, Wang X, Archer TK, et al. GCNF-dependent activation of cyclin D1 expression via repression of Mir302a during ESC differentiation[J]. Stem Cells, 2014, 32(6):1527-1537.

[8] Wang Y, Zhang Y, Dai X, et al. NR6A1 couples with cAMP response element binding protein and regulates vascular smooth muscle cell migration[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2015, 69:225-232.

[9] 張亞輝， 錢 航， 張志峰， 等.NR6A1過表達腺病毒載體構建及在血管平滑肌細胞中的表達[J]. 湖北醫藥學院學報, 2012, 31(3):181-185.

[10] 王瑾瑜， 周 允， 馮 寒， 等.脂肪因子CTRP3促進血管鈣化機制研究[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 11(28):2033-2034.

[11] Zhao H, Li Z, Cooney AJ, et al. Orphan nuclear receptor function in the ovary[J]. Front Biosci, 2007, 12:3398-3405．

[12] Schote AB, Turner JD, Schiltz J, et al. Nuclear receptors-in human immune cells: expression and correlations[J]. Mol Immunol, 2007, 44(6):1436-1445．

[13] Mullen EM, Gu P, Cooney AJ. Nuclear receptors in regulation of mouse ES cell pluripotency and differentiation[J]. PPAR Res, 2007, 2007:61563．

[14] Hentschke M, Kurth I, Borgmeyer U, et al. Germ cell nuclear factor is a repressor of CRIPTO-1 and CRIPTO-3[J]. J Biol Chem, 2006, 281(44):33497-33504.

[15] Sun X, Lee J, Navas T, et al. RIP3, a novel apoptosis-inducing kinase[J]. J Biol Chem, 1999, 274(24):16871-16875.

[16] Vandenabeele P, Declercq W, Van Herreweghe F, et al. The role of the kinases RIP1 and RIP3 in TNF-induced necrosis[J]. Sci Signal, 2010, 3(115):re4.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

NR6A1 promotes vascular smooth muscle cell apoptosis by up-regulating RIPK3 gene expression

ZHANG Ya-hui, WANG Xiong, WU Sheng-ying, PENG Ji-xia, WU Fu-yun, KE Jing, ZHANG Peng, ZHANG Qiu-fang, LV Yan-xia

(Department of Pathophysiology, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China. E-mail: 350182495@qq.com)

AIM: To determine the role of nuclear receptor subfamily 6， group A， member 1 (NR6A1) in vascular smooth muscle cell (VSMC) apoptosis.METHODS: NR6A1 protein was over-expressed in the VSMCs by infection of adenovirus. The effect of NR6A1 on the viability of VSMCs was measured by MTT assay. DAPI staining, TUNEL staining and caspase activity assay were conducted. DNA microarray was used to quickly screen the target genes of NR6A1. The effect of receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3 (RIPK3) silencing on NR6A1-induced apoptosis of the VSMCs was further analyzed.RESULTS: Adenovirus-mediated over-expression of NR6A1 induced the apoptosis of VSMCs. TheRIPK3 gene expression was up-regulated by NR6A1 over-expression in the VSMCs. NR6A1-induced VSMC apoptosis was inhibited byRIPK3 silencing.CONCLUSION: NR6A1 promotes VSMC apoptosis by up-regulating theRIPK3 gene expression.

Nuclear receptor subfamily 6， group A， member 1; Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3; Apoptosis

1000- 4718(2017)09- 1581- 06

2017- 02- 16 [

] 2017- 07- 12

湖北省教育廳科學研究計劃指導性項目(No. B2015492)；湖北省自然科學基金資助項目(No. 2014CFB187)；國家自然科學基金資助項目(No. 81641140)

R363.1； R543

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.007

△通訊作者 Tel: 0719-8875312; E-mail: 350182495@qq.com