反義鎖核酸封閉c-myc第二外顯子翻譯起始區對肝癌細胞凋亡的影響*

鄧益斌， 肖樹榮， 許桂丹， 黃贊松

(右江民族醫學院附屬醫院醫學檢驗中心，廣西 百色 533000)

反義鎖核酸封閉c-myc第二外顯子翻譯起始區對肝癌細胞凋亡的影響*

鄧益斌， 肖樹榮， 許桂丹， 黃贊松△

(右江民族醫學院附屬醫院醫學檢驗中心，廣西 百色 533000)

目的： 探討針對c-myc第二外顯子翻譯起始區的反義鎖核酸對肝癌細胞活力和凋亡的影響。方法: 設計合成能特異性封閉c-myc基因第二外顯子翻譯起始區的反義寡核苷酸、硫代寡核苷酸和鎖核酸，分別以陽離子脂質體介導轉染HepG2細胞，采用RT-PCR檢測細胞內c-Myc的mRNA表達變化；Western blot檢測細胞內c-Myc的蛋白表達變化；流式細胞技術檢測細胞凋亡情況；MTT法檢測反義鎖核酸的細胞毒性作用。結果: 轉染第5天后，反義鎖核酸組c-Myc的mRNA相對表達量為0.335±0.016，明顯低于對照組(P<0.05)；c-Myc蛋白相對表達量為0.448±0.037，也明顯低于對照組(P<0.01)；凋亡細胞比例為32%±6%，顯著高于對照組(P<0.05)。結論: 針對c-myc第二外顯子翻譯起始區的反義鎖核酸能有效促進肝癌細胞的凋亡。

肝細胞癌；c-myc基因； 反義鎖核酸

原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤之一，占我國肝癌的90%以上，嚴重威脅著人類的生命健康，自20世紀90年代起，我國肝癌死亡率上升為腫瘤的第2位。c-myc是細胞原癌基因之一，與腫瘤的發生發展關系密切，位于人類染色體8q24區，由3個外顯子和2個內含子組成，其中第1外顯子無編碼序列，只起調控作用，第2、3外顯子共同編碼包含439個氨基酸殘基的蛋白質，該蛋白主要與Max形成異二聚體后再與DNA核心序列結合，調控基因轉錄與表達[1-3]。據此推測，針對c-myc第二外顯子翻譯起始區設計合成反義鎖核酸有可能會影響c-Myc的mRNA及蛋白的表達，通過影響腫瘤細胞增殖和凋亡發揮抗腫瘤作用。因此，在前期研究基礎上[4-7]，我們進一步設計合成能特異性封閉c-myc基因第二外顯子翻譯起始區的反義鎖核酸(antisense locked nucleic acid，anti-LNA)，以陽離子脂質體介導轉染HepG2細胞，觀察其對c-Myc的mRNA及蛋白表達的影響，以期為抗肝癌基因治療尋找一種新型分子藥物。

材料和方法

1細胞系

HepG2肝癌細胞株由中國人民解放軍廣州軍區空軍醫院劉光澤博士惠贈，常規培養于含G418和10%胎牛血清的DMEM培養基中，37 ℃、5% CO2條件下5～6 d傳代1次。

2主要試劑與儀器

DMEM培養基和G418(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen)；RNA抽提試劑盒(Sangon)；寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸、禽成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、Taq酶、緩沖液、三磷酸脫氧核苷酸等(TaKaRa)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司)；BCA蛋白定量試劑盒、十二烷基硫酸鈉(SDS)、硝酸纖維膜、ECL發光液等(Sigma)。實時定量PCR儀(ABI)；FACS AriaTM流式細胞分析儀(BD)；半干電轉系統(Bio-Rad)。

3方法

3.1反義LNA設計與合成 根據反義寡核苷酸作用原理及設計原則，利用RNAstructure 5.0軟件設計并篩選出一條總自由能最低的互補于c-myc第2外顯子翻譯起始區(368～390 nt)的寡核苷酸片段，修飾如下：(1)LNA：5′-TGA△AGCT△ACCGT△ACT△ACGA△C-3′；(2)硫代寡核苷酸：5′-TGA#AGCT#ACCGT#ACT#ACGA#C-3′；(3)未修飾寡核苷酸：5′-TGAAGCTACCGTACTACGAC-3′；(4)無關序列：5′-CGCTATGTAATGCGCTATGG-3′。其中，△代表LNA修飾，#代表硫代修飾。各序列經BLAST排除與人同源后由GeneLink合成修飾并純化。

3.2實驗設計與脂質體轉染 實驗設對照組和實驗組。對照組為空白對照(blank)組。實驗組包括未修飾寡核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)組、硫代寡核苷酸(phosphorothioate oligodeoxynucleotide，S-ODN)組和anti-LNA組。將HepG2細胞按1×108/L接種于16孔培養板，每孔100 μL，共設6個組，每組各設6個復孔，待細胞貼壁后，分別在各組每孔中加入含LNA(或寡核苷酸)的脂質體-DMEM混合液1 mL，培養后第5天收集細胞進行mRNA、蛋白等指標檢測。轉染按脂質體說明書操作。

3.3c-Myc的mRNA檢測 (1)RNA提取：于細胞收集管中加入RNA抽提試劑1 mL，迅速置于冰上，加入0.2 mL氯仿，室溫靜置15 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入0.5 mL異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；棄上清液，加入75%焦碳酸二乙酯乙醇溶液1 mL，4 ℃ 7 500 r/min離心5 min；棄上清液室溫干燥5 min，溶于焦碳酸二乙酯無菌水中。(2)RNA逆轉錄：根據目的基因片段堿基序列利用軟件設計并評價引物，交由上海英駿生物技術有限公司合成純化。在微反應管中配制模板RNA和引物(各組均取上下游引物)混合液，總體積為12 μL。65 ℃ 5 min后，冰上迅速冷卻。加入2×PCR預反應液8 μL，輕輕混勻，室溫靜置10 min，移入42 ℃恒溫箱中保溫60 min后，升至70 ℃保溫10 min，移到冰中冷卻2 min。(3)cDNA擴增：上述反應管移入PCR擴增儀中(上游引物為5′-TCAACGTTAGCTTCACCAAC-3′，下游引物為5′-TGGGCGAGCTGCTGTCGT-3′，產物長度為245 bp)。反應條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 10 min。取PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并與內參照β-actin(550 bp)電泳條帶比較，計算相對灰度比值。

3.4c-Myc蛋白的檢測 收集細胞棄上清，用RIPA細胞裂解液[0.01 mol/L Tris-HCl (pH 7.5)，0.15 mol/L NaCl，1% Triton X-100，0.1% SDS (pH 7.4)，臨用前加入PMSF 100 mmol/L]重懸，轉入Eppendorf管，冰上靜置1 h，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min。取上清于新Eppendorf管，提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒定量，于-70 ℃保存。取30 μg蛋白質樣品與緩沖液[100 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)，200 mmol/L DTT，4% SDS，0.2%溴酚藍，20%甘油]混合煮沸5 min,變性后點樣于預先制備好的12% SDS-PAGE電泳膠板上，30～40 mA電泳，當溴酚藍到達膠板底部時停止電泳。取預處理過的2張3 mm濾紙和1張硝酸纖維膜，按濾紙、凝膠、硝酸纖維膜、濾紙的順序放入半干電轉儀的正極板上，接好負極板后，10～12 V電轉30 min。采用ECL發光液試劑盒進行檢測，并利用凝膠圖像分析系統曝光、拍照和定量分析。

3.5HepG2細胞凋亡的檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞技術檢測HepG2細胞凋亡情況。根據雙變量流式細胞儀的散點圖來判斷結果:左上象限(Q1)為損傷細胞,右上象限(Q2)為壞死細胞,左下象限(Q3)為活細胞,右下象限(Q4)為凋亡細胞。嚴格按試劑盒說明書和儀器說明書操作。

3.6反義LNA的細胞毒性的檢測 采用MTT比色法檢測反義LNA對細胞活性的影響。采用含10%胎牛血清培養液配制單細胞懸液，以每孔1×104個細胞接種于96孔板，每孔200 μL，培養5 d后，每孔加MTT溶液(5 g/L，pH 7.4)200 μL，孵育4 h后，終止培養，吸棄培養上清液。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。酶聯免疫監測儀上于490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值。

4統計學處理

用SPSS 19.0統計軟件進行數據處理和分析，所有數據采用均數±標準差(mean±SD)表示。各組間比較采用重復測量方差分析的SNK-q檢驗和Kruskal Wallis H檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1反義LNA對c-MycmRNA表達的抑制作用

與對照組相比，硫代寡核苷酸組和反義鎖核酸組肝細胞中c-Myc的mRNA表達量均明顯下調，其中反義鎖核酸組下調尤為明顯(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The relative mRNA expression of c-Myc in the HepG2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsanti-LNA group.

圖1各組肝癌細胞c-Myc的mRNA相對表達量

2反義LNA對c-Myc蛋白表達的抑制作用

與對照組相比，反義鎖核酸組肝細胞中c-Myc蛋白相對表達量明顯下降(P<0.01)，見圖2。

3反義LNA對HepG2細胞凋亡的影響

采用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞技術檢測HepG2細胞凋亡情況。結果發現轉染第5天后，硫代寡核苷酸組和反義鎖核酸組的凋亡細胞比例均顯著高于對照組(P<0.05)，反義鎖核酸組的凋亡細胞比例更高一些，見圖3。

Figure 2. c-Myc protein expression level in HepG2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsAnti-LNA group.

圖2各組肝細胞c-Myc蛋白表達水平

Figure 3. The apoptotic rate of HepG2 cells induced by anti-LNA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsanti-LNA group.

圖3各組肝癌細胞的凋亡情況

4反義LNA對細胞的毒性作用

用藥5 d后，采用MTT比色法測定各組A值，未修飾寡核苷酸組、硫代寡核苷酸組和反義鎖核酸組的A值分別為1.18±0.05、1.16±0.04和1.15±0.05，與空白對照組(1.39±0.04)比較差異均無統計學意義，見圖4。

Figure 4. The absorbance values of the HepG2 cells. Mean±SD.n=6.

圖4各組肝癌細胞吸光度值

討 論

目前認為，腫瘤細胞的惡性轉化是一個由多細胞信號轉導通路異常活化，使多種癌基因或抑癌基因表達異常，進一步促進癌癥細胞異常增殖的多環節、多階段、多步驟的復雜過程，而癌基因突變則是腫瘤細胞增殖的分子基礎[8]。常見的癌基因有c-myc(增殖相關基因)、N-ras(轉化基因)等，其中c-myc是新近研究發現的與肝細胞癌變密切相關的癌基因，是myc基因家族的重要成員之一，其編碼蛋白屬于核內轉錄因子，介導細胞生物信號轉導，在細胞凋亡與增殖調控中發揮重要作用[9-11]。因而推測，封閉c-myc第二外顯子翻譯起始區的基因表達有可能會影響c-Myc mRNA及蛋白的表達，進而可能會影響腫瘤細胞凋亡，從而發揮抗腫瘤作用。

本研究利用計算機輔助藥物設計軟件設計合成能特異性封閉c-myc基因第二外顯子翻譯起始區的反義鎖核酸片段，以陽離子脂質體介導轉染HepG2細胞，利用逆轉錄聚合酶鏈反應、Western blot等分子生物學技術檢測細胞內c-Myc的mRNA及蛋白表達情況，評估反義鎖核酸的抗病毒效果。結果發現，反義鎖核酸作用 5 d后，c-Myc的mRNA及蛋白質表達均較對照組明顯下降，且細胞凋亡較對照組明顯增多。因此認為，針對c-myc基因第二外顯子翻譯起始區的反義鎖核酸可有效干擾c-myc基因的表達，進而促進肝癌細胞凋亡。

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(責任編輯： 林白霜， 宋延君)

Effect of antisense locked nucleic acid blocking translation initiation region of c-myc exon 2 on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells

DENG Yi-bin, XIAO Shu-rong, XU Gui-dan, HUANG Zan-song

(Center for Medical Laboratory Science, The Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities, Baise 533000, China. E-mail: 1019846481@qq.com)

AIM: To observe the effect of antisense locked nucleic acid (anti-LNA) blocking the translation initiation region ofc-mycexon 2 on the viability and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.METHODS: The anti-LNA that was complementary to the translation initiation region ofc-mycexon 2 was designed, synthesized, and introduced into the HepG2 cells by cationic liposome-mediated transfection. The mRNA and protein levels of c-Myc in the cells were determined by RT-PCR and Western blot. The change of cell apoptosis was analyzed by flow cytometry, and the toxicity of anti-LNA to the cells was detected by MTT assay.RESULTS: Five days after transfection, the mRNA level of c-Myc in anti-LNA group was 0.335±0.016, and the protein level was 0.448±0.037, significantly lower than those in control group (bothP<0.05). The ratio of apoptotic cells in anti-LNA group was 32%±6%, which was higher than that in control group (P<0.05).CONCLUSION: Antisense locked nucleic acid targeting at the translation initiation region ofc-mycexon 2 shows strong inhibitory effects on the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.

Hepatocellular carcinoma;c-mycgene; Antisense locked nucleic acid

1000- 4718(2017)09- 1602- 04

2016- 09- 12 [

] 2017- 05- 02

國家自然科學基金資助項目(No. 81460123)；廣西衛生廳立項課題(No. Z2010084)；自治區級研究生教育創新計劃項目(No. 201601005)

R961； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.011

△通訊作者 Tel: 0776-2846532； E-mail: 1019846481@qq.com