木犀草素對人肝癌HepG2細胞株侵襲、遷移和黏附能力的影響*

李春雨， 王 琪， 申 珅， 李國霞

(1天津醫科大學國際醫學院，天津 300070； 2同濟大學附屬上海市肺科醫院腫瘤科，上海 200433)

木犀草素對人肝癌HepG2細胞株侵襲、遷移和黏附能力的影響*

李春雨1△， 王 琪2， 申 珅1， 李國霞1

(1天津醫科大學國際醫學院，天津 300070；2同濟大學附屬上海市肺科醫院腫瘤科，上海 200433)

目的： 探討木犀草素對人肝癌HepG2細胞株侵襲、遷移和黏附能力的影響及其作用機制。方法: 采用不同濃度木犀草素處理體外培養的人肝癌HepG2細胞株，Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力，劃痕實驗檢測細胞的遷移能力，黏附實驗評價細胞的黏附能力，Western blot檢測E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和Snai1蛋白的表達。結果: 木犀草素可明顯降低肝癌HepG2細胞的體外侵襲、遷移及黏附能力(P<0.01)，且在一定濃度范圍內呈明顯量效關系。木犀草素處理肝癌細胞后，上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達明顯上調，間質細胞標志蛋白N-cadherin和vimentin以及轉錄因子Snai1表達均明顯下調，木犀草素對以上蛋白的調節呈明顯濃度依賴性。結論: 木犀草素體外具有抑制肝癌HepG2細胞株侵襲、遷移和黏附的作用，其作用機制可能與調控上皮-間質轉化有關。

木犀草素； 肝細胞肝癌； 細胞侵襲； 細胞遷移； 細胞黏附； 上皮-間質轉化 [

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)簡稱肝癌，居全球惡性腫瘤發病率第5位，死亡率第3位[1]。我國是肝癌大國，全世界一半以上的肝癌發生在我國，且發病率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅著人類生命健康[2]。腫瘤細胞轉移是導致HCC患者不能長期生存和臨床治療失敗的主要原因[3]，因此研發低毒、高效的抗肝癌轉移藥物迫在眉睫。木犀草素(luteolin)是一種天然的多酚類黃酮化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[4]。研究報道，木犀草素對乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤細胞的增殖具有抑制作用[5-6]。但關于木犀草素對肝癌細胞侵襲、遷移及黏附的作用研究較少，本文就此開展研究，探討木犀草素對肝癌細胞侵襲、遷移和黏附的及作用機制，以期為新藥開發提供科學依據。

材料和方法

1材料及儀器

CO2培養箱(SANYO)；IX71型倒置顯微鏡(OLYMPUS)；G:BOX F3凝膠成像系統(Syngene)；HepG2細胞來源于ATCC，由本實驗室保存；木犀草素購自方舟生物試劑有限公司(純度≥98%)；Matrigel基質膠(BD)；纖維連接蛋白(fibronectin, FN)、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)購自Sigma；抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和Snai1抗體購自Abcam；全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE試劑盒、Western blot檢測試劑盒、ECL化學發光底物等購自南京凱基生物科技發展有限公司。

2方法

2.1Transwell實驗檢測HepG2細胞的侵襲能力 Matrigel用PBS稀釋成1 g/L，以每孔50 μL鋪于Transwell小室聚碳酸酯膜，Transwell下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基(每孔600 μL)，上室加入HepG2細胞，細胞濃度為5×108/L，每孔50 μL；實驗設木犀草素低、中、高劑量組及對照(control)組，分組后分別加入不同濃度(10、20、40 μmol/L)木犀草素及DMSO對細胞進行處理，37 ℃孵育24 h后，棄上室液體，棉簽擦去上膜未穿膜細胞，蘇木精染色，倒置顯微鏡計數穿膜細胞數，每張膜隨機選取3個視野，分析細胞侵襲能力變化。

2.2劃痕實驗檢測HepG2細胞的遷移能力 取對數生長期HepG2細胞，調整細胞濃度至5×108/L，鋪于35 mm培養皿培養24 h，設木犀草素低、中、高劑量及DMSO對照(control)組，分組后加入不同濃度(10、20、40 μmol/L)木犀草素及DMSO進行處理，24 h后用10 μL槍頭在培養皿底部中央劃出均勻劃痕，換液后繼續培養24 h，于不同時間(0、3、6、9、12、24 h)在倒置顯微鏡下拍照，記錄劃痕寬度變化，分析細胞遷移能力變化。

2.3黏附實驗檢測HepG2細胞的黏附能力 蓋玻片用10 mg/L FN包被，4 ℃過夜，風干后置于35 mm培養皿中；取對數生長期HepG2細胞，調整細胞濃度至3×108/L，加入35 mm培養皿中(每皿1.5 mL)，設木犀草素低、中、高劑量及對照(control)組，加入不同濃度(10、20、40 μmol/L)木犀草素及DMSO處理，37 ℃孵育24 h后，加入表皮細胞生長因子(10 μg/L，每皿200 μL)或無血清培養基后，分別在5、15、30 min時，使用冰PBS清洗終止反應，4%多聚甲醛固定細胞，倒置顯微鏡計數每個培養皿的細胞黏附數，隨機選取5個視野，分析細胞黏附能力變化。

2.4Western blot 檢測E-cadherin、N-cadherin、vi-mentin和Snai1蛋白的表達 采用TGF-β1(20 μg/L)誘導HepG2細胞發生上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，胰酶消化收集經不同濃度的(10、20、40 μmol/L)木犀草素和TGF-β1處理48 h的細胞，SDS細胞裂解液提取總蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE分離，轉膜，封閉1 h，分別加入鼠抗人E-cadherin、N-cadherin、vimentin、Snai1及β-actin抗體，室溫孵育2 h，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG抗體，室溫孵育1 h，ECL化學發光試劑盒進行曝光，凝膠成像系統分析并對凝膠條帶信號強度進行半定量分析。

3統計學處理

SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量數據均以均數±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)進行多組間比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1木犀草素對HepG2細胞體外侵襲能力的影響

本研究在Transwell小室的上室加入Matrigel，旨在模擬腫瘤細胞在體內周圍環境中的細胞外基質，考察木犀草素對肝癌細胞侵襲能力的影響[7]。結果顯示，不同濃度(10、20、40 μmol/L)木犀草素處理HepG2細胞后，HepG2細胞的侵襲能力明顯下降(P<0.01)，呈明顯量效關系，見圖1。

2木犀草素對HepG2細胞體外遷移能力的影響

劃痕24后與對照組比較，不同濃度木犀草素處理的HepG2細胞劃痕距離明顯大于對照組(P<0.01)，提示木犀草素可明顯抑制HepG2細胞的遷移能力，且呈明顯的量效關系，見圖2。

3木犀草素對HepG2細胞體外黏附能力的影響

不同濃度木犀草素處理HepG2細胞后，HepG2細胞的體外黏附能力明顯下降(P<0.01)。木犀草素顯示出良好的抗肝癌細胞黏附的作用，且呈明顯的量效關系，見圖3。

Figure 1. Luteolin inhibited the invasion ability of HepG2 cells. A: microscopic pictures of HepG2 cells treated with luteolin for 24 h (×200); B: Transwell assay results in the HepG2 cells treated with luteolin for 24 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖1木犀草素對人肝癌HepG2細胞體外侵襲能力的影響

Figure 2. Luteolin inhibited the migration ability of HepG2 cells. A: microscopic pictures of the HepG2 cells treated with luteolin for 0 h and 24 h (×100); B: wound healing assay results in the HepG2 cells treated with luteolin at various concentrations for 0 h and 24 h. The migration distance was measured using a software-based method. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2木犀草素對人肝癌HepG2細胞體外遷移能力的影響

Figure 3. Luteolin inhibited the adhesion ability of HepG2 cells. Adhesion assay result in HepG2 cells at 5, 15 and 30 min after treatment was showed. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3木犀草素對人肝癌HepG2細胞體外黏附能力的影響

4木犀草素對HepG2細胞E-cadherin、N-cadhe-rin、vimentin和Snai1蛋白表達的影響

不同濃度木犀草素處理人肝癌HepG2細胞后，上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達明顯上調(P<0.05)，間充質標志蛋白N-cadherin和vimentin表達明顯下調(P<0.05)，轉錄因子Snai1水平亦明顯下調(P<0.05)，且木犀草素對以上蛋白的調節均呈濃度依賴性，見圖4。

Figure 4. Luteolin influenced the protein expression of E-cadhe-rin, N-cadherin, vimentin and Snai1. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsTGF-β1 group.

圖4木犀草素對E-cadherin、N-cadherin、vimentin和Snai1蛋白表達的影響

討 論

HCC是嚴重威脅人類健康的重大疾病，近年來我國HCC的發病率和死亡率呈不斷攀升的趨勢。侵襲與轉移是治療臨床肝癌治療失敗和病人死亡的主要原因，也是腫瘤治療中最為棘手的問題[8]。目前尚缺乏有效的診治手段，主要還是依靠手術、化療、放療、分子靶向以及免疫治療等方法。分子靶向和免疫治療是近年來肝癌治療上的重大突破，但因價格昂貴、療效不穩、存在耐藥現象等而限制了其臨床應用[9]。因此，迫切需要尋求行之有效的治療手段。

近年研究發現，上皮-間充質轉化(epithelial-me-senchymal transition，EMT)在惡性腫瘤的侵襲和轉移過程中發揮重要作用，是腫瘤侵襲轉移的重要啟動步驟[10]，提示逆轉EMT可能是抑制腫瘤侵襲和轉移的重要方法。EMT是指上皮來源的癌細胞在多重信號誘導后，調控相關基因表達，使上皮樣連接蛋白逐漸丟失，癌細胞獲得間充質表型的過程，癌細胞由該過程增強遷移和侵襲能力，最終能夠侵入細胞周圍基質發生轉移[11]。其中上皮細胞標志物包括E-cadherin、角蛋白(cytokeratins)等，間充質標志物包括N-cadherin、vimentin、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)等[12]。此外，某些EMT相關轉錄因子如Snai1、Slug和Twist等可通過抑制E-cadherin表達同時促進N-cadherin表達，參與EMT發生。其中Snai1是首個發現能誘導EMT的轉錄因子，通過表觀遺傳學和轉錄水平調節EMT相關標志物基因的表達，進而影響細胞的侵襲和遷移。Snai1高表達于肝癌、乳腺癌和胃癌等癌細胞，與腫瘤組織學分級和轉移密切相關。TGF-β被認為是幾乎所有上皮細胞發生EMT必不可少的誘導因子[13]。TGF-β能夠通過Smads依賴性信號通路或非Smads依賴性信號通路調控EMT[14]。目前國內外尚缺乏臨床確切有效的EMT逆轉藥物。

課題組前期采用CCK-8法，考察了木犀草素對人肝癌的毒性作用，木犀草素對HepG2細胞48 h的半數抑制濃度(halfmaximal inhibitory concentration，IC50)為82.7 μmol/L。本研究所采用木犀草素的10、20、40 μmol/L 3個濃度對HepG2細胞的抑制率均小于10%，可視為無明顯細胞毒性，從而排除了細胞增殖對癌細胞侵襲、遷移及黏附的影響。本研究首先采用木犀草素處理人肝癌HepG2細胞，考察木犀草素體外對肝癌細胞侵襲、遷移及黏附能力的影響。結果顯示，木犀草素可明顯降低HepG2細胞的體外侵襲、遷移及黏附能力，且在一定濃度范圍內呈明顯的量效關系。EMT為腫瘤發生侵襲轉移的重要啟動步驟，TGF-β信號通路為調控肝癌EMT發生的關鍵信號通路。本研究采用TGF-β1誘導HepG2細胞發生EMT，經不同濃度木犀草素處理后，上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達明顯上調，間充質標志蛋白N-cadherin和vimentin表達明顯下調，EMT調控的關鍵因子Snai1亦明顯下調，與本研究體外肝癌細胞遷移、侵襲及黏附實驗結果一致。提示木犀草素可能通過調控肝癌細胞的EMT，發揮抑制肝癌侵襲轉移的作用。本研究為木犀草素防治HCC侵襲和轉移提供了數據支持，為新藥開發和臨床應用提供了科學依據。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effects of luteolin on invasion, migration and adhesion of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells

LI Chun-yu1, WANG Qi2, SHEN Shen1, LI Guo-xia1

(1International Medical School, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China.2Oncology Department, Shanghai Pulmonary Hospital Affiliated to Tongji University, Shanghai 200433, China. E-mail: lichunyu@tmu.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of luteolin on invasion, migration and adhesion of human hepatocelluar carcinoma HepG2 cells.METHODS: HepG2 cells were cultured and treated with luteolin at 10, 20 and 40 μmol/L respectively. The invasion capability was examined by cell invasion assay. The migration ability was examined by wound healing assay. The adhesion capability was measured by adhesion assay. The protein levels of E-cadherin, N-cadherin, vimentin and Snai1 were determined by Western blot analysis.RESULTS: Luteolin inhibited the invasion, migration and adhesion ability of HepG2 cellsinvitroin a dose-dependent manner. After treatment with luteolin, the expression of E-cadherin was increased significantly and the expression of N-cadherin, vimentin and Snai1 were decreased significantly.CONCLUSION: Luteolin inhibits the invasion, migration and adhesion ability of human hepatocelluar carcinoma HepG2 cells. The mechanism may be related to the regulatory effects of luteolin on epithelial-mesenchymal transition.

Luteolin; Hepatocellular carcinoma; Cell invasion; Cell migration; Cell adhesion; Epithelial-mesenchymal transition

1000- 4718(2017)09- 1606- 05

2017- 06- 05 [

] 2017- 08- 24

中國博士后科學基金面上項目(No. 2016M591398)；天津醫科大學科學基金青年項目(No. 2015KYZQ13)；天津醫科大學基本科研業務費資助項目(No. 2016YD07)

] R730.23； R735.7； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.012

△通訊作者 Tel： 022-83336911; E-mail： lichunyu@tmu.edu.cn