聯合氫氣吸入的液體復蘇方案對膿毒性休克大鼠腎臟的保護作用*

劉 偉， 單立平， 劉倩倩， 劉 志△

(1中國醫科大學附屬第一醫院急診科，遼寧 沈陽 110001； 2中國醫科大學附屬盛京醫院泌尿外科，遼寧 沈陽 110004)

聯合氫氣吸入的液體復蘇方案對膿毒性休克大鼠腎臟的保護作用*

劉 偉1， 單立平2， 劉倩倩1， 劉 志1△

(1中國醫科大學附屬第一醫院急診科，遼寧 沈陽 110001；2中國醫科大學附屬盛京醫院泌尿外科，遼寧 沈陽 110004)

目的： 評價聯合2%氫氣吸入的液體復蘇方案對脂多糖(LPS)誘導的膿毒性休克大鼠腎臟的治療效果。方法：60只Wistar大鼠隨機分成4組(每組15只)：正常對照(control)組，膿毒性休克(shock)組，膿毒性休克+液體復蘇組(fluid組)，膿毒性休克+2%氫氣吸入聯合液體復蘇組(fluid+H2組)。大鼠麻醉后予呼吸機輔助通氣，fluid+H2組給予2%氫氣空氣混合氣，其余3組給予單純空氣吸入。10 mg/kg LPS靜脈注射，建立膿毒性休克模型，control組給予等量生理鹽水靜脈注射。Fluid組和fluid+H2組給予相同液體復蘇方案，維持平均動脈壓于正常水平。4 h后，大鼠經腹主動脈放血處死，留取血液及腎臟標本。結果：聯合2%氫氣吸入的液體復蘇方案與單純液體復蘇比較，血肌酐、尿素氮、中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白及腎臟組織TNF-α、IL-6水平明顯降低，氧化應激損傷程度明顯減輕。結論：聯合2%氫氣吸入的液體復蘇方案更能減輕膿毒癥所致急性腎損傷。

膿毒性休克； 急性腎損傷； 液體復蘇； 氫氣

近年來盡管對膿毒性休克的認識和治療進展方面取得了很大成就，但膿毒性休克依然具有很高的發病率和病死率[1]。液體復蘇是改善膿毒性休克有效循環血容量不足和降低多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)發生率的重要手段。大量臨床試驗已經證實早期液體復蘇能明顯改善膿毒性休克患者的預后[2-3]。然而液體復蘇本身是一把雙刃劍，在改善有效容量的基礎上，也存在液體過負荷所導致的間質水腫及其隨后可能發生的器官功能損傷的風險[4]。因此，如何有效實施液體復蘇成為影響膿毒性休克患者預后的重要因素。

膿毒癥危重癥患者急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的發病率近65%[5]，膿毒性休克患者若并發AKI將使死亡率明顯增加[6]。因此保護膿毒性休克患者腎臟功能顯得尤為重要。然而目前液體復蘇仍然是臨床上預防和治療膿毒性休克過程中出現AKI的必要手段，此過程中必將存在由于液體過負荷導致腎臟功能惡化的風險，因此尋求更優化的液體復蘇方案顯得尤為迫切。

氫分子作為一種選擇性的抗氧化劑，在多種疾病的動物模型中均表現出很好的治療效果[7]。氫分子的作用機制主要包括選擇性抗氧化、抑制凋亡和過度的炎癥反應。我們以前研究發現聯合2%氫氣(hydrogen,H2)吸入的液體復蘇方案可明顯減輕膿毒性休克所致的急性肺損傷[8]，因此本實驗將再次利用膿毒性休克大鼠模型，探究聯合2%氫氣吸入的早期液體復蘇方案對膿毒性休克所致AKI的治療效果及相關機制。

材料和方法

1材料

1.1動物 60只健康雄性Wistar大鼠(180～200 g)均由中國醫科大學實驗動物部提供，并在清潔級動物房飼養繁殖。

1.2主要儀器 HX300動物呼吸機、HP便攜式心電監護儀和OMNI血氣分析儀(AVL)；光學顯微鏡及電鏡(Olympus)。

1.3主要試劑 脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)購自Sigma；丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superroxide dismutase，SOD)及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-10(interleukin-10)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)ELISA 試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；2%氫氣、21%空氣和77%氮氣混合氣體由中國醫科大學醫用氣體站提供。

2方法

2.1動物分組及模型制作 實驗動物隨機分成4組，每組15只，正常對照組(control組)、膿毒性休克對照組(shock組)、液體復蘇組(fluid組) 和液體復蘇+2%氫氣吸入組(fluid+H2組)。10%水合氯醛(300 mg/kg)經腹腔注射對大鼠進行麻醉，氣管切開接呼吸機輔助通氣，呼吸頻率100次/分，潮氣量10 mL/kg，fluid+H2組大鼠吸入氣體為2%氫氣空氣混合氣，其余3組吸入氣體均為空氣。左頸動脈穿刺，連接監護儀監測心率及平均動脈壓( mean arterial pressure，MAP)；股靜脈穿刺留置導管，以備給藥及補液，電熱器維持體溫。大鼠狀態穩定 30 min 后， 除control組外，其余3組均靜脈注射LPS 10 mg/kg(配制濃度10 g/L，推注時間不少于2 min，推注完畢再推入0.2 mL生理鹽水將注射器內殘存的LPS完全注入)，建立膿毒性休克大鼠模型。control組靜脈注入等量生理鹽水。液體復蘇方案: 每15 min給予生理鹽水10 mL/kg，30 min后根據MAP水平，應用去甲腎上腺素(0.5～6 μg·kg-1·min-1) 維持MAP于正常水平[9]。記錄各組大鼠的生命體征、補液量及去甲腎上腺素的用量。所有大鼠于模型建立成功4 h后經頸動脈放血處死，留取動脈血1 mL行血氣分析，剩余血液3 000×g離心10 min，留取血清行肌酐(creatinine，Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)及NGAL檢測。切除左腎，經PBS充分清洗后，以腎門為中心，向外放射狀均勻切成4塊，1塊以4%多聚甲醛固定，留作光鏡檢測，1塊以2.5%戊二醛固定留作電鏡檢測，剩余-80 ℃保存待檢測氧化還原指標及炎性介質水平。

2.2腎功能檢測 血清Cr及BUN水平用于評估大鼠腎臟功能，應用COBAS Mira化學檢測儀(Roche)檢測，具體步驟參照所購試劑盒說明書。

2.3NGAL的檢測 應用ELISA試劑盒檢測血清NGAL濃度，參照說明書進行操作。

2.4腎臟組織病理學觀察 腎臟組織以4%多聚甲醛浸泡24 h以上，常規脫水、包埋，切成4 μm切片，用蘇木素伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腎臟組織病理改變。另一個腎標本用2.5%戊二醛固定，脫水，嵌入環氧樹脂，并制成超薄切片，用透射電鏡觀察細胞器的變化。

2.5腎臟組織中MDA、MPO、SOD 活力的測定 取腎臟組織勻漿，12 000×g離心20 min， 取上清液采用分光光度法測定MDA、MPO、SOD活性，檢測步驟嚴格按照說明書進行操作。

2.6腎臟組織中炎性介質檢測 將凍存的腎臟組織在冰上解凍、勻漿，4℃離心(3 000×g、15 min)，ELISA法檢測勻漿上清中TNF-α、IL-6和IL-10水平(檢測步驟嚴格按說明書進行操作)。

3統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1MAP、血氧分壓(PO2)、補液量及去甲腎上腺素的用量

本實驗中MAP在靜脈注射LPS后20 min降至正常的80%，fluid組和fluid+H2組在整個實驗過程中MAP值無明顯差異。fluid+H2組液體量和去甲腎上腺素用量明顯少于fluid組。PO2在shock組明顯降低，兩種液體復蘇方案均使PO2升高，但fluid+H2組升高的更為明顯(P<0.05)，見表1。

表1 各組MAP、PO2、補液量及去甲腎上腺素用量的比較

*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsshock;#P<0.05vsfluid.

2血清Cr、BUN及NGAL水平

Shock組與control組比較，血清Cr、BUN及NGAL水平明顯升高，兩種液體復蘇方案明顯降低了血清Cr、BUN及NGAL水平，但fluid+H2組降低的更為明顯(P<0.05)。雖然液體復蘇降低了Cr和BUN水平，但BUN/Cr比值(control、shock、fluid及fluid+H2組BUN/Cr比值分別為0.18±0.05、0.19±0.06、0.17±0.04及0.17±0.05)在4組中的差異無統計學顯著性，見圖1。

Figure 1. The levels of serum Cr (A)， BUN (B) and NGAL (C) in different groups. Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsshock;#P<0.05vsfluid.

圖1各組血清Cr水平、BUN水平和NGAL表達水平的比較

3腎臟組織病理學觀察

Control組光鏡下見正常腎小球及腎小管形態；shock組腎小管上皮細胞明顯水腫、刷狀緣破壞，間質水腫伴出血及炎性細胞侵潤；fluid組和fluid+H2組光鏡下腎小管上皮細胞損傷明顯減輕，尤其是fluid+H2組損傷最輕。電鏡下可見腎小球濾過膜由腎小球基底膜、偽足和內皮細胞組成：control組腎小球基底膜連續、厚度均勻，偽足排列整齊，內皮細胞清晰；shock組腎小球基底膜蜷曲、厚度不均，大部分偽足和內皮細胞融合，提示腎小球濾過膜損傷嚴重；fluid組和fluid+H2組腎小球濾過膜損傷明顯改善，尤其fluid+H2組改善更明顯,見圖2。

4腎臟組織MDA、MPO和SOD水平的變化

Shock組與control組比較，MDA和MPO水平明顯升高且伴隨有SOD明顯下降，液體復蘇后MDA和MPO表達明顯下降并伴隨SOD升高，但此變化趨勢在fluid+H2組更為明顯，見圖3。

5腎臟組織炎癥介質的表達

ELISA檢測結果顯示shock組腎臟組織的TNF-α和IL-6表達與control組比較明顯升高，液體復蘇后TNF-α和IL-6表達明顯下降，fluid+H2組與fluid組比較下降得更為明顯(P<0.05)；IL-10的表達在shock組、fluid組和fluid+H2組均明顯升高，但3組間比較差異無統計學顯著性；IL-6/ IL-10比值在fluid組和fluid+H2組明顯下降，尤其在fluid+H2組下降更為明顯(P<0.05)，見圖4。

討 論

本實驗結果提示聯合2%氫氣吸入的液體復蘇方案與單純液體復蘇比較，顯著降低維持正常MAP所需的液體及去甲腎上腺素用量。正如我們所知，過量的液體有導致器官水腫致靶器官功能惡化的風險，因此，聯合氫氣吸入的液體復蘇方案更大的優化了膿毒性休克液體復蘇的治療效果，而減輕了其可能導致的弊端(液體過量)。

Figure 2. The images of kidney tissues with HE staining (A, ×200) and transmission electron microscopic analysis of glomerular filtration membrane (B, ×5 000) in different groups.

圖2腎臟組織的HE染色和電鏡下的超微結構觀察

Figure 3. The changes of MPO (A), MDA (B) and SOD (C) in the renal tissues of different groups. Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsshock；#P<0.05vsfluid.

圖3各組腎臟組織MPO、MDA和SOD水平的變化

本實驗結果提示膿毒性休克誘導了明顯的腎臟功能損傷，雖然2種液體復蘇方案均明顯降低了血Cr和BUN水平，但是BUN/Cr比值在4組中無明顯變化。眾所周知，BUN/Cr比值通常被用來區分腎前性或腎性氮質血癥，在膿毒性休克時腎臟血流量明顯下降，導致腎前性腎臟損傷。與此同時，LPS和缺血又可以誘導腎臟局部過量促炎介質的釋放，導致腎實質性損傷。正如我們的實驗結果所示，膿毒性休克組不但出現了血流動力學改變，腎臟病理及超微結構亦出現了明顯的改變，這就解釋了為何BUN/Cr比值在4組中無明顯變化，即膿毒性休克致AKI既有腎前性因素又有腎性因素參與。

NGAL屬于脂蛋白超級家族一員，生理情況下在上皮細胞中微量表達，而在腎小管損傷中，其可以出現明顯表達升高，是AKI早期的生物標記物[10]。本實驗中膿毒性休克組，NGAL明顯升高，提示出現了明顯的腎小管上皮細胞損傷，兩種液體復蘇方案均降低了NGAL的表達水平，但聯合氫氣吸入的液體復蘇方案組NGAL降低的更明顯，提示對腎小管更具保護作用。電鏡結果提示膿毒性休克組腎小球濾過膜超微結構出現了明顯的損傷，雖然兩組液體復蘇方案均改善了腎小球濾過膜的損傷，但聯合氫氣吸入組改善程度更為顯著。因此聯合氫氣吸入的液體復蘇方案與單純液體復蘇比較，更進一步減輕了腎小管上皮細胞及腎小球濾過膜的損傷程度，更能減輕AKI。

在膿毒癥時，LPS激活中性粒細胞、巨噬/單核細胞及內皮細胞等，釋放大量炎性介質及活性氧族，從多方面對膿毒性休克患者的預后產生負面影響[3]。同時腎小球入球小動脈收縮使腎血流減慢進一步繼發中性粒細胞黏附和聚集。當低血壓持續存在時，腎小球入球小動脈進一步收縮，導致腎臟缺氧和腎血管內皮細胞黏附分子高表達，這些更加促進中性粒細胞在血管內皮細胞的黏附。活化的中性粒細胞釋放大量促炎介質和氧自由基，進一步加重腎臟缺氧和損傷[11]。因此改善氧合和降低氧化應激損傷對保護膿毒性休克所致AKI至關重要。本實驗結果顯示，聯合氫氣吸入的液體復蘇方案與單純液體復蘇比較，不僅明顯提高了血氧分壓的水平，還使MPO、MDA表達明顯下降，SOD表達明顯升高，提示聯合氫氣吸入的液體復蘇方案不僅顯著改善的機體氧合，還明顯降低了氧化應激損傷，對AKI具有顯著的改善作用。

Figure 4. The levels of TNF-α (A), IL-6 (B), IL-10 (C) and ratio of IL-6/IL-10 (D) in the renal tissues of different groups. Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsshock;#P<0.05vsfluid.

圖4腎臟組織TNF-α、IL-6、IL-10和IL-6/IL-10比值的變化

雖然膿毒性休克所致AKI具體機制仍不十分清楚，但過度炎癥反應在此過程中扮演重要角色[12]。研究表明AKI時，TNF-α在腎小管上皮細胞過度表達伴隨大量炎性細胞侵潤并加重腎損傷，而應用TNF-α受體拮抗劑可以明顯改善腎損傷程度[13]。IL-6在AKI時亦明顯高表達，并且會同時加重腎臟和肺臟的損傷[14]。抑制TNF-α和IL-6的過度表達可顯著減輕AKI。IL-10是重要的抗炎介質，能抑制促炎介質如TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-8的表達，并且代表了機體代償性抗炎反應(compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS)的能力。嚙齒類動物模型顯示，應用外源性IL-10對AKI具有明顯治療效果[15]。本實驗中，膿毒性休克組TNF-α和IL-6表達明顯升高，提示過度炎癥反應參與AKI的發病過程，兩種液體復蘇方案均明顯降低了TNF-α和IL-6的表達，但在聯合氫氣的液體復蘇組降低的更為明顯。CARS在膿毒癥中通常被描述為遲發的炎癥反應，但在本實驗中IL-10的表達與TNF-α和IL-6幾乎同步，即在實驗終點時間均明顯升高，且在膿毒性休克組和兩種液體復蘇組表達無明顯差異。但是IL-6/IL-10比值在液體復蘇后明顯降低，尤其在聯合氫氣的液體復蘇組。有研究報道IL-6/IL-10比值升高與膿毒癥預后不良具有明顯相關性[16]。因此本實驗結果提示聯合氫氣的液體復蘇方案與單純液體復蘇比較，不但進一步降低了促炎介質的表達，還更好的維持了促炎/抗炎的平衡，更能減輕AKI。

膿毒性休克過程中，微循環或毛細血管功能障礙直接影響液體復蘇的效果。毛細血管透過度增加可引起滲漏致組織間隙的液體增加，導致器官水腫和有效循環血容量的不足，最終進一步加重器官缺血、缺氧和持續的低血壓。早期液體復蘇是治療膿毒性休克的重要手段，但是如果治療不當，復蘇所用液體會導致器官水腫加重和器官功能衰竭。氫分子因為具有抗氧化、抑制凋亡和過度炎癥反應的作用，在液體復蘇過程中可能通過改善毛細血管的功能，減少了滲漏致組織間隙的液體量，因而更加優化了液體復蘇積極的治療效果，而減少了液體過量所致的弊端，對膿毒性休克所致AKI具有更好的治療效果。

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(責任編輯： 盧 萍， 余小慧)

Liquid resuscitation combined with hydrogen inhalation reduce acute kidney injury during septic shock in rats

LIU Wei1, SHAN Li-ping2, LIU Qian-qian1, LIU Zhi1

(1Department of Emergency, First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China;2Department of Urologic Surgery, Shengjing Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, China. E-mail: lzsy2014@163.com)

AIM: To investigate the therapeutic effects of a novel fluid resuscitation protocol (early fluid resuscitation plus 2% hydrogen inhalation) on acute kidney injury during septic shock induced by lipopolysaccharide (LPS) in rats.METHODS: Male Wistar rats were randomly divided into 4 groups (15 rats per group): control group, septic shock group, septic shock with early fluid resuscitation group (fluid group) and septic shock with early fluid resuscitation plus 2% hydrogen inhalation group (fluid+H2group). The rats were ventilated, and a 2% hydrogen mixture was used in fluid+H2group. LPS (10 mg/kg) was administered to establish the septic shock model in rats and fluid resuscitation was performed in fluid group and fluid+H2group.RESULTS: Fluid resuscitation with 2% hydrogen inhalation decreased the le-vels of serum creatinine, blood urea nitrogen and neutrophil gelatinase-associated lipocalin. It also reduced oxidative stress injury and decreased renal tumor necrosis factor-α and interleukin-6 levels compared with fluid resuscitation alone.CONCLUSION: Early fluid resuscitation plus 2% hydrogen inhalation provided more protection against acute kidney injury du-ring septic shock.

Septic shock; Acute kidney injury; Fluid resuscitation; Hydrogen

1000- 4718(2017)09- 1703- 06

2016- 07- 27 [

] 2017- 03- 11

國家自然科學基金資助項目(No. 81571882)

R515.3;R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.027

△通訊作者 Tel: 024-83283055; E-mail: lzsy2014@163.com