miRNA-93在急性淋巴細胞白血病中的表達

張關亭， 王保蜂

(河南省中醫藥研究院附屬醫院檢驗科， 河南 鄭州 450004)

miRNA-93在急性淋巴細胞白血病中的表達

張關亭△， 王保蜂

(河南省中醫藥研究院附屬醫院檢驗科， 河南 鄭州 450004)

目的： 探討微小RNA(miRNA)-93在急性淋巴細胞白血病中的表達情況及其對急性 T 細胞白血病細胞株Jurkat增殖的影響和潛在作用機制。方法: Real-time PCR技術檢測急性白血病患者骨髓樣本中miRNA-93的表達水平。轉染miRNA-93 inhibitor下調Jurkat細胞中miRNA-93的表達，分別采用CCK-8法、EdU法和流式細胞術檢測細胞活力、增殖及周期，Western blot檢測周期相關調控因子cyclin D1、細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)、p-Rb及P27的蛋白表達水平。結果: miRNA-93在急性白血病患者中呈現高表達，且在高危患者中表達水平最高；沉默miRNA-93后，Jurkat細胞的活力下降并出現明顯的G1/S期阻滯，同時細胞中cyclin D1、CDK4、p-Rb的蛋白水平顯著降低，而P27的蛋白水平顯著升高。結論: miRNA-93在急性淋巴細胞白血病中表達顯著升高；沉默miRNA-93可通過調控周期相關因子的表達抑制急性 T 細胞白血病細胞株Jurkat的增殖。

微小RNA-93; 急性淋巴細胞白血病; 細胞增殖

急性白血病(acute leukemia，AL)是血液系統的常見惡性腫瘤，是由于造血干細胞惡性克隆，骨髓中原始、幼稚細胞異常增殖從而抑制正常造血，嚴重威脅了人類的生命健康。按FAB分型系統分類，AL可分為急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)和急性非淋巴細胞白血病(acute nonlymphocytic leukemia，ANLL)2大類。其中，ANLL常發生于成年人，而兒童以ALL多見。有研究[1-2]發現，一些微小RNA(microRNA，miRNA，miR)在急性白血病和正常人之間存在表達譜的差異。此外， Mi等[3]報道，有27個miRNA在ANLL與ALL間表達有明顯差異，比如Let-7b和miR-223在ANLL中明顯上調，而miR-128a和miR-128b則在ALL中則明顯高表達，利用這些差異區分ANLL與ALL的準確率在95%以上。這為我們診斷AL提供了新的思路和方法。

miRNA-93是miRNA-106b～25基因簇的一種，其編碼基因位于常染色體7q22.1。研究顯示，miRNA-106b～25基因簇作為miRNA-17～92家族的同源物，在體內有致癌作用，如在頭頸鱗癌、結直腸癌、胃癌及肝癌等腫瘤組織中均可檢測到該家族成員的高表達[4-7]。然而該家族中每一個miRNA在不同腫瘤中的確切作用不盡相同，Li等[8]研究提示，miRNA-93可通過調控PI3K/Akt信號通路抑制PTEN基因，進而調節乳腺癌細胞的生長。但關于miRNA-93與白血病的相關研究還很少。

基于以上研究背景及本實驗室前期的研究工作，本課題選擇可能與ALL的疾病發生、發展相關的miRNA-93為研究對象，檢測ALL患者骨髓中的miRNA-93表達水平，同時分析了miRNA-93對急性 T 細胞白血病細胞系Jurkat細胞增殖的影響。

材料和方法

1材料與試劑

急性 T 細胞白血病細胞系Jurkat由鄭州大學干細胞中心提供；人淋巴細胞分離液購自GE Healthcare；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、RPMI-1640培養基及Opti-MEM培養基均購于Gibco；LipofectamineTM2000及相關轉染試劑購于Invitrogen； 抗cyclin D1、細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-depen-dent kinase，CDK)4、p-Rb、Rb、P27及GAPDH抗體購于CST；CCK-8細胞活力分析試劑盒購于廣州賴德生物技術有限公司；EdU細胞增殖試劑盒購于廣州市銳博生物科技有限公司；細胞周期檢測試劑盒購于南京凱基公司；miRNA-93 inhibitor序列及SYBR Green I real-time PCR 試劑盒由上海吉瑪制藥技術有限公司提供。

2方法

2.1臨床標本制備 收集經醫院收診的44例急性淋巴細胞性白血病患兒和5例行骨骼矯正手術并排除腫瘤和血液系統疾病患兒的骨髓樣本。采用中國兒童血液病研究組2008方案對選取的ALL患兒進行治療及臨床危險度分型：其中ALL標危患兒17例，中危患兒15例，高危患兒12例。所有實驗均經家屬知情同意，并報醫院倫理委員會批準。骨髓穿刺抽取初診或者臨床化療前患兒新鮮骨髓2～4 mL，置于EDTA抗凝管中。另取離心管加入3 mL淋巴細胞分離液Ficoll(1.077 g/L)，再加入骨髓液(骨髓液：Ficoll=2∶1或者3∶2)，100×g離心20 min。小心吸取界面層的單核細胞，PBS洗2次。收集細胞凍存于-80 ℃冰箱中備用。

2.2細胞培養、轉染和分組 實驗用Jurkat細胞接種在預先配制好并過濾除菌的 RPMI-1640 培養基中，于飽和濕度、37 ℃、且5% CO2濃度的培養箱中培養，放入培養箱的瓶口擰開 1 圈，換液間隔為 2～3 d。細胞轉染按說明書要求進行，組別設置為對照(control)組，陰性對照(miRNA-negative control，NC)組，miRNA-93 inhibitor轉染組。轉染步驟如下：轉染前 1 d取對數生長期的細胞接種于6孔板中，待細胞生長密度達60%時轉入質粒；將miRNA-93 inhibitor和miRNA-negative control分別加入Opti-MEM培養基中室溫條件下孵育5 min；同時另取LipofectamineTM2000加入Opti-MEM培養基中室溫孵育5 min。將兩者混合后室溫反應20 min，然后將混合物加入到相應組別的細胞中，置于培養箱中孵育6 h，更換為正常培養基繼續培養48 h。對照組則為非轉染細胞正常培養相應時間。提取總RNA測定轉染效率并進行后續實驗分析。

2.3CCK-8法測定細胞活力 將細胞以2×108/L密度接種于96孔板，經過相應處理后，按照操作說明，加入10 μL CCK-8試劑，放置于5% CO2培養箱中孵育2 h，于酶標儀上測450 nm處吸光度(A)值。每組設置3個復孔取均值，另設單孔只加入培養基作空白對照。

2.4EDU法測定細胞DNA變化 將細胞以2×108/L密度接種于96孔板，經過相應處理后，按照操作說明，加入50 μmol/L EDU試劑孵育2.5 h，棄培養液，加入100 μL 4%多聚甲醛固定30 min，再加入0.2%甘氨酸孵育30 min，PBS洗去反應液。0.5% Triton X-100打孔5 min，染色反應液孵育30 min。熒光酶標儀檢測激發波長550 nm處紅色熒光強度。每組設置3個復孔取均值，另設單孔只加入培養基作空白對照。

2.5流式細胞術檢測細胞周期 離心收集各組細胞，冰PBS漂洗2次后離心棄上清；用70%冰乙醇4 ℃固定24 h，1 000×g離心洗去乙醇。依據試劑盒說明，先后加入RNase及碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液在相應的條件下孵育，用流式細胞儀收集20 000個細胞，記錄激發波長488 nm處紅色熒光強度，分析DNA周期，計算出細胞各期比例。

2.6Western blot測定蛋白水平 加RIPA裂解液提取細胞蛋白， BCA蛋白定量試劑盒定量后，調整各組上樣蛋白總量至60 μg，加入4倍體積的蛋白上樣緩沖液，95 ℃變性5 min，而后上樣進行SDS-PAGE。電泳結束后將蛋白電轉至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，按說明書要求加入相應比例的 I 抗4 ℃孵育過夜，復溫，TBST洗滌3次，每次5 min；加入對應的 II 抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，暗室中顯影、定影，沖洗膠片后經Image J軟件行蛋白半定量灰度分析。

2.7Real-time PCR實驗 依據Trizol說明書提取各組細胞中的總RNA，測定RNA樣品的純度并定量。取2 μg總RNA經 SuperScript III reverse transcriptase逆轉錄至終體積為20 μL的cDNA，然后依照說明書采用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒通過ABI 7300 PCR系統檢測miRNA-93的表達。PCR反應體系包括：1 μL RT逆轉錄產物，10 μL SYBR Green PCR Master Mix和500 nmol/L正向以及反向引物。反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，循環50次。U6作為內參照，采用2-ΔΔCt法分析基因相對表達量。引物設計見表1。

表1 引物名稱和序列

F: forward； R: reverse.

3統計學處理

所有數據錄入SPSS 13.0軟件進行統計學分析。實驗結果以均數±標準差(mean±SD)表示。兩組計量資料的組間差異采用t檢驗，多組計量資料行單因素方差分析，同時采用Bonferroni校正的t檢驗進行均數組間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1miRNA-93在急性淋巴細胞白血病患兒體內的表達

Real-time PCR的檢測結果顯示，其中17例ALL標危患兒體內miRNA-93相對表達水平為1.67±0.09，15例中危患兒體內miRNA-93相對表達水平為2.02±0.15，12例高危患兒體內miRNA-93相對表達水平為2.73±0.14，顯著高于5例對照患兒體內miRNA-93的表達水平(0.95±0.06)(P<0.05)。組間兩兩比較結果顯示高危組患兒miRNA-93的表達水平最高，中危組次之，標危組最低。

2沉默miRNA-93對細胞活力的影響

通過轉染miRNA-93 inhibitor下調Jurkat細胞中miRNA-93的表達，采用real-time PCR檢測轉染效率。結果顯示轉染了miRNA-93 inhibitor后，Jurkat細胞中的miRNA-93表達水平降低至0.47±0.03(P<0.05)。

采用CCK-8法檢測細胞活力的變化，結果顯示沉默miRNA-93后，Jurkat細胞活力降低至79.42%±5.01%(P<0.05)。采用EDU法檢測細胞增殖的變化，結果顯示沉默miRNA-93后，Jurkat細胞的增殖率降低至72.15%±8.01%(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Detection of transfect efficacy (A) and the effect of miRNA-93 down-regulation on the cell viability (B) and cell proliferation (C) in the Jurkat cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1轉染效率檢測及沉默miRNA-93對細胞活力和增殖的影響

3沉默miRNA-93對細胞周期的影響

進一步采用流式細胞術檢測了Jurkat細胞的周期分布情況，沉默miRNA-93后，G0/G1期的細胞所占百分比增加至78.71%±4.93%(P<0.05)，S期細胞所占百分比減少至10.42%±3.17%(P<0.05)，說明沉默miRNA-93可抑制Jurkat細胞周期由G0/G1期向S期轉化，見圖2。

4沉默miRNA-93對周期相關分子蛋白水平的影響

相較于對照組，沉默miRNA-93后周期相關蛋白cyclin D1、CDK4、p-Rb 的蛋白水平均顯著降低，而P27的表達明顯升高(P<0.05)。提示沉默miRNA-93所致的細胞增殖抑制作用可能與周期相關因子有關，見圖3。

Figure 2. The effect of miRNA-93 down-regulation on the cell cycle distribution in the Jurkat cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖2沉默miRNA-93對Jurkat細胞周期的影響

Figure 3. The effect of miRNA-93 down-regulation on the protein levels of cell cycle-related molecules in the Jurkat cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖3沉默miRNA-93對Jurkat細胞周期相關因子蛋白水平的影響

討 論

miRNA是一種單鏈小分子RNA，約由19～25個核苷酸組成。目前相當多的研究顯示[1-3]，人體中有許多miRNA在腫瘤中起著類似原癌基因或者抑癌基因的作用。且有研究提示，miRNA-93在多種腫瘤中可發揮癌基因樣作用。本研究檢測到急性淋巴細胞白血病患兒體內miRNA-93的平均表達水平顯著升高，與既往的研究具有一致性。通過對患者的臨床資料進行進一步的分析，本研究還發現miRNA-93的表達與患者的臨床危險度分級具有一定的相關性，危險度越高，miRNA-93的表達水平越高。結果表明，miRNA-93可以作為急性白血病患兒危重分級的一個重要指標來指導臨床診斷。

腫瘤的發生發展通常與腫瘤細胞生物學特性的改變密切相關，大量研究顯示，腫瘤細胞的惡性增殖是腫瘤形成及發展的關鍵機制。本實驗進一步通過轉染miRNA-93 inhibitor，下調急性 T 細胞白血病細胞Jurkat中miRNA-93的表達，分析其對Jurkat細胞增殖的影響。CCK-8細胞活力檢測、EDU細胞DNA檢測和流式細胞周期檢測的結果顯示，沉默miRNA-93可降低Jurkat細胞活力，抑制DNA復制，并抑制細胞周期由G0/G1期向S期轉化。結果表明沉默miRNA-93可抑制Jurkat細胞增殖。關于miRNA-93影響白血病細胞增殖的機制目前并沒有系統的研究。本實驗中我們發現下調miRNA-93的表達后，Jurkat細胞中幾種周期相關因子cyclin D1、CDK4、、p-Rb 的蛋白水平顯著降低，而P27的表達則明顯升高。眾所周知，miRNA調控腫瘤細胞增殖的相關機制中，細胞周期的變化是一個關鍵節點[9-11]。調控細胞周期的相關因子包括：細胞周期素(cyclins)、細胞周期蛋白依賴蛋白激酶以及細胞周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑。其中cyclins可與CDKs結合形成復合物，促進Rb的磷酸化，進而促使細胞順利通過周期G1/S調控點進入S期開始DNA復制；而CDK抑制劑(如P21CIP及P27KIP)則可競爭性與CDK結合，使其催化亞基失活，從而抑制細胞從G0/G1期進入S期[12-14]。我們的結果表明，下調miRNA-93所致的Jurkat細胞周期G1/S阻滯，可能是通過調控周期相關因子的表達實現的，但是這一作用是否涉及其它信號通路以及其中具體的作用機制還需進一步深入地研究。

綜上所述，miRNA-93在急性白血病中表達顯著升高，且與患者的臨床危險度相關；此外，沉默miRNA-93可通過調控周期相關因子的表達抑制細胞周期的G1/S轉換，進而抑制急性 T 細胞白血病細胞株Jurkat的增殖。

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(責任編輯： 盧 萍， 余小慧)

Expression of miRNA-93 in acute lymphocytic leukemia

ZHANG Guan-ting, WANG Bao-feng

(Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Hospital of Henan Province Chinese Medicine Institute, Zhengzhou 450004, China. E-mail:2757002991@qq.com)

AIM: To investigate the expression of microRNA (miRNA)-93 in acute lymphocytic leukemia (ALL) and its effect on the proliferation of acute T-cell leukemia Jurkat cells.METHODS: The expression of miRNA-93 in the bone marrow samples of patients with ALL was measured by real-time PCR. After down-regulation of miRNA-93 by transfection with miRNA-93 inhibitor in the Jurkat cells, the cell viability, cell proliferation and cell cycle distribution were detected by CCK-8 assay, EdU assay and flow cytometry, respectively. Furthermore, the protein levels of cell cycle-related molecules such as cyclin D1, cyclin-dependent kinase 4 (CDK4)， phosphorylation retinoblastoma (Rb) and P27 were measured by Western blot.RESULTS: miRNA-93 was highly expressed in the patients with ALL, and the expression level was highest in the high risk patients. Down-regulation of miRNA-93 inhibited Jurkat cell viability, arrested cell cycle in G1/S transition. In addition, the protein levels of cyclin D1, CDK4 and p-Rb were significantly decreased, the protein expression of P27 was increased in Jurkat cells trasfected with miRNA-93 inhibitor.CONCLUSION: miRNA-93 expression is increased in ALL patients. Down-regulation of miRNA-93 restrains cell proliferation in the acute T cell leukemia cell line Jurkat via regulating cell cycle-related molecules.

MicroRNA-93; Acute lymphocytic leukemia; Cell proliferation

(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

1000- 4718(2017)09- 1713- 05

2017- 06- 19 [

] 2017- 07- 21

R733.71； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.029

△通訊作者 Tel： 0371-66347655； E-mail: 2757002991@qq.com