中國廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動子區rs1491034和rs982873遺傳多態性研究

黃華佗， 陸玉蘭， 王 榮， 向 陽， 李北林， 韋葉生

中國廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動子區rs1491034和rs982873遺傳多態性研究

黃華佗， 陸玉蘭， 王 榮， 向 陽， 李北林， 韋葉生

目的研究rs1491034和rs982873單核苷酸多態性(SNPs)在廣西人群中的分布特點，比較二者基因型和等位基因在不同種族、地區人群間的分布差別。方法采用SNaPshot SNP分型技術和DNA測序法檢測397例廣西人群rs1491034和rs982873 SNPs，比較兩位點基因型和等位基因頻率與國際人類基因組單體型圖(HapMap)計劃公布的不同種族和地區人群間的差別。結果廣西人群rs1491034和rs982873均存在TT，CT及CC 3種基因型。2個位點的基因型和等位基因頻率在廣西人群不同性別間比較，差別均無統計學意義(P>0.05)。廣西人群rs1491034基因型和等位基因頻率與HapMap-CEU和HapMap-YRI人群比較，差別均有統計學意義(P<0.01)，而rs982873基因型和等位基因頻率與HapMap-JPT和HapMap-YRI人群比較，差別均有統計學意義(P<0.05)，但兩位點基因型和等位基因頻率與其他人群比較，差別均無統計學意義(P>0.05)。結論廣西人群存在rs1491034和rs982873多態性，與其他種族、地區人群比較存在不同程度的差別。

多基因族； 啟動區(遺傳學)； 多態現象, 遺傳； 大陸人口群

微小RNA(microRNA, miRNA)是基因調控領域的又一重大發現，通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區結合，導致mRNA發生降解或翻譯抑制，從而在翻譯水平調控靶基因的表達[1-2]。miRNA有成簇的聚集在染色體上的特點，通過一個共同的啟動子轉錄生成多順反子。在基因簇的研究方面，目前研究得較為深入的是微小RNA-17-92(microRNA-17-92, miRNA-17-92)基因簇。miRNA-17-92基因簇參與大量靶基因翻譯的調控，參與正常人肺和心臟發育以及血管新生[3]。然而，在某些病理情況下，miRNA-17-92基因簇可促進腫瘤、免疫性疾病和心腦血管疾病等的發生和發展[4-6]。miRNA-17-92基因簇位于13號染色體長臂(13q31.3)miRNA-17-92基因簇的宿主基因(miRNA-17-92 cluster hostgene, MIR17HG)內，可編碼生成6種成熟的miRNA(miRNA-17，miRNA-18a，miRNA-19a，miRNA-20a，miRNA-19b-1及miRNA-92a-1)。研究表明，miRNA基因啟動子區多態性可影響miRNA的轉錄以及miRNA基因相關疾病的遺傳易感性，從而導致miRNA相關疾病的發生和發展[7-9]。

隨著人類基因組計劃的完成，基因多態性的研究更多地趨向于局部的、多民族和多地區的分散研究。廣西正常人群miRNA-17-92基因簇啟動子區遺傳多態性的研究可為后期miRNA-17-92基因簇相關疾病遺傳多態性研究和群體遺傳學研究提供參考資料。筆者采用SNaPshot SNP分型技術和DNA測序法檢測miRNA-17-92基因簇啟動子區rs1491034和rs982873遺傳多態性，并將所得分型數據與國際人類基因組單體型圖計劃公布的HapMap-CEU、HapMap-HCB、HapMap-JPT和HapMap-YRI人群結果比較，分析不同種族、地區人群間兩位點的遺傳差別。

1 對象與方法

1.1 對象 收集右江民族醫學院附屬醫院體檢中心健康體檢者397例，男性237例，女性160例，年齡(61.33±9.91)歲(27～83歲)，通過各項血液和影像學檢查，未發現腫瘤以及肝臟、腎臟、心腦血管和神經系統疾病，排除遺傳病家族史。本研究對象均為相互間無血緣關系的廣西地區人群。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 用EDTA-K2抗凝的血常規管采集研究對象靜脈血3 mL，置于-50 ℃冰箱保存備用。基因組DNA提取采用試劑盒離心柱法(TIANamp Blood DNA Kit)，提取后的DNA標本放在-50 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 引物設計與合成 查詢NCBI SNP數據庫，分別選取包含rs1491034和rs982873位點的適宜長度DNA片段，用網頁引物設計軟件Primer 3.0設計PCR引物，交由上海天昊生物科技有限公司合成。引物序列：

rs1491034：

上游：TGGGGTTTCTTCAGGGGATAATTG

下游：TGTTCTGAGTGGAGGGCCCTTAT

延伸引物：TAATCCTGAAATTCCCCCAATTA

rs982873：

上游：CCTTGTCCGGCAATCATGAAGT

下游：CAACATTCCCAAAGTCCGTGACA

延伸引物：TTTTTTGAAACACAAATTCTCCTTGA ATTTC

1.2.3 PCR擴增及測序 PCR擴增反應體系(20 μL)包含1×GC-I buffer(Takara)，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物，不足的體積用滅菌雙蒸水補充。PCR產物用5U SAP酶和2U Exonuclease I酶純化后用SNaPshot Multiplex Kit(ABI)進行延伸反應，延伸產物加入1U SAP酶純化后上ABI3730XL測序儀測序，測序原始數據用GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems Co Ltd，USA)分析。

1.3 統計學處理 基因型和等位基因的頻率用直接計數法計算。基因型和等位基因數據為計數型資料，不同組間基因型和等位基因頻率比較分別用行×列表卡方檢驗(χ2)和四格表χ2檢驗計算。采用SPSS17.0軟件處理數據。P<0.05為差別具有統計學意義。

2 結 果

2.1 miRNA-17-92基因簇啟動子區rs1491034和rs982873分型 測序結果表明，rs1491034位點包含TT,TC和CC 3種基因型，其頻率分別為25.2%，52.6%和22.2%；T和C等位基因頻率分別為51.5%和48.5%。rs982873位點包含TT，TC和CC 3種基因型，其頻率分別為37.5%，48.1%和14.4%，T和C等位基因頻率分別為61.6%和38.4%。基因測序進一步證實結果(圖1，2)。

A～C：箭頭指向分別表示TT，TC及CC基因型.圖1 miRNA-17-92基因簇啟動子區rs1491034測序圖Fig 1 Sequencing map for rs1491034 in the promoter of miRNA-17-92 cluster

A～C：箭頭指向分別表示TT，TC及CC基因型.圖2 miRNA-17-92基因簇啟動子區rs982873測序圖Fig 2 Sequencing map for rs982873 in the promoter of miRNA-17-92 cluster

2.2 廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動子區rs1491034和rs982873遺傳多態性在不同性別間的比較 經χ2驗證，miRNA-17-92基因簇啟動子區rs1491034和rs982873基因型數據均符合哈迪-溫伯格遺傳平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)(P=0.28；P=0.74)，表明本研究所選的對象具有群體代表性。rs1491034和rs982873基因型和等位基因頻率在不同性別間比較，差別無統計學意義(表1，P>0.05)。

表1中國廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動子區rs1491034和rs982873基因型和等位基因頻率在不同性別間的比較

Tab1Comparison of the genotype and allele frequency of rs1491034 and rs982873 polymorphisms in the promoter of miRNA-17-92 cluster between genders

SNPs性別nn基因型(%)TTTCCCn等位基因(%)TCrs1491034男性23755(23．2)127(53．6)55(23．2)237(50．0)237(50．0)女性16045(28．1)82(51．3)33(22．2)172(53．7)148(46．3)rs982873男性23791(38．4)110(46．4)36(15．2)292(61．6)182(38．4)女性16058(36．3)81(50．6)21(13．1)197(61．6)123(38．4)

SNPs：單核苷酸多態性.

2.3 中國廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動子區rs1491034和rs982873基因型和等位基因頻率與其他種族、地區人群比較 廣西人群rs1491034基因型和等位基因頻率與HapMap-CEU和HapMap-YRI人群比較，差別均有統計學意義(P<0.01)，但與HapMap-HCB和HapMap-JPT人群比較，差別均無統計學意義(P>0.05，表2，3)。廣西人群rs982873基因型和等位基因頻率與HapMap-JPT和HapMap-YRI人群比較，差別均有統計學意義(P<0.05)，但與HapMap-HCB人群比較，差別均無統計學意義(P>0.05，表2，3)。

表2中國廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動子區rs1491034和rs982873基因型頻率與其他種族、地區人群比較

Tab2The comparison between genotype frequency of rs1491034 and rs982873 polymorphisms in the promoter of the miRNA-17-92 cluster in Guangxi Chinese population and different other races, districts population

SNPs人 群nn基因型(%)TTTCCCHWEχ2Prs1491034廣西人群397100(25．2)209(52．6)88(22．2)0．28--HapMap?HCB9022(24．4)46(51．1)22(24．4)0．830．220．90HapMap?JPT8828(31．8)48(54．5)12(13．6)0．233．790．15HapMap?CEU12086(71．7)34(28．3)-0．0793．52<0．01HapMap?YRI12078(65．0)40(33．3)2(1．7)0．2271．80<0．01rs982873廣西人群397149(37．5)191(48．1)57(14．4)0．74--HapMap?HCB9026(28．9)48(53．3)16(17．8)0．452．510．29HapMap?JPT8820(22．7)42(47．7)26(29．5)0．7014．240．01HapMap?YRI1206(5．0)24(20．0)90(75．0)0．02169．22<0．01

SNPs：單核苷酸多態性； HWE： 哈迪-溫伯格定律； HCB： 中國北京漢族人群； JPT： 日本東京人群； CEU： 具有北歐和西歐血統的猶他州人群； YRI：在非洲尼日利亞伊巴丹的約魯巴人.

3 討 論

miRNA存在pri-miRNA、前體miRNA(precursor miRNA, pre-miRNA)和成熟miRNA 3種類型，通過不完全互補配對的方式結合到目的mRNA的3′非翻譯區，導致靶基因的mRNA發生降解或翻譯抑制，調控眾多基因的表達[1,10]。研究表明，一種miRNA可調控多達數百個目的基因mRNA的表達，而一個mRNA的表達也可由多種miRNA共同調節，雖然目前發現的miRNA只有幾百個，但miRNA卻調節著超過1/3的生物基因[2]。miRNA-17-92基因簇是目前研究得最多也是研究得最深入的miRNA基因簇之一，與生物正常生長發育以及腫瘤、免疫性疾病、心腦血管疾病和神經退行性病變等疾病的發生均有著密切聯系，已成為當前研究的熱點[3-4,11-12]。

表3中國廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動子區rs1491034和rs982873等位基因頻率與其他種族、地區人群的比較

Tab3The comparison between allele frequency of rs1491034 and rs982873 polymorphisms in the promoter of the miRNA-17-92 cluster in Guangxi Chinese population and different other races, districts population

SNPs人 群nn等位基因(%)TCχ2Prs1491034廣西人群794409(51．5)385(48．5)--HapMap?HCB18090(50．0)90(50．0)0．130．71HapMap?JPT176104(59．1)72(40．9)3．320．07HapMap?CEU240206(85．8)34(14．2)90．08<0．01HapMap?YRI24067(29．6)318(70．4)69．04<0．01rs982873廣西人群794489(61．6)305(38．4)--HapMap?HCB180100(55．6)80(44．4)2．230．14HapMap?JPT17682(46．6)94(53．4)13．38<0．01HapMap?YRI24036(15．0)204(85．0)160．03<0．01

SNPs：單核苷酸多態性；HWE：哈迪-溫伯格定律；HCB：中國北京漢族人群；JPT：日本東京人群；CEU：具有北歐和西歐血統的猶他州人群；YRI：在非洲尼日利亞伊巴丹的約魯巴人.

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)指在基因組的水平上由于單個核苷酸突變引起的DNA序列多態性，為人類可遺傳變異中最常見的一種。SNPs的研究在解釋不同群體、個體對疾病特別是對復雜疾病的易感性和對各種藥物的耐受性以及對環境因子反應的表型差別方面起著很大的作用。人類基因組計劃掃描發現，miRNA-17-92基因簇啟動子區存在功能性SNPs位點，這些位點的SNPs改變可能會影響miRNA-17-92基因簇的表達，從而影響miRNA-17-92基因簇調控的靶基因相關疾病的發生和發展。

本研究結果表明，廣西人群rs1491034和rs982873基因型和等位基因頻率在不同性別間比較,差別均無統計學意義(P>0.05)，表明廣西人群rs1491034和rs982873 SNPs無性別間差別。進一步將rs1491034和rs982873分型結果與國際人類基因組單體型圖計劃公布的4個人群數據比較發現，rs1491034基因型和等位基因頻率與HapMap-CEU 和HapMap-YRI人群比較，差別均有統計學意義(P<0.01)，然而與HapMap-HCB及HapMap-JPT人群比較，差別均無統計學意義(P>0.05)。而rs982873基因型和等位基因頻率與HapMap-JPT和HapMap-YRI人群比較，差別均有統計學意義(P<0.05)，但與HapMap-HCB人群比較，差別無統計學意義(P>0.05)。HapMap-CEU 和HapMap-YRI人群與廣西人群屬于不同種族，地緣關系遠，且飲食和生活習慣上存在較大差別，因此與廣西人群比較遺傳差別大。而HapMap-HCB和HapMap-JPT人群與廣西人群同屬亞洲人，地理位置和親緣關系近，因此與廣西人群比較遺傳差別相對較小。廣西人群rs1491034T等位基因頻率為51.5%，與同是亞洲人的HapMap-HCB(50.0%)和HapMap-JPT(59.1%)人群T等位基因頻率相近，而與HapMap-CEU(85.8%)和HapMap-YRI(81.7%)人群的T等位基因頻率相差較遠。類似的，廣西人群rs982873T等位基因頻率為61.6%，與同是亞洲人的HapMap-HCB(55.6%)和HapMap-JPT(46.6%)人群T等位基因頻率相近，而與HapMap-YRI(15.0%)人群T等位基因頻率相差較遠。以上結果均與“親緣關系越近，基因型的分布差別越小”的遺傳定律相吻合。基因多態有不同民族、種族和地區間的差別，雖然廣西人群與HapMap-HCB及HapMap-JPT人群同屬于亞洲人，但由于各地方的地理位置、環境和氣候有所不同，飲食和生活習慣上也有較大差別，因此三者的基因型和等位基因比較也表現出一定差別，甚至出現廣西人群rs982873位點基因型和等位基因頻率與HapMap-JPT人群比較出現較大差別的結果。

隨著人類基因組計劃的完成，基因多態性的研究更多地趨向于局部的、多民族和多地區的分散研究。基因多態性研究的展開在解釋不同群體、個體對疾病特別是對復雜疾病的易感性和對各種藥物的耐受性以及對環境因子反應的表型差別方面都起著很大的作用。本研究發現，廣西人群存在miRNA-17-92基因簇啟動子區rs1491034和rs982873遺傳多態性，其基因型和等位基因頻率與不同種族、地區人群比較存在不同程度的差別。廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動子區rs1491034和rs982873遺傳多態性的研究可為群體遺傳學和miRNA-17-92基因簇相關疾病的研究提供參考資料，同時可為廣西地區建立區域基因數據庫貢獻一份力量。

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(編輯:張慧茹)

Exploration of Genetic Polymorphism of rs1491034 and rs982873 in the Promoter of miRNA-17-92 Cluster in China Guangxi Population

HUANG Huatuo, LU Yulan, WANG Rong, XIANG Yang, LI Beilin, WEI Yesheng

Department of Laboratory Medicine, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, Baise533000, China

Objective To explore the distribution characteristics of the rs1491034 and rs982873 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in Guangxi populations, and to compare their genotype and allele frequency with different races and populations of other regions. Methods The SNPs of rs1491034 and rs982873 were detected by SNaPshot SNP and DNA sequencing methods. We statistically analyzed the difference between the genotype and allele frequency of the two SNPs that we studied and compared it with the data of different races and regional populations, while were published in the international HapMap project. Results The rs1491034 and rs982873 SNPs contain TT, TC and CC genotypes, respectively, in the Guangxi population. The genotype and allele distribution of the two SNPs were not significantly different between genders in the Guangxi population (P>0.05). The genotype and allele distribution of the rs1491034 SNP were significantly different from HapMap-CEU and HapMap-YRI populations (P<0.01), and the genotype and allele distribution of the rs982873 SNP were significantly different from HapMap-JPT and HapMap-YRI populations (P<0.05). However, the genotype and allele distribution of the two SNPs were not significantly different compared with other listed population. Conclusion There are rs1491034 and rs982873 SNPs in the Guangxi population, and there are varying degree of differences in the genotype and allele distribution of the two polymorphism between the Guangxi populations and other published populations of races/regions.

multigene family； promoter regions (genetics)； polymorphism, genetic； continental population groups

2017-04-06

國家自然科學基金(81560552；81260234)；廣西高校重點實驗室開放課題(kfkt20160064);廣西研究生教育創新計劃項目(201601009)

右江民族醫學院附屬醫院 檢驗科，百色 533000

黃華佗，男，醫學檢驗技師，醫學碩士

韋葉生.Email: yeshengwei22@163.com

R34； R394.3； R394.5

: A

: 1672-4194(2017)04-0212-05