L-茶氨酸對α-淀粉酶和胰蛋白酶的抑制作用

袁冬寅

龍 軍2

龔志華1

林 玲1

周 陽1

彭影琦1

肖文軍1,3

(1. 湖南農業(yè)大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 常德市柳葉湖旅游度假區(qū)七里橋街道辦事處，湖南 常德 415000；3. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128)

L-茶氨酸對α-淀粉酶和胰蛋白酶的抑制作用

袁冬寅1

龍 軍2

龔志華1

林 玲1

周 陽1

彭影琦1

肖文軍1,3

(1. 湖南農業(yè)大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 常德市柳葉湖旅游度假區(qū)七里橋街道辦事處，湖南 常德 415000；3. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128)

以L-茶氨酸為原料，通過建立最佳酶促反應體系，采用非連續(xù)測定和作圖法研究了L-茶氨酸對α-淀粉酶、胰蛋白酶的抑制作用及其動力學特征，為L-茶氨酸的深層開發(fā)利用提供參考。結果表明，L-茶氨酸對α-淀粉酶和胰蛋白酶的抑制效果均與其質量濃度呈正比，在底物質量濃度1%、體系添加順序為酶與抑制劑在37 ℃預熱5 min后加入底物的條件下，L-茶氨酸抑制α-淀粉酶的最優(yōu)條件為α-淀粉酶質量濃度0.018 mg/mL、反應時間3 min，IC50為26.078 mg/mL，當酶量為18 518.52 U時，α-淀粉酶的Km為2.247 mg/mL；在底物質量濃度1%、體系添加順序為胰蛋白酶與抑制劑在40 ℃預熱5 min后加入底物的條件下，L-茶氨酸抑制胰蛋白酶的最優(yōu)條件為胰蛋白酶質量濃度0.252 mg/mL、反應時間15 min，IC50為196.299 mg/mL，當酶量為1 055 931 U時，胰蛋白酶的Km為5.189 mg/mL。說明L-茶氨酸對α-淀粉酶和胰蛋白酶均有一定的抑制作用，且抑制α-淀粉酶的效果較好。

L-茶氨酸；α-淀粉酶；胰蛋白酶；抑制作用；糖脂代謝

L-茶氨酸(N-乙基-γ-L-谷氨酰胺)是茶葉中特有的一種非蛋白質氨基酸，屬酰胺類化合物[1]，具有降血壓[2]、提高記憶力[3-4]、安神鎮(zhèn)靜[5]、保護腦神經細胞[6]、調節(jié)免疫[7]、輔助抗腫瘤[8]、減肥降脂[9]等多種生物活性，廣泛應用于醫(yī)療、保健、食品等領域[10]。α-淀粉酶、胰蛋白酶是與機體糖脂代謝密切相關的兩種酶[11-12]，其中，α-淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類總稱，是一種淀粉內切酶，其作用方式是在淀粉分子內部隨機切開α-1,4糖苷鍵，并生成糊精和還原糖[13-14]；胰蛋白酶是動物胰臟的主要蛋白質水解酶[15]，能將蛋白質分解成氨基酸，供人體吸收利用[16]。然而，目前尚未見L-茶氨酸抑制α-淀粉酶、胰蛋白酶生物活性研究的相關報道。為探索L-茶氨酸體外調節(jié)糖脂代謝的生物活性，本研究以L-茶氨酸為原料，通過建立最佳酶促反應體系，采用非連續(xù)測定和作圖法研究L-茶氨酸對α-淀粉酶、胰蛋白酶的抑制作用及其動力學特征，以期為L-茶氨酸的深層開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-茶氨酸：純度≥98%，德國Sigma試劑公司；

α-淀粉酶(Lot.RM3018Y359)：4 U/mg，上海瑞永生物科技有限公司；

胰蛋白酶(批號20160216)：50 U/mg，國藥集團化學試劑有限公司；

可溶性淀粉、干酪素、碳酸鈉、四水酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、福林酚：國產分析純。

1.2 儀器與設備

精密電子天平：Mettler AE240型，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；

pH計：PHS22C型，上海雷磁儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH型，上海精宏實驗設備有限公司；

紫外分光光度計：UV-2550型，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標準曲線制作 配制2 mg/mL的葡萄糖標準液，分別吸取0.00，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL置于10 mL容量瓶中，在37 ℃水浴鍋中預熱5 min后，各加入0.5 mL DNS溶液混合，沸水浴5 min，冷卻，加水定容至10 mL，用分光光度計于540 nm測吸光值。以不加葡萄糖溶液為空白對照組。求得葡萄糖的標準曲線為y=12.046x+0.022 7 (R2=0.999) 。

1.3.2α-淀粉酶最適酶促反應條件篩選

(1) 酶質量濃度確定：配制質量濃度分別為0.006，0.010，0.014，0.018，0.022，0.026，0.030 mg/mL的α-淀粉酶溶液,分別置于7支試管中，在37 ℃條件下與底物溶液混勻進行反應，于540 nm處測吸光值，選擇最佳酶質量濃度。

(2) 反應時間及酶量確定：采用最佳酶質量濃度，按表1順序添加試劑，測定反應初始速率。由于建立動力學方程最重要的是確定酶量與反應時間，以確保酶初始速率達到最大，即當?shù)孜餄舛茸銐虼髸r，反應速率趨于極限值，幾乎不再隨底物濃度的增加而改變，符合零級反應特征；酶量過高或過低都不適宜建立酶反應動力學方程。因此，選擇的酶量須保證每分鐘反應體系在540 nm處的吸光值變化為0.03～0.25[17]。酶反應開始時，立即計時，每隔1 min，加入DNS溶液終止反應，于540 nm處測吸光值，篩選最佳反應時間和最佳酶量。

表1 酶量確定

(3) 酶促反應動力學方程的建立：采用最佳反應時間和最佳酶量，保持酶質量濃度不變，分別在0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%，1.6%的底物濃度下，于540 nm處測吸光值，并計算出酶促反應的初始速率，按雙倒數(shù)法作圖(Vmax=1/縱截距，Km=斜率×Vmax)與米氏方程(1/V=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax)，求出Km和Vmax。

(4) 底物、酶、抑制劑添加順序確定：采用最佳反應時間，將可溶性淀粉、α-淀粉酶、L-茶氨酸按如下3種順序添加：① 3種物質先各自在37 ℃水浴鍋中預熱5 min，再同時加入試管中反應；② 先將可溶性淀粉與L-茶氨酸置于試管中，在37 ℃水浴鍋中預熱5 min，再加入α-淀粉酶反應；③ 先將α-淀粉酶與L-茶氨酸置于試管中，在37 ℃水浴鍋中預熱5 min，再加入可溶性淀粉反應。比較3種方式的抑制率，選擇最佳添加順序。

1.3.3 最優(yōu)酶促反應條件下L-茶氨酸對α-淀粉酶的抑制效果 采用最佳添加順序，在9支試管中分別加入α-淀粉酶與質量濃度為2，10，15，20，25，30，35，40，45 mg/mL的L-氨基酸，搖勻，在37 ℃水浴鍋中預熱5 min，加底物反應3 min后，立即加入DNS溶液，沸水浴5 min，冷卻，稀釋。背景對照為底物溶液與抑制劑，空白對照為煮沸的酶液，在540 nm處測吸光值。抑制活性按式(1)計算，其中A值均為540 nm處的吸光值。

1.3.4 酪氨酸標準曲線制作 配制質量濃度為1 mg/mL的酪氨酸，用時再稀釋10倍得0.1 mg/mL的酪氨酸標準溶液。按表2順序添加試劑，混合，放入40 ℃水浴保溫20 min后，冷卻至室溫，于660 nm比色。1號試管為空白對照組。求得酪氨酸的標準曲線為y=0.063 8x+0.020 7 (R2=0.998 1)。

表2 酪氨酸標準曲線試劑加入順序

1.3.5 胰蛋白酶最適酶促反應條件篩選

(1) 酶質量濃度確定：配制質量濃度分別為0.042，0.084，0.126，0.168，0.210，0.252，0.294 mg/mL的胰蛋白酶溶液置于7支試管中，在40 ℃條件下與底物混勻進行反應，于660 nm處測定吸光值，選擇合適的酶質量濃度。

(2) 反應時間確定：在40 ℃的水浴條件下，于6支試管中分別加入最佳質量濃度的胰蛋白酶溶液與底物反應，于660 nm處測不同反應時間(5，10，15，20，25，30 min)下的吸光值，并計算出酪氨酸的生成量，選擇最適酶促反應時間。

(3) 酶促反應動力學方程的建立：經預試驗，確定進行酶促反應動力學常數(shù)測定的酶量為1 055 931 U，反應時間為3 min，保持酶質量濃度不變，在不同的底物濃度(0.4%，0.6%，0.8%，1%，1.2%，1.4%)下，于660 nm處測吸光值，并計算出酶促反應的初始速率，按雙倒數(shù)法作圖(Vmax=1/縱截距，Km=斜率×Vmax)與米氏方程(1/V=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax)，求出Km和Vmax。

(4) 底物、酶、抑制劑添加順序確定：采用最佳反應時間，將干酪素、胰蛋白酶、L-茶氨酸按如下3種順序添加：① 3種物質先各自在40 ℃的水浴中預熱5 min，再同時加入試管中反應；② 先將干酪素與L-茶氨酸置于試管中，在40 ℃的水浴中預熱5 min，再加入胰蛋白酶反應；③ 先將胰蛋白酶與L-茶氨酸置于試管中，在40 ℃的水浴中預熱5 min，再加入干酪素反應。比較3種方式的抑制率，選擇最佳添加順序。

1.3.6 最優(yōu)酶促反應條件下L-茶氨酸對胰蛋白酶的抑制效果 采用最佳添加順序，在5支試管中分別加入胰蛋白酶與質量濃度分別為2，50，100，150，200 mg/mL的L-氨基酸，混勻，在40 ℃水浴中預熱5 min，再加入底物反應15 min后，立即加入TCA溶液終止反應，3 500 r/min離心10 min，取上清液，加碳酸鈉和福林酚，40 ℃水浴保溫20 min，冷卻，于660 nm處測定吸光值。背景對照為底物溶液與抑制劑，空白組為失活的酶液。抑制率按式(1)計算，其中A值均為660 nm處的吸光值。

1.3.7 色度測定

(1) 不同濃度的葡萄糖色度：采用紫外分光光度計測定，用吸光值A540來表示。

(2) 不同濃度的酪氨酸色度：采用紫外分光光度計測定，用吸光值A660來表示。

1.3.8 檢測及統(tǒng)計方法

(1) 抑制率：按式(1)計算抑制率。

(1)

式中：

I——抑制率，%；

A1、A2、A3、A4——分別為無抑制組、空白組、加抑制組和背景對照組的吸光值。

(2)α-淀粉酶活力測定：采用Berndeld法[18]。

(3) 胰蛋白酶活力測定：采用Lowry蛋白質測定法[19]。

(4) 統(tǒng)計方法：數(shù)據(jù)利用Excel 2013處理，IC50利用SPSS軟件中的Profit分析方法計算得出。

2 結果與分析

2.1α-淀粉酶最適酶促反應條件篩選

2.1.1 酶質量濃度確定 由圖1可知，在一定范圍內，隨著酶質量濃度的增加，吸光值增大。α-淀粉酶質量濃度在0.01～0.018 mg/mL時，有較好的線性關系，吸光值與酶質量濃度呈正比。α-淀粉酶質量濃度在0.01～0.022 mg/mL時，反應速率隨酶質量濃度的增加而逐漸減慢，最終將達到平衡。為使酶促反應速率保持最大，α-淀粉酶質量濃度宜選擇0.018 mg/mL。

圖1 α-淀粉酶質量濃度對酶活性的影響

2.1.2 反應時間與酶量確定 由圖2可知，反應時間在3 min內，線性反應速度隨著酶量的增加而增大。比較不同酶量的反應時間，發(fā)現(xiàn)所有的酶反應進程曲線在3 min內，均有較好的線性關系，因此選擇3 min內測得的速度為反應初始速率。參照劉睿等[17]的研究方法，比較反應初速率，確定以酶量18 518.52 U、反應時間3 min進行酶反應動力學研究。

圖2 α-淀粉酶不同酶量的反應進程曲線

2.1.3 酶促反應動力學方程的建立 由圖3可知，擬合曲線方程為y=12.304x+5.474 8，R2=0.993 4，求得Vmax=0.183 mg/(mL·min)，Km=2.247 mg/mL。

2.1.4 底物、酶、L-茶氨酸添加順序確定 由圖4可知，添加順序為①、②、③的抑制率分別為18.6%，16.8%，20.6%，但3種添加順序的差異不顯著(P>0.05)，其中順序③的抑制率相對最高，比順序②的抑制率高出3.8%，因此選順序③作為酶促反應體系的添加順序，與劉雯等[20]建立的抑制劑添加順序一致。

2.2 最優(yōu)酶促反應條件下L-茶氨酸對α-淀粉酶的抑制效果

由圖5可知，L-茶氨酸對α-淀粉酶的抑制效果隨L-茶氨酸質量濃度的增大而增加；當L-茶氨酸質量濃度高于25 mg/mL時，抑制率的增長速度加快。當L-茶氨酸質量濃度到達45 mg/mL時，抑制率為97.9%。經計算，L-茶氨酸對α-淀粉酶的IC50為26.078 mg/mL。

圖3 α-淀粉酶的米氏方程曲線

圖4 不同添加順序對α-淀粉酶抑制作用的影響

圖5 不同質量濃度L-茶氨酸對α-淀粉酶的抑制效果

2.3 胰蛋白酶最適酶促反應條件篩選

2.3.1 酶質量濃度確定 由圖6可知，吸光值隨胰蛋白酶質量濃度的增加而增大且最終趨于平穩(wěn)，當酶質量濃度達到0.252 mg/mL時，吸光值已達最大值，說明胰蛋白酶與底物基本反應完全。因此選擇酶質量濃度0.252 mg/mL較為合適。

2.3.2 酶促反應時間確定 由圖7可知，酶促反應時間在0～15 min時，產物的含量隨時間的延長而增多。在反應15 min后，吸光值趨于穩(wěn)定，產物含量的增長速率變慢，說明胰蛋白酶與底物基本完全反應。因此，反應時間選擇15 min較為合適。

圖6 胰蛋白酶質量濃度對酶活性的影響

圖7 最佳反應時間的篩選

2.3.3 酶反應動力學方程的建立 由圖8可知，擬合曲線方程為y=49.783x+9.593 1，R2=0.994 0，求得Vmax=0.104 mg/(mL·min)，Km=5.189 mg/mL。

圖8 胰蛋白酶的米氏方程曲線

2.3.4 底物、酶、L-茶氨酸添加順序確定 由圖9可知，添加順序為①、②、③的抑制率分別為14.24%，13.57%，13.90%，抑制率結果與秦昱等[12]抑制劑添加順序結果一致，且3種添加順序的差異不顯著(P>0.05)，為了避免底物的干擾并降低試驗操作的難度，故選擇順序③作為酶促反應體系的添加順序。

2.4 最優(yōu)酶促反應條件下L-茶氨酸對胰蛋白酶的抑制效果

由圖10可知，在試驗設定的質量濃度范圍內，L-茶氨酸對胰蛋白酶活性的抑制呈量效關系，抑制效果隨質量濃度的增大而增加。經計算，L-茶氨酸對胰蛋白酶的IC50為196.299 mg/mL。

圖9 反應體系添加順序對胰蛋白酶抑制效果的影響

圖10 不同質量濃度L-茶氨酸對胰蛋白酶抑制作用

Figure 10 Inhibitory effect ofL-theanine at various concentrations on the activity of trypsin

3 結論

研究表明，L-茶氨酸對α-淀粉酶、胰蛋白酶均有一定的抑制作用，其半抑制濃度分別為26.078，196.299 mg/mL。α-淀粉酶在酶量為18 518.52 U、反應時間為3 min時得Km為2.247 mg/mL。胰蛋白酶在酶量為1 055 931 U，反應時間為3 min時得Km為5.189 mg/mL。本試驗對L-茶氨酸體外抑制這兩種酶的作用進行了初步研究，為進一步探討L-茶氨酸對α-淀粉酶、胰蛋白酶的抑制類型及其調節(jié)糖脂代謝的作用機制提供依據(jù)，為其功能產品的開發(fā)利用提供了參考。

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Inhibitory effects of L-theanine on α-amylase and trypsin

YUANDong-yin1

LONGJun2

GONGZhi-hua1

LINLing1

ZHOUYang1

PENGYing-qi1

XIAOWen-jun1,3

(1.KeyLaboratoryofTeaScienceofEducationalMinistration,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China; 2.QiliBridgeSubdistrictOffice,WillowLakeResort,ChangdeCity,Changde,Hunan415000,China; 3.HunanCollaborativeInnovationCenterforUtilizationofFunctionalIngredientsfromBotanicals,Changsha,Hunan410128,China)

The inhibitory effects ofL-theanine on the activities ofα-amylase and trypsin were studied by establishing the best reaction system and adopting research method on graph in order to provide reference for the deep development ofL-theanine. The results showed that the inhibitory effects ofL-theanine on both enzyme activities were positively associated with its concentration.IC50(26.078 mg/mL) ofL-theanine on the activities ofα-amylase was achieved by prewarming enzyme at a concentration of 0.018 mg/mL in the presence ofL-theanine at 37 ℃ for 5 min before addition of 1% starch and allowing reaction to proceed for 3 min.Kmofα-amylase was 2.247 mg/mL on the premise that the enzyme amount was 18 518.52 U.L-theanine exhibited the half inhibition on trypsin (196.299 mg/mL) by prewarming their mixture at 40 ℃ for 5 min followed by addition of 1% casein as the substrate and permitting the reaction for 15 min. When the amount of enzyme was 1 055 931 U,Kmof trypsin was 5.189 mg/mL. Statistics results showed that the inhibitory effect ofL-theanine on the activity ofα-amylase was superior than that of trypsin.

L-theanine;α-amylase; trypsin; inhibitory effect; glucose and lipid metabolism

湖南省科技廳重點研發(fā)計劃(編號：2016NK2102)

袁冬寅，女，湖南農業(yè)大學在讀碩士研究生。

肖文軍(1969—)，男，湖南農業(yè)大學教授，博導。 E-mail：xiaowenjun88@sina.com

2017—05—04

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.001