全脂牛乳粉中糖基化酪蛋白分析

孫靜麗

李林強

朱莉莉

唐 露

武 媛

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119)

全脂牛乳粉中糖基化酪蛋白分析

孫靜麗

李林強

朱莉莉

唐 露

武 媛

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119)

研究全脂牛乳粉中糖基化酪蛋白，探討其酶解特性。重點考察了不同pH、酸及提取方法對酪蛋白提取質量百分數的影響，并通過SDS-PAGE電泳分析酪蛋白，高碘酸—希夫堿染色法及莫氏試驗鑒定糖基化酪蛋白，木瓜蛋白酶水解酪蛋白，測定其氨基酸含量。結果表明，pH 4.6時提取酪蛋白的質量百分數顯著高于其他組(P<0.05)；質量百分數為2%的乙酸(pH 3.58)提取酪蛋白的質量百分數為(40.45±0.66)%，顯著高于其他組(P<0.05)；鞣酸提取酪蛋白的質量百分數為(46.13±0.46)%，顯著高于其他方法(P<0.05)；酪蛋白SDS-PAGE電泳結果表明，不同酸、不同方法提取的酪蛋白均有3條帶，其分子量均分別為34，24，60 ku；高碘酸—希夫堿染色結果表明，分子量為34，24 ku的酪蛋白是糖基化酪蛋白；莫氏試驗結果表明，乳粉酪蛋白中存在糖基化酪蛋白；酶解結果表明，乳粉酪蛋白經木瓜蛋白酶水解后游離氨基酸含量顯著高于鮮乳酪蛋白(P<0.05)。說明全脂牛乳粉中有糖基化酪蛋白，其分子量分別為34，24 ku，易于水解。

全脂牛乳粉；復原乳；酪蛋白；糖基化

糖蛋白是一類由糖和多肽或蛋白質以共價鍵連接而成的結合蛋白[1]，是生物體內重要的生物大分子之一，廣泛存在于細胞膜、細胞間質、血漿及黏液中，細胞內超過50%的蛋白質都以糖基化形式存在，包括許多酶、激素、血漿蛋白、抗體、轉鐵蛋白和受體等[2-3]。糖蛋白具有增強免疫調節、抑制腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、防衰老等作用[4]。這些固有糖蛋白的生理作用大多是有益的，比如牛乳中的轉鐵蛋白、乳鐵蛋白[5]、高度糖基化的α-1-酸性糖蛋白(AGP)[6]、免疫活性因子[7-8]等具有增強免疫力的作用。關于外源糖蛋白的致敏作用甚至有害的生理作用的報道[9-11]較多，結果表明飲用牛乳產生的過敏反應是由糖蛋白引起的。引起過敏的糖蛋白是牛乳中固有的，還是在加熱過程中產生的尚未見報道。

鮮乳經過熱處理后會發生不同程度羰氨反應，已經被眾多的研究所證實。生產乳粉時鮮乳經過巴氏殺菌、長時間較高溫度的真空濃縮及170 ℃左右的高溫噴霧干燥等熱處理過程，相比較液態乳的生產，乳粉加工的溫度更高、熱處理時間更長，這是否會導致羰氨反應程度更大、是否會影響酪蛋白的水解，相關的研究尚未見報道。因此，本研究主要分析全脂牛乳粉中糖基化酪蛋白是否存在及其水解特性，以期分析乳粉中糖蛋白的來源，豐富乳粉營養功能評價理論體系，并為乳粉生產過程中營養品質控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

全脂牛乳粉：新西蘭恒天公司；

蛋白Mark：18～94 ku，美國Thermo公司；

木瓜蛋白酶：≥800 U/mg，美國Bioreagent公司；

干酪素：北京奧博星生物技術有限責任公司；

雙歧桿菌：北京川秀科技有限公司；

三羥甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺、N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨、甘氨酸、甘油、溴酚藍、考馬斯亮藍G-250、冰乙酸、乙酸鈉、乳酸、鹽酸、磷酸、鞣酸、氯化鈉、乙酸鋅、氫氧化鈉、石油醚、高碘酸、三氯乙酸、堿性品紅、偏重亞硫酸鈉、活性炭、α-萘酚、濃硫酸、葡萄糖、茚三酮、無水乙醇：均為分析純。

1.1.2 主要儀器

臺式離心機：800B型，上海安亭科學儀器廠；

電泳系統：PowerPacTM Universal型，美國Bio-rad公司；

數控超聲波清洗器：KQ-250DB型，昆山市超聲儀器有限公司；

往復振蕩器：HY-2型，金壇市富華儀器有限公司；

可見分光光度計：722型，上海光譜儀器有限公司。

1.2 酪蛋白的提取

1.2.1 乙酸—乙酸鈉緩沖體系提取酪蛋白 奶粉與水以1∶7 (g/mL)的比例配制復原乳，依次取復原乳5 mL，分別加入不同pH(4.6，4.8，5.0，5.4，5.6，5.8)的乙酸—乙酸鈉緩沖溶液5 mL。200×g離心10 min，棄去脂肪層，傾出上層液體，按式(1)計算酪蛋白的質量百分數。

(1)

式中：

W——酪蛋白質量百分數，%；

m1——沉淀的酪蛋白質量，g；

m——樣液質量，g。

1.2.2 酪蛋白酸法提取 奶粉與水以1∶7 (g/mL)的比例配制復原乳，依次取5 mL乳樣，分別加入不同質量百分數(0.5%，1%，2%，3%，4%，5%)的乙酸、乳酸、鹽酸、磷酸，混勻后測定pH值，200×g離心10 min，棄去脂肪層，傾出上層液體，按1.2.1中式(1)計算酪蛋白的質量百分數。

1.2.3 不同方法提取酪蛋白 乳粉經索氏抽提法脫脂后配制復原乳。依次取復原乳5 mL，分別加入10 mL pH 4.6的乙酸—乙酸鈉緩沖溶液(鹽析法)、pH 4.6的鹽酸溶液(酸沉淀法)、0.1%鞣酸溶液(生物堿沉淀法)、無水乙醇(有機溶劑法)、5%乙酸鋅溶液(重金屬離子法)，將上述溶液用濾紙過濾，將過濾所得沉淀置于40 ℃烘箱中干燥至恒重，稱重，按1.2.1式(1)計算酪蛋白的質量百分數。

1.3 酪蛋白的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE凝膠電泳參考文獻[12～14]，稍作修改。取以上方法制備的酪蛋白沉淀物于40 ℃干燥至恒重，研磨成粉末，索氏抽提法脫脂，用蒸餾水洗滌3次，200×g離心5 min。取酪蛋白約2 mg溶于1 mL樣品緩沖液中，沸水浴處理10 min，冷卻至室溫，即為電泳樣品。向凝膠板間灌注10 mL 15%的分離膠，立即覆一層蒸餾水，凝固40 min后將上層蒸餾水傾去用濾紙吸干，灌注4 mL 3%濃縮膠，插入樣品梳子，凝固1 h后，將電極緩沖液倒入電泳槽，直至沒過短板，拔梳子，加樣10 μL，開始電泳。80 V恒壓 40 min，120 V恒壓2.5 h，停止電泳。考馬氏亮藍G-250染液振蕩染色約2 h，蒸餾水沖洗，然后加入脫色液至背景透亮、條帶清晰為止。

1.4 糖基化酪蛋白鑒定

1.4.1 高碘酸—希夫堿染色 取制備的酪蛋白樣液(乙酸、乙酸鋅、乳酸提取的酪蛋白)左右對稱加樣進行SDS-PAGE電泳，將膠從中間均勻地切成兩部分，左邊考馬氏藍染色，右邊對稱樣液進行高碘酸—希夫堿染色[15-17](簡稱糖染)。

高碘酸—希夫堿染色步驟：將凝膠置于10%三氯乙酸中固定1 h，蒸餾水漂洗2次(共0.5 h)，然后置于1%高碘酸水溶液氧化1 h，用水漂洗2次(共0.5 h)，再用Schiff試劑染色1 h(Schiff試劑配制：堿性品紅1 g溶于蒸餾水400 mL，加12 mol/L HCl 4.2 mL、偏重亞硫酸鈉3.2 g，4 ℃攪勻過夜，加活性炭2 g，振蕩1 min過濾)，最后用脫色液(0.5%偏重亞硫酸鈉及7%乙酸水溶液按體積1∶1混合)脫色，4 ℃過夜，若是糖蛋白則呈紅色譜帶。

1.4.2 莫氏試驗 參考文獻[18]，修改如下：取2支編號試管，分別加入1 mL的1%葡萄糖溶液、1%的乳粉酪蛋白溶液(溶于0.1%的NaCl溶液中)，然后加入莫氏試劑(5%的α-萘酚溶液，溶于95%的乙醇，現配現用)2滴，搖勻。將試管傾斜，沿管壁慢慢加入濃硫酸1.5 mL。硫酸層沉淀于試管底部與糖溶液分成2層，觀察液面交界處有無紫紅色環出現。

1.5 糖基化酪蛋白水解及氨基酸含量測定

1.5.1 糖基化酪蛋白水解 取pH 4.6乙酸—乙酸鈉緩沖液提取的乳粉酪蛋白和鮮乳酪蛋白，均配制為0.1%的樣品液(溶于0.1% NaCl溶液中)，各取樣品溶液10 mL，均加入1 mL的0.1%木瓜蛋白酶液(溶于0.1%的NaCl溶液，現配現用)，置于37 ℃水浴中酶解6 h。

1.5.2 氨基酸含量測定 采用茚三酮比色法[19-20]。取系列標準溶液(0.0，1.0，2.0，5.0，10，15，20 μg/mL)各1.0 mL于7支25 mL試管中，均加入2 mL pH 5.5乙酸—乙酸鈉緩沖液，搖勻，再加2%茚三酮溶液(2 g溶于100 mL無水乙醇中，現配現用)2 mL。置沸水浴15 min，冷卻至室溫，于570 nm波長處測定吸光值，得回歸方程(y=0.031 9x+0.002 5，R2=0.999 5)。將酶解后的樣品用上述同種方法測定蛋白溶液的吸光值，計算其氨基酸含量。

1.6 數據處理

所有試驗均平行重復3次，試驗數據均運用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，結果以“平均值±標準偏差”表示，采用LSD法5%水平檢驗組間差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 乙酸—乙酸鈉緩沖體系提取酪蛋白

乙酸—乙酸鈉溶液在pH為4.6時，酪蛋白提取質量百分數為(28.38±2.49)%，顯著高于其他組(P<0.05)，與文獻[21-22]中酪蛋白等電點pH 4.6一致。乙酸—乙酸鈉緩沖體系為鹽溶液，是否會導致部分酪蛋白溶解，影響酪蛋白提取質量百分數，還需進一步分析。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 酪蛋白酸法提取條件的篩選

由圖2～5可知，乙酸添加量為2%時，酪蛋白質量百分數為(40.45±0.66)%，顯著高于其他組(P<0.05)；乳酸添加量2%時，酪蛋白質量百分數為(39.31±2.76)%，顯著高于其他組(P<0.05)；鹽酸添加量3%時，酪蛋白質量百分數為(37.44±1.04)%，顯著高于其他組(P<0.05)；磷酸添加量4%時，酪蛋白質量百分數為(31.74±4.20)%，顯著高于其他組(P<0.05)。綜上結果表明，不同的酸提取酪蛋白時，酪蛋白質量百分數由大到小依次為乙酸>乳酸>鹽酸>磷酸。

不同酸的添加量對pH值的改變程度的影響由大到小依次為鹽酸>乳酸>磷酸>乙酸，乙酸添加量對pH的影響較為緩慢，易于接近等電點，酪蛋白沉淀較多，所以提取率最高。文獻[23]等電點法提取蛋白質也有類似的結果，且乙酸作為食用酸，更利于在食品工業中的應用。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Figure 2 Influence of acetic acid different additions on extraction rate of protein and pH value of solution

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Figure 3 Influence of lactic acid different additions on extraction rate of protein and pH value of solution

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Figure 4 Influence of hdrochloric acid different additions on extraction rate of protein and pH value of solution

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Figure 5 Influence of phosphate acid different additions on extraction rate of protein and pH value of solution

2.3 不同方法對酪蛋白提取率的影響

由圖6可知，鞣酸提取的酪蛋白質量百分數為(46.13±0.36)%，顯著高于其他組(P<0.05)，乙酸鋅提取的酪蛋白質量百分數顯著高于無水乙醇、乙酸—乙酸鈉和鹽酸組(P<0.05)[這3組對酪蛋白的提取質量百分數無顯著性差異(P>0.05)]。結果表明，鞣酸是提取酪蛋白的一種理想生物堿試劑。文獻[24～25]研究結果也表明鞣酸生物堿沉淀法比等電點法、鹽析法提取蛋白質的純度高，提取率也高。鞣酸作為一種活性物質，具有抗氧化、抗衰老，預防心血管疾病等功效，而且具有凝乳的作用，但對其在乳中的應用尚需進一步研究確認。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4 酪蛋白的SDS-PAGE電泳結果

由圖7可知，不同酸提取的酪蛋白均有3條帶，與標準蛋白Mark條帶比對，其分子質量分別為24，34，60 ku，與文獻[26～28]對酪蛋白分子量的分析結果一致。不同酸提取的酪蛋白條帶之間位置基本相同，表明不同酸處理對復原乳酪蛋白分子大小影響不大。由圖8可知，不同方法提取的酪蛋白均有3條帶，與標準蛋白Mark條帶比對，其分子質量分別為24，34，60 ku，且不同方法提取的酪蛋白條帶位置基本相同，表明不同方法處理對復原乳酪蛋白分子大小影響不大。

2.5 酪蛋白高碘酸—希夫堿染色結果

酪蛋白SDS-PAGE考馬氏亮藍染色和高碘酸—希夫堿染色結果見圖9?？捡R氏亮藍染色有3條帶(圖9 a)，其分子量分別為24，34，60 ku。高碘酸—希夫堿染色有2條帶(圖9 b)，其分子量分別為24，34 ku，結果表明，二者為糖基化的酪蛋白。結合圖9 a條帶分析結果，分子量60 ku的酪蛋白非糖基化酪蛋白，文獻[29～32]也有相同的研究結果。

1～4. 依次為乙酸、乳酸、鹽酸、磷酸提取的酪蛋白

1～5. 依次乙酸-乙酸鈉、無水乙醇、鞣酸、鹽酸、乙酸鋅提取的酪蛋白

Figure 8 Analysis of SDS-PAGE on casein from reconstitu-ted milk treated by different extraction methods

a. 考馬氏亮藍G-250染色 b. 高碘酸—希夫堿染色 1～3. 依次為乙酸、乙酸鋅、乳酸提取的酪蛋白

Figure 9 Analysis of SDS-PAGE on casein from reconstitu-ted milk treated by different dyeing methods

2.6 莫氏試驗糖基化酪蛋白鑒定結果

糖基化酪蛋白莫氏試驗結果見圖10。葡萄糖標準溶液莫氏試驗有很明顯的紫色環，乳粉提取的酪蛋白莫氏試驗也呈現明顯的紫色環。結果表明，乳粉提取的酪蛋白中有糖基化酪蛋白，與2.5電泳的糖染結果一致，進一步證明乳粉中存在一定量的糖基化酪蛋白。

圖10 酪蛋白莫氏試驗

2.7 酪蛋白酶解結果

酪蛋白酶解結果表明，乳粉提取的酪蛋白水解后氨基酸(茚三酮反應顏色呈深紫色)含量顯著高于鮮乳水解后的(P<0.05)。結合酪蛋白SDS-PAGE高碘酸—希夫堿染色結果和莫氏試驗鑒定結果表明，乳粉提取的酪蛋白中有糖基化酪蛋白，易于水解，表明這2種糖基化酪蛋白可能不是致敏因子。文獻[33～36]報道牛乳中的乳鐵蛋白或免疫活性因子可能是過敏因子，且為牛乳本身所固有，特別是在初乳中含量較高[37-38]，相比較本文的研究結果，表明糖蛋白是否易于水解可能是其是否具有致敏性的重要原因之一，因此白乳粉的各類產品中加入對致敏性糖蛋白專一性的水解酶，可能是降低或消除其致敏性的一條有效途徑。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 結論

糖蛋白具有致敏作用，牛乳經過熱處理后，是否會使蛋白糖基化，難于水解，加重牛乳蛋白的致敏作用，值得探究。本試驗分析了全脂牛乳粉中糖基化酪蛋白，結果表明全脂牛乳粉中有3種酪蛋白，經過鑒定其中2種為糖基化酪蛋白，其分子量較小，分別為34，24 ku。蛋白酶水解試驗表明全脂牛乳粉中糖基化的酪蛋白相比鮮牛乳中酪蛋白更易于水解，至于為什么小分子酪蛋白糖基化后更易于水解，是否是由于蛋白結構的變化更易于酶的作用，尚需進一步研究。

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Analysis of glycosylated casein in whole milk powder

SUNJing-li

LILin-qiang

ZHULi-li

TANGLu

WUYuan

(CollegeofFoodEngineeringandNutritionalScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi'an,Shaanxi710119,China)

This study investigated glycosylated casein in whole milk powder and explored its enzymatic property. The casein extraction weight percentage were determined by different pH, different acids, and different methods. The casein was analyzed by SDS-PAGE electrophoresis, and the glycosylated casein were identified via the method of periodate-schiff alkali dyeing and the experiment of morse. The casein was hydrolyzed by papain and the amino acid content was determined accordingly. Results: The percentage of casein extracted under pH 4.6 was significantly higher than that of other groups (P<0.05). The weight percentage of casein extracted from acetic acid (pH 3.58) was (40.45±0.66)%, which was significantly higher than that of other groups (P<0.05). The percentage (46.13±0.46)% of casein extracted by tannic acid was significantly higher than that of other methods (P<0.05). The results of casein SDS-PAGE electrophoresis both showed the same 3 bands either different acids or different methods on casein extraction, and their molecular weights were 34, 24, and 60 ku, respectively, and the 34 and 24 ku were glycosylated casein by the method of periodate-schiff alkali dyeing. The results of morse experiment showed that milk powder casein exist glycosylated casein. The content of free amino acid from whole milk powder was significantly higher than that from fresh milk after papain hydrolysis (P<0.05). Whole milk powder has glycosylated casein, their molecular weights are 34 and 24 ku respectively, which are easy to hydrolysis.

whole milk powder; reconstituted milk; casein; glycosylation

陜西省農業科技創新與攻關項目(編號：2016NY-212)

孫靜麗，女，陜西師范大學在讀碩士研究生。

李林強(1971—)，男，陜西師范大學副教授，博士。 E-mail: lilinq@snnu.edu.cn

2017—03—15

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.002