牛骨膠原蛋白酶解工藝優化及結構特性分析

劉麗莉

李 丹

楊陳柳

孟圓圓

代曉凝

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023)

牛骨膠原蛋白酶解工藝優化及結構特性分析

劉麗莉

李 丹

楊陳柳

孟圓圓

代曉凝

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023)

牛骨；膠原蛋白；酶解；結構特性

近年來，隨著人們對肉制品需求的增加，其副產物——動物骨骼的加工利用受到研究學者的廣泛關注。動物骨骼中含有如蛋白質、氨基酸、礦物質、軟骨素、骨膠等具有保健作用的功能物質[1]，其所含的蛋白質中，膠原蛋白占到90%以上，能夠促進人體皮下組織的代謝功能，還可以延緩衰老[2]。但膠原蛋白具有特殊的三股螺旋結構，難以被人體消化吸收。而膠原蛋白肽是膠原的三股螺旋結構中分子鏈被斷開形成的小分子蛋白，是一類具有較強的水溶性、蛋白含量高且黏度較低、極易被人體吸收的產物，具有抗氧化、降血壓、降血脂的功能特性[3-5]。

目前多數研究學者將微生物與骨膠原相結合進行發酵降解，如張宇等[6]的研究表明采用紅曲菌與米曲菌復合發酵豬骨能夠較好地降解骨膠原；彭慧莉[7]采用乳酸菌發酵豬骨泥，有效提升了其利用價值。有學者研究發現，與微生物發酵法相比，酶解法降解骨骼時間短，效率高，更適合應用到實際生產，如蔡麗華等[8]將堿性蛋白酶作用到牛骨來制備降壓肽；趙妍嫣等[9]采用胰蛋白酶作用于骨膠原，結果表明與膠原蛋白相比，酶解后的蛋白肽有更好的乳化性和溶解性；Zhang Yuhao等[10]將牛骨膠原通過6種常規蛋白酶處理與未處理的進行對比發現，處理后的產物膠原蛋白肽可以降低血壓。但這些研究所采用的蛋白酶對骨骼的降解程度仍未達到較佳的工業利用價值。本課題組前期曾純化出了具有特異性降解牛骨膠原蛋白的膠原蛋白酶(Bone-specific collagenase，BSC)，較其他蛋白酶其對牛骨膠原蛋白有更好的降解效果。本研究擬對膠原蛋白酶酶解牛骨膠原蛋白的工藝進行優化，并進行結構特性分析，為今后的工業化生產提供理論依據。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

新鮮牛骨頭：購買于河南省洛陽市大張購物中心；

溴化鉀、乙醇、3-甲氧基-4’-N，N-二甲氨基黃酮、甲醛：分析純，天津市德恩化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機：H1650型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；

pH計：PHS-3C型，上海精科有限公司；

熒光分光光度計：RF-5301PC型，日本島津有限公司；

紫外可見分光光度計：UV2600型，日本島津有限公司；

FT-IR紅外光譜儀：Perten DA7200型，德國Bruker公司；

掃描電鏡：JSM-IT500型，日本Jeol有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛骨膠原蛋白的制備 將新鮮采購的牛骨骼除去表面牛肉纖維，在高溫高壓下蒸煮20 min后將其分成顆粒，采用乙醚回流脫脂(40 ℃)，0.48%鹽酸脫鈣，骨粒徑為5 mm×10 mm，提取膠原的介質為1%檸檬酸和1%胃蛋白酶復合液。經真空冷凍干燥獲得牛骨I型膠原蛋白[11]。

1.3.2 BSC酶的制備流程

(1) 菌種發酵培養基：蔗糖1 g/100 mL，胰蛋白胨2 g/100 mL，氯化鈣 0.05 g/100 mL，磷酸二氫鈉 0.05 g/100 mL，磷酸氫二鉀 0.25 g/100 mL，pH值6.6～6.8。

(2) 將活化好的B.cereusMBL13-U菌株在35 ℃，160 r/min 的條件下連續發酵46 h，收集發酵液12 000 r/min，4 ℃ 離心25 min，收集上清液即為BSC酶的粗酶液，將其依次通過硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析、Sephadex G-100凝膠層析，最終得到分子量為52 kDa 的BSC酶。

1.3.3 BSC酶解牛骨膠原蛋白的酶解工藝 向牛骨膠原蛋白中加入適量的BSC酶，調節pH值，置于恒溫培養搖床中進行酶解反應，反應結束后90 ℃滅酶15 min，12 000 r/min離心15 min，將上清液干燥后得到膠原蛋白肽。

酶解液中水解度的測定：采用甲醛滴定法[12]。

1.3.4 BSC酶解牛骨膠原蛋白的工藝優化

(1) 單因素試驗：主要選取影響酶解反應的5個因素[13]，反應溫度(35，40，45，50，55，65 ℃)、牛骨膠原蛋白添加量(1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5 g/100 mL)、BSC酶添加量(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 g/100 mL)、反應時間(1，2，3，4，5，6，7，8，9 h)、pH值(4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0)。固定酶解參數為：反應溫度 35 ℃、牛骨膠原蛋白添加量 3.5 g/100 mL、BSC酶添加量 0.4 g/100 mL、反應時間 5 h、pH值 7.0，分別改變其中一因素，進行單因素試驗，研究其對水解度的影響，得出最佳反應參數。

(2) 響應曲面優化試驗：在單因素試驗基礎上，采用五元二次正交旋轉試驗組合設計，以反應溫度、牛骨膠原蛋白添加量、BSC酶添加量、反應時間、pH值為考察因素，以水解度為響應值(Y)，得出酶解最適工藝參數組合。

1.3.5 牛骨膠原蛋白及膠原蛋白肽的結構特性

(1) 紫外光譜分析：將酶解0，2，4，6 h的膠原蛋白肽液在紫外-可見光分光光度計上進行全波長掃描，波長范圍為215 ～250 nm。

(2) 熒光光譜分析：將3-甲氧基-4′-N，N-二甲氨基黃酮溶于乙醇中作為熒光探針，分別加入酶解0，2，4，6 h的膠原蛋白肽液中，設置激發波長380 nm，發射波長465 nm[14]，分別將其放入熒光分光光度計中進行掃描。

(3) 紅外光譜分析：分別將牛骨膠原蛋白和膠原蛋白肽與適量的溴化鉀充分混合后壓片制樣，將其放入FT-IR紅外光譜儀中在400～4 000 cm-1波長下進行掃描[15]。

(4) 掃描電鏡分析：分別將酶解0，2，4，6 h后的牛骨膠原蛋白真空冷凍干燥后進行噴金處理，再將樣品放入掃描電鏡下觀察表面結構的變化。

1.3.6 數據處理 采用Origin 8.5、Design Expert 8.0軟件對本試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

不同酶解條件對水解度的影響見圖1。

由圖1(a)可知，水解度隨反應溫度的增加先升高后急速下降，在45 ℃時最大。這是因為隨著溫度的上升，膠原蛋白的三股螺旋結構逐漸展開，BSC酶的催化活性增強，但過高的溫度會逐漸破壞BSC酶的分子結構，活性降低，直到失活，同時也會改變產物的形成方向，導致水解度直線下降。因此，選取最佳反應溫度為45 ℃。

由圖1(b)可知，隨著牛骨膠原蛋白添加量的逐漸增加，溶質流動性較好，使牛骨膠原蛋白與BSC酶充分結合，水解度逐漸上升，當牛骨膠原蛋白添加量達到4.5 g/100 mL時水解度最高，但隨其添加量的繼續增加，溶液黏度增大，阻礙了反應進行，水解度降低。因此，選取最佳牛骨膠原蛋白添加量為4.5 g/100 mL。

由圖1(c)可知，水解度的變化隨著BSC酶添加量的增加先升高后緩慢降低，當BSC酶添加量為0.3 g/100 mL時水解度最大，認為在牛骨膠原蛋白含量一定時，BSC酶添加量的增加會加大兩者結合程度，使水解度不斷上升，但過多BSC酶的加入使牛骨膠原蛋白相對不足，導致反應進程減弱，水解度下降[16]。因此，選取最佳BSC酶添加量為0.3 g/100 mL。

由圖1(d)可知，隨反應時間的增加，BSC酶與牛骨膠原蛋白的結合作用不斷加大，在6 h時兩者充分作用，水解度最大，若反應時間繼續延長，牛骨膠原蛋白濃度逐漸降低，BSC酶催化位點不斷減少，水解度下降[17]。因此，選取最佳反應時間為6 h。

由圖1(e)可知，隨pH值的升高，水解度也逐漸加大，在pH 7.0時達到最大，但pH值進一步升高水解度快速降低，原因是pH值對BSC酶活性的相關基團影響較大，環境過酸或過堿都會破壞其分子構象，活性降低，同時還會影響牛骨膠原蛋白與BSC酶在反應中的解離狀態，抑制反應的進行。因此，選取最佳pH值為7.0。

2.2 響應曲面優化試驗結果分析

在2.1得到最佳單因素條件(見表1)基礎上，采用五元二次正交旋轉組合試驗設計對酶解工藝進行優化，設計方案及結果和方差分析見表2、3。

圖1 酶解條件對水解度的影響

水平X1反應溫度/℃X2牛骨膠原蛋白添加量/(10-2g·mL-1)X3BSC酶添加量/(10-2g·mL-1)X4反應時間/hX5pH值-2351.50.22.05.0-1403.00.33.56.00454.50.45.07.01506.00.56.58.02557.50.68.09.0

表2五元二次正交旋轉組合試驗設計方案及結果

Table 2 Quadratic orthogonal rotary composite experimen-tal design (in coded level of five variables)and experimental result (n=3)

試驗號X1X2X3X4X5Y水解度/%11111125.592111-1-124.93311-11-129.23411-1-1118.3651-111-124.0261-11-1116.7171-1-11122.6181-1-1-1-120.369-1111-128.6110-111-1129.2311-11-11122.6212-11-1-1-120.2813-1-111123.7614-1-11-1-117.9115-1-1-11-121.2816-1-1-1-1117.2517-2000021.68182000024.49190-200018.75200200024.052100-20017.67220020023.5623000-2023.03240002026.99250000-225.56260000223.28270000032.65280000032.51290000030.08300000033.57310000028.33320000028.86330000029.74340000033.68350000032.19360000031.15

采用Design Expert 8.0對優化結果進行多元回歸擬合，得出回歸方程為：

(1)

表3 方差分析表

表3結果表明，擬合的二次回歸方程極顯著，失擬項P值不顯著(P=0.367 1>0.05)，決定系數R2為93.07%，模型擬合度較高，證明所建立的模型有效可用。由F值高低得五因素對水解度的影響依次為：牛骨膠原蛋白添加量、反應時間、BSC酶添加量、pH值、反應溫度。

本試驗構建的模型在α=0.05顯著水平下剔除不顯著水平后的方程為：

(2)

2.3 構建模型的等高線與響應面分析

由圖2可知，在最佳值的范圍外響應面比較陡峭，表明當其他3因素為定值時，水解度對BSC酶添加量和反應溫度的變化敏感，兩者等高線圖為橢圓狀，表明BSC酶添加量和反應溫度有較為明顯的交互作用[18]。從等高線圖分析表明，當固定牛骨膠原蛋白添加量5.14 g/100 mL、反應時間6.06 h、pH 6.57時，BSC酶添加量在0.35～0.50 g/100 mL，反應溫度在40.6～49.2 ℃時，兩者交互作用最明顯，水解度達到30%。

圖3中反應溫度和pH值的響應面圖顯示，在最佳值的范圍外響應面陡峭，表明當其他3因素不變時，pH值和反應溫度的變化對水解度影響較大，等高線圖呈明顯橢圓狀反映出兩者有較為明顯的交互作用。等高線圖分析表明，當牛骨膠原蛋白添加量5.14 g/100 mL、反應時間6.06 h、BSC酶添加量0.42 g/100 mL時，反應溫度在44.0～47.6 ℃，pH在6.3～7.1時交互作用達到最大，水解度在31%以上。

圖3 反應溫度和pH值對水解度影響的響應面和等高線圖

2.4 BSC酶解牛骨膠原蛋白的工藝優化及驗證

經五元二次正交旋轉試驗及響應面優化法，采用Design Expert 8.0軟件和回歸方程分析可得BSC酶解牛骨膠原蛋白的最佳工藝為：反應溫度46 ℃、牛骨膠原蛋白添加量5.14 g/100 mL、BSC酶添加量0.42 g/100 mL、反應時間6 h、pH值為6.5，對此條件進行驗證實驗，重復6次，得到水解度為34.98%，與預測值相差1.15%，誤差較小，此條件下試驗可行。

2.5 紫外光譜分析

圖4為不同酶解時間下膠原蛋白肽的紫外光譜掃描圖。

由圖4可知，I、II、Ⅲ、Ⅳ均在220～230 nm內出現膠原蛋白及膠原蛋白肽的特征吸收，并且特征吸收峰隨著酶解時間的延長發生紅移，說明膠原蛋白肽中生色基團的分布有所改變，牛骨膠原蛋白在BSC酶作用下三股螺旋結構逐漸打開，分子表面C═O、CONH2、COOH等具有紫外吸收的生色基團逐步增多[19]，導致紫外吸光度逐漸增大。

Ⅰ～Ⅳ酶解時間分別為0，2，4，6 h

2.6 熒光光譜分析

圖5為不同酶解時間下膠原蛋白肽的熒光光譜掃描圖。

Ⅰ～Ⅳ酶解時間分別為0，2，4，6 h

2.7 紅外光譜分析

圖6為牛骨膠原蛋白和降解物膠原蛋白肽的紅外光譜圖。

圖6 牛骨膠原蛋白和膠原蛋白肽的紅外光譜分析

由圖6可知，牛骨膠原蛋白和膠原蛋白肽分別在3 312.35，3 267.96 cm-1處呈現明顯的吸收峰，這是由N—H伸縮振動引起的，是蛋白的特征吸收，經BSC酶降解作用，牛骨膠原蛋白的吸收峰發生紅移，是酶解后的膠原蛋白肽中N—H伸縮振動與氫鍵形成了締合體[20]所導致的。膠原蛋白肽在2 922.63 cm-1出現強吸收峰，是—CONH—的特征吸收峰，表明酶解產物為膠原多肽。1 360～1 200 cm-1為酰胺Ⅲ帶，二者在此波數范圍內均出現特征吸收，為C—H伸縮振動和N—H彎曲振動所產生的，但是膠原蛋白肽具有較強的吸收峰，表明在BSC酶作用下牛骨膠原蛋白的肽鏈發生斷裂，酶解后的膠原蛋白肽二級結構居多，由圖6(b)可知，經過酶解的膠原蛋白肽在1 275.75 cm-1處出現強吸收峰，是β-轉角伸縮振動引起的，表明膠原蛋白肽結構中以β-轉角為主，可能是酶解過程中有較多的游離脯氨酸，其分子中的環狀結構和平面角對β-轉角的形成具有催化作用。

2.8 掃描電鏡分析

圖7為不同酶解時間下牛骨膠原蛋白的掃描電鏡圖。

圖7 不同酶解時間下牛骨膠原蛋白的掃描電鏡圖

由圖7可知，BSC酶對牛骨膠原蛋白的表面結構影響較大，其中圖7(a)中牛骨膠原蛋白的表面結構為細絲狀，但圖7(b)、(c)、(d)顯示牛骨膠原蛋白的表面結構隨著酶解時間的延長而逐漸被剝離，這是由于BSC酶將牛骨膠原蛋白中的I型膠原蛋白降解為小分子多肽，破壞了其完整的表面結構，使牛骨膠原蛋白中所含的大分子物質I型膠原蛋白越來越多地暴露在表面，加快了BSC酶的作用，水解越來越顯著，導致緊密結合的細絲狀表面結構變得更加疏松。

3 結論

(1) 本試驗將前期分離純化得到的BSC酶作用于牛骨膠原蛋白，以水解度為指標，在單因素試驗基礎上，采用五元二次正交旋轉試驗和響應面優化法得出酶解的最佳工藝參數為反應溫度46 ℃、牛骨膠原蛋白添加量5.14 g/100 mL、BSC酶添加量0.42 g/100 mL、反應時間6 h、pH 6.5，在此條件下進行驗證實驗，得到水解度為34.98%。

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Optimization of Enzymatic hydrolysis process and analysis of structural properties on bovine bone crude collagen

LIULi-li

LIDan

YANGChen-liu

MENGYuan-yuan

DAIXiao-ning

(CollegeofFoodandBioengineering,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan471023,China)

novel collagenase; bovine bone collagen; enzymatic hydrolysis; optimization; structural properties

國家自然科學基金(編號：31401622)；公益性行業(農業)科研專項(編號：201303084)；河南省重點攻關項目(編號：152102110080)；河南省教育廳自然科學研究項目(編號：13A550255)；河南省重大專項(編號：161100110900)

劉麗莉(1974—)，女，河南科技大學副教授，博士。 E-mail：yangliuyilang@126.com

2017—04—11

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.009