相同加工原料下六大茶類抑菌效果比較

彭影琦

龍 軍2

林 玲1

龔志華1

袁冬寅1

周 陽1

肖文軍1,3

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；2. 常德市柳葉湖旅游度假區(qū)七里橋街道辦事處，湖南 常德 415000；3. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖南 長沙 410128)

相同加工原料下六大茶類抑菌效果比較

彭影琦1

龍 軍2

林 玲1

龔志華1

袁冬寅1

周 陽1

肖文軍1,3

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；2. 常德市柳葉湖旅游度假區(qū)七里橋街道辦事處，湖南 常德 415000；3. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖南 長沙 410128)

為探討相同加工原料下六大茶類的抑菌效果，以春季碧香早的1芽2葉茶鮮葉為原料，將其固定及分別加工成綠、黃、黑、白、青、紅六大茶類，采用牛津杯法比較研究7個(gè)樣品對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)3種細(xì)菌以及黑曲霉(Aspergillusniger)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)2種真菌的抑菌活性，并利用96孔細(xì)胞板及二倍稀釋法檢測7個(gè)樣品的最低抑菌濃度(MIC)與最低殺菌濃度(MBC)。結(jié)果表明：7個(gè)樣品對3種細(xì)菌均有抑制作用，對2種真菌的抑制效果不明顯；7個(gè)樣品對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈大小均呈現(xiàn)出固定樣>綠茶>黃茶>黑茶>青茶>白茶>紅茶的特性，最低抑菌濃度呈現(xiàn)出紅茶>青茶、白茶>黑茶、黃茶、固定樣、綠茶的特性，最低殺菌濃度均呈現(xiàn)出紅茶>青茶、白茶、黑茶、黃茶>固定樣、綠茶的特性；綠茶和其他茶類之間、紅茶和其他茶類之間的抑菌效果有顯著性差異(P<0.05)。

茶葉；抑菌活性；六大茶類；最低抑菌濃度；最低殺菌濃度

按照初制加工工藝、品質(zhì)特征及加工過程中兒茶素氧化程度等，中國茶葉分為綠、黃、黑、白、青、紅茶六大類[1]。茶葉內(nèi)含茶多酚、茶多糖、茶色素、茶氨酸等多種活性物質(zhì)，具有良好的輔助抗腫瘤、抗氧化、改善心血管疾病、免疫調(diào)節(jié)、抑菌等功能[2]。任蕾等[3]研究表明茶葉對口腔致病菌有良好抑制作用；傅冬和[4]研究不同年份茯茶的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)貯藏年份越久抑菌效果越差；薛晨[5]分析了不同級別原料下普洱茶的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)抑制結(jié)果與茶多酚、水浸出物含量呈負(fù)相關(guān)；據(jù)報(bào)道，茶葉中的次生代謝物質(zhì)在體外表現(xiàn)出良好的抑菌效果。王靜等[6]研究發(fā)現(xiàn)沒食子兒茶素沒食子酸酯及其氧化產(chǎn)物對細(xì)菌抑制效果良好，對黑曲霉、酵母菌的抑制效果不明顯；張華艷等[7]報(bào)道了咖啡堿對茶樹感染的真菌具有一定抑制作用；金恩慧等[8]報(bào)道了茶黃素具有抑菌廣譜性。由于茶鮮葉原料級別、加工工藝、生產(chǎn)季節(jié)、生產(chǎn)管理技術(shù)等不同，造成茶產(chǎn)品中品質(zhì)成分含量存在差異[5,9-10]，進(jìn)而導(dǎo)致其抑菌效果存在差異，但從已有文獻(xiàn)來看，多從不同的細(xì)菌種類、茶葉年份、茶類來判斷茶葉抑菌差異，鮮見相同加工原料下六大茶類的抑菌效果比較研究。為此，本研究用相同的原料分別加工成綠、黃、黑、白、青、紅六大茶類，排除品種、季節(jié)、嫩度等因素，比較研究經(jīng)不同加工工藝后茶葉對革蘭氏陽性細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)、革蘭氏陰性細(xì)菌(大腸桿菌)及2種真菌(黑曲霉、啤酒酵母)的抑制作用，以期為茶葉新產(chǎn)品開發(fā)及健康消費(fèi)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鮮茶葉：碧香早，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)長安教學(xué)基地；

細(xì)菌培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基、酵母菌使用馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、霉菌使用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：國藥集團(tuán)化學(xué)試驗(yàn)有限公司；

瓊脂粉、酵母提取物、氯化鈉、胰蛋白胨、葡萄糖、蔗糖：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

福林酚：分析純，美國Tedia公司；

乙腈、甲醇：色譜純，美國Tedia公司；

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate，GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)、表兒茶素(epecatechin，EC)、沒食子兒茶素(gallocatechin，GC)和表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、咖啡堿(caffeine，CA)：標(biāo)準(zhǔn)品，峰面積歸一化法下純度>98%，上海同田生物技術(shù)有限公司；

大腸桿菌 ATCC 25922(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌ATCC 25923 (Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌ATCC6633(Bacillussubtilis)、啤酒酵母CICC31105(Saccharomycescerevisiae)、黑曲霉CICC2039(Aspergillusniger)：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物教研室提供。

1.1.2 儀器設(shè)備

烘焙機(jī)：6CHP-941型，浙江上洋機(jī)械股份有限公司；

茶葉揉捻機(jī)：40型，浙江上洋機(jī)械股份有限公司；

超凈工作臺(tái)：VD-650型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-250BS-11型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

恒溫培養(yǎng)振蕩器：ZHWY-C2101型，上海智城分析儀器制造有限公司；

高壓滅菌鍋：LMQ.J3870C型，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：SY-2000型，上海亞榮生化儀器廠；

游標(biāo)卡尺：0～200 mm，上海量具刃具廠；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 茶樣制備 采摘春季碧香早品種1芽2葉茶鮮葉，分別進(jìn)行固樣與茶樣加工。每種茶樣平行制作3份。

(1) 固定樣：采用蒸汽固樣法[11]。

(2) 綠茶：采用“殺青(250 ℃)→揉捻(25 min)→烘二青(120 ℃)→炒三青(90 ℃)→足干(60 ℃)”工序[12]50。

(3) 黃茶：采用“殺青(250 ℃)→趁熱悶黃→揉捻(25 min)→初烘(120 ℃)→足干(60 ℃)”工序[12]186-187。

(4) 黑茶：采用“殺青(250 ℃)→初揉(25 min)→渥堆(33 h)→復(fù)揉(25 min)→足干(60 ℃)”工序[12]116。

(5) 白茶：采用“萎凋(48 h)→干燥(45 ℃)”工序[12]204-207。

(6) 青茶(烏龍茶)：采用閩南烏龍茶加工的工藝，即“曬青(20 min)→做青(搖青—涼青，5次)→殺青(250 ℃)→初烘(120 ℃)→揉捻(30 min)→復(fù)烘(80 ℃)→足干(70 ℃)”工序[12]171-175。

(7) 紅茶：采用工夫紅茶加工的工藝，即“萎凋(5 h)→揉捻(40 min)→發(fā)酵(30 ℃，3 h)→足干(85 ℃)”工序[12]89-100。

1.2.2 生化成分檢測

(1) 水分含量：按GB/T 8304—2013執(zhí)行。

(2) 水浸出物含量：按GB/T 8305—2013執(zhí)行。

(3) 茶多酚含量：按GB/T 8304—2013執(zhí)行。

(4) 兒茶素組分含量、咖啡堿含量：參照文獻(xiàn)[13]。

(5) 可溶性碳水化合物：采用蒽酮比色法[14]。

1.2.3 茶湯提取 參照GB/T 8303—2002的方法提取，取3 g茶用450 mL沸水在100 ℃水浴鍋中浸提45 min，期間每隔10 min揺一次，過濾、洗滌殘?jiān)罄鋮s，濾液于500 mL容量瓶定容至刻度線。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將茶湯真空濃縮(55 ℃，真空度0.9 MPa)至25 mL，茶湯濃度為120 mg/mL。在無菌環(huán)境下利用除菌過濾器過濾。

1.2.4 菌種活化與菌懸液制備 將菌株接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中恒溫?fù)u床培養(yǎng)，活化菌株。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，黑曲霉、啤酒酵母于28 ℃培養(yǎng)44～48 h。將活化好的菌株在固體培養(yǎng)基上分離得到單個(gè)菌株。重復(fù)一次，得到的菌株于4 ℃冰箱保存。挑取單菌株于液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，參照上述不同菌類的培養(yǎng)時(shí)間，制成菌懸液，并調(diào)整到濃度1×107CFU/mL左右。

1.2.5 不同茶類抑菌效果比較 根據(jù)文獻(xiàn)[8]的方法，在培養(yǎng)皿上均勻涂布0.1 mL的菌懸液，待干燥后，于每個(gè)培養(yǎng)皿上放置3個(gè)滅菌牛津杯，各注入0.1 mL濃度為60 mg/mL的無菌茶湯。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，酵母菌、黑曲霉于28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)后測定抑菌圈大小，抑菌圈試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑>20 mm為極敏；15～20 mm為高敏；10～15 mm為中敏；7～9 mm為低敏；<7 mm為不敏感。以無菌水、慶大霉素對照，重復(fù)3次。

1.2.6 不同茶類最低抑菌濃度(MIC)比較 根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法，利用96孔細(xì)胞板測最低抑菌濃度。96孔細(xì)胞板為8列12行，每列為一類茶湯。每孔中都加100 μL的液體培養(yǎng)基，1～7列中第1行和第2行中加入濃度為120 mg/mL的茶湯100 μL。在第2行中取混勻的100 μL液體于第3行中，余下第3行至第5行依次重復(fù)。第11行的溶液吸出100 μL棄用。在2～12行中加入制好的菌懸液0.1 mL，并混勻。第1～12行，茶湯濃度為分別為60，30，15，……0.117，0.059 0 mg/mL。放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)24 h，酵母菌和黑曲霉28 ℃培養(yǎng)48 h。經(jīng)過培養(yǎng)后，直接觀察，沒有抑菌效果的茶湯顯渾濁或有菌沉淀。澄清的茶湯的最小濃度是對該菌的最低抑菌濃度，重復(fù)3次。

1.2.7 不同茶樣最低殺菌濃度(MBC)比較 根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法，將1.2.6步驟中96孔板上判斷為最低抑菌濃度的孔和它以上3個(gè)濃度的液體100 μL涂布到固體培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌37 ℃培養(yǎng)24 h，霉菌、啤酒酵母28 ℃培養(yǎng)48 h。觀察培養(yǎng)皿，菌株數(shù)小于5個(gè)的培養(yǎng)皿的濃度為最低殺菌濃度，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，顯著性差異、相關(guān)性分析使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茶樣抑菌效果比較

由表1可知，六大茶類茶樣對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌3種細(xì)菌具有較好的抑制作用，而對黑曲霉、啤酒酵母的抑制不明顯。與王靜等[6]研究結(jié)果相符。慶大霉素對3種細(xì)菌的抑制效果最強(qiáng)。在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的范圍內(nèi)(P<0.05)，六大茶類對金黃色葡萄球菌的抑制效果表現(xiàn)為：綠茶>黃茶、黑茶、白茶、青茶>紅茶；對枯草芽孢桿菌的抑制效果表現(xiàn)為：綠茶>黃茶、黑茶、青茶>白茶>紅茶；對大腸桿菌的抑制效果表現(xiàn)為：綠茶>黃茶>黑茶、白茶、青茶>紅茶。說明相同原料，不同的加工工藝下的茶葉對細(xì)菌的抑制有顯著差異，綠茶與其他茶類、紅茶與其他茶類的抑菌效果差異顯著(P<0.05)。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性細(xì)菌，大腸桿菌為革蘭氏陰性細(xì)菌，說明六大茶類及固定樣對細(xì)菌的抑制有廣譜性，且對革蘭氏陽性細(xì)菌的抑制強(qiáng)于革蘭氏陰性細(xì)菌。

表1 不同茶樣抑菌圈直徑比較?

? 不同小寫字母表示各試樣間存在顯著性差異(P<0.05)。-表示抑菌效果不明顯。

六大茶類抑菌效果存在差異，可能是盡管7個(gè)樣品的茶鮮葉原料相同，但因加工工藝不同而使內(nèi)含成分發(fā)生變化；也可能是革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性細(xì)菌在細(xì)胞壁組分及結(jié)構(gòu)上的差異等，使得茶葉對革蘭氏陽性細(xì)菌抑制效果較革蘭氏陰性細(xì)菌的好。根據(jù)楊聯(lián)松等[17]對茶多酚抑制真菌的研究結(jié)果，10 mg/mL茶多酚對啤酒酵母有抑制效果、對黑曲霉抑制不明顯，100 mg/mL茶多酚對黑曲霉有抑制效果。本研究的7個(gè)樣品對2種真菌的抑制效果不明顯，可能與茶湯濃度有關(guān)。

2.2 不同茶樣最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)的比較

由表2可知，綠茶對細(xì)菌的抑制和殺滅濃度對比其他茶類，濃度最低,紅茶濃度最高，青茶介于兩者中間。綠茶對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC和MBC分別為0.94，1.88，7.50 mg/mL；紅茶在濃度分別為7.5，15，30 mg/mL時(shí)有抑制作用，濃度分別為30，7.5，30 mg/mL時(shí)有殺滅作用。六大茶類對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC呈現(xiàn)出：紅茶>青茶、白茶>黑茶、黃茶、綠茶、固樣的趨勢；對枯草芽孢桿菌的MIC呈現(xiàn)出：紅茶>青茶、白茶>黑茶>黃茶、綠茶、固樣的趨勢。對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MBC呈現(xiàn)出：紅茶>青茶、白茶、黑茶、黃茶>綠茶、固樣的趨勢；對枯草芽孢桿菌的MBC呈現(xiàn)出：紅茶>青茶、白茶、黑茶>黃茶>綠茶、固樣的趨勢。3種細(xì)菌MIC、MBC呈現(xiàn)的趨勢，符合六大茶類茶多酚含量和兒茶素總量的順序變化，說明茶多酚、兒茶素組分與對細(xì)菌抑制有一定的相關(guān)性。

表2 不同茶樣最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)比較

2.3 茶葉中的部分生化成分和抑菌效果的相關(guān)性

經(jīng)檢測，固樣、綠茶、黃茶、黑茶、青茶、白茶、紅茶水分含量分別為4.63%，3.57%，3.37%，5.49%，3.78%，3.94%。由表3、4可知，相同的原料經(jīng)過不同的工藝加工后，生化成分發(fā)生變化。其中綠茶茶多酚含量是紅茶的2.78倍。兒茶素的變化和茶多酚變化趨勢基本一致，但總量差異較大，綠茶含量最高，是含量最低的紅茶的17.18倍。可溶性碳水化合物含量黃茶含量最高，是含量最低的紅茶的1.94倍。咖啡堿含量紅茶最高，是含量最低的黑茶的1.26倍。由表5可知，茶多酚、EGCG、GCG、ECG、兒茶素總量、可溶性碳水化合物、水浸出物等物質(zhì)占干茶的百分比，與對3種細(xì)菌抑菌效果顯著相關(guān)(P<0.01)；咖啡堿含量與抑菌效果呈負(fù)相關(guān)。

研究[18]表明，茶多酚可通過破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)層及細(xì)胞壁、與蛋白質(zhì)及離子發(fā)生絡(luò)合、降低細(xì)菌對磷的消耗等方式抑制細(xì)菌。而EGCG可通過增加細(xì)菌內(nèi)源性氧化應(yīng)激抑制細(xì)菌生長[19]。多種植物多糖被證實(shí)有抑菌作用[20-21]，多糖和多酚相互作用還可以增強(qiáng)多酚的抑菌效果。這些物質(zhì)的抑菌作用都和濃度有關(guān)，可能是形成樣品含量高低與抑菌效果好壞呈高度相關(guān)的原因。咖啡堿雖然也表現(xiàn)出一定的抑菌作用[7]，但其含量在各樣品中差異不大，在茶湯成分中對抑菌效果的影響不顯著，說明茶葉抑菌效果和其主體物質(zhì)茶多酚有關(guān)。

表3 不同茶樣主要化學(xué)成分

表4 不同茶樣的兒茶素及組分含量

表5 主要生化成分與抑菌圈直徑的相關(guān)性?

? * 表示在 0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；**表示在 0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)證明了相同原料不同加工工藝的茶葉對細(xì)菌的抑制有顯著差異，綠茶與其他茶類、紅茶與其他茶類的抑菌效果差異顯著(P<0.01)。經(jīng)分析，本研究中的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑大小與樣品所含茶多酚含量、兒茶素總量、EGCG含量、可溶性糖含量高度相關(guān)，但由于茶湯組成成分復(fù)雜，活性物質(zhì)多，對這些物質(zhì)的定性定量分析及其與茶葉抑菌作用的量效關(guān)系，尚有待進(jìn)一步探索。

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Comparison on anti-microbial activities of six kinds of teas processed by the same raw materials

PENGYing-qi1

LONGJun2

LINLing1

GONGZhi-hua1

YUANDong-yin1

ZHOUYang1

XIAOWen-jun1,3

(1.KeyLabofTeaScienceofMinistryofEducation,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China; 2.Qi-liBridgeStreetOfficeofLiu-yeLakeTouristResort,Changde,Hunan415000,China; 3.HunanCollaborativeInnovationCenterforUtilizationofBotanicalFunctionalIngredients,Changsha,Hunan410128,China)

In order to study the anti-microbial effect of the six kinds of tea under the same processing raw materials, the spring tea fresh leaves of C.sinensis cv.Bixiangzao were processed into fixation of fresh leaves, green, yellow, dark, white, oolong, and black tea. The anti-microbial activity againstStaphylococcusaureus(S.aureus),Escherichiacoli(B.subtilis),Escherichiacoli(E.coli),Aspergillusniger,(A.niger),Saccharomycescerevisiae(S.cerevisiae) of 7 samples were determinded by the Oxford cup method. The Minimum inhibitory concentration (MIC) and Minimum bactericidal concentration (MBC) of 7 samples were determined by the method of two times dilution using the microplate of the 96 hole. Experimental results showed that 7 samples had inhibition effect of bacteria and had no obvious effect ofA.nigerandS.cerevisiae. The antibacterial circle size of 7 samples ofS.aureus,B.subtilis, andE.colishowed that the trend of antimicrobial activity was: fixation of fresh leaves>green>yellow>dark>white>oolong>black tea. The MIC showed that the trend of antimicrobial concentration was: black tea>oolong, white tea>dark, yellow, green tea, fixation of leaves. The MBC showed that the trend of antimicrobial concentration was: black tea>oolong, white, dark, yellow tea>green tea, fixation of leaves. The antimicrobial activity of green tea and black tea was significantly different from other teas (P<0.05).

tea; anti-microbial activities; six kind of teas; minimum inhibitory concentration; minimum bactericidal concentration

湖南省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(編號(hào)：2016NK2102)

彭影琦，女，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

肖文軍(1969—)，男，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博導(dǎo)。 E-mail：xiaowenjun88@sina.com

2017—05—02

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.010